Klinička Biokemija - Propisi

Klinika biokemija Propisi
1
R U T I N S K I P R E G L E D M O K R A E

Za ispitivanje se uzima prva jutarnja, svjea mokraa uzeta nakon nonog sna,
toalete vanjskog spolovila, prije doruka i drugih aktivnosti, koja se zadravala u
mokranom mjehuru najmanje 4 sata a najvie 8 sati. Uzima se u spremnike sa
irokim grlom i poklopcem koji slue za sakupljanje i prijenos uzoraka. Ako je uzorak
pohranjen na 20C mora se obraditi unutar 30 minuta. Pohrana na +4C dozvoljava
obradu unutar 4 sata.

U svakodnevnom radu , rutinski pregled mokrae sastoji se od:
fizikalnih mjerenja
i z g l e d
b o j a
m i r i s
s p e c i f i n a t e i n a
r e a k c i j a - pH
v o l u m e n

kemijskog ispitivanja sastava mokrae testnom trakom
p r o t e i n a
k r v n o g p i g m e n t a
g l u k o z e i r e d u k t i v n i h t v a r i
k e t o n s k i h s p o j e v a
u r o b i l i n o g e n a
b i l i r u b i n a
n i t r i t a

mikroskopskog pregleda supravitalno obojenog ili nativnog
m o k r a n o g s e d i m e n t a

U sluaju pozitivnih nalaza neki sastojci se odreuju kvantitativno:
p r o t e i n i (pirogalol, biuret)
g l u k o z a (enzimski)

Rezultati rutinskog pregleda upotpunjuju se specifinim pretragama:
i z g l e d (mikroorganizmi)
b o j a (homogentizinska kiselina, melanogen, porfirini, lijekovi)
m i r i s (amonijak, sumporovodik)
p r o t e i n i (paraproteini, elektroforeza proteina)
k r v n i p i g m e n t (lijekovi)
r e d u k t i v n i s p o j e v i (laktoza, galaktoza, pentoze, melanogen,
kromatografija eera, homogentizinska kiselina, lijekovi)
k e t o n s k i s p o j e v i (melanogen, lijekovi)
b i l i r u b i n (une kiseline)
u r o b i l i n o g e n (urobilin)
s e d i m e n t (aminokiseline, mikroorganizmi, lijekovi)
2

IZGLED, BOJA I MIRIS

Svjea mokraa je bistra, ukasto smee boje, bez neugodnog mirisa.

SPECIFINA TEINA MOKRAE (relativna volumna masa)

Specifina teina mokrae odreuje se pomou areometra, urometra, koji je
graduiran za podruje od 1.000 do 1.060 i temperaturu od 15C. Mokraa se ulijeva
u prikladni cilindar, pjena ukloni filter papirom i urometar uroni da slobodno pliva.
Oita se brojka na donjem rubu meniskusa.
Ako temperatura mokrae nije 15C, potrebno je korigirati izmjerenu
specifinu teinu.
Za 3C ispod 15C treba oitanom rezultatu oduzeti 0.001, a za svaka 3C iznad
15C treba dodati 0.00l.
Korekcije su potrebne i u sluajevima kada su u mokrai prisutni glukoza ili proteini.
Za 1 g % proteina oduzima se 0.003, a za 1 g % (55 mmol/L) glukoze oduzima se
0.004.

Primjer:
Oitana specifina teina ispitivane mokrae je 1.020, temperatura mokrae je 21C
i odreeno je 3 % glukoze.
Za 6C iznad 15C treba dodati 0.002, a za 3 g % glukoze treba oduzeti 0.012, pa
korigirana specifina teina iznosi 1.010.
Mokraa zdravih osoba ima u veini sluajeva specifinu teinu od 1.015 do 1.025, a
krajnje granice su izmeu 1.002 i 1.035.

REAKCIJA (pH) MOKRAE

Reakcija mokrae zdravih osoba kree se od 4.8 do 7.4; a najee je slabo
kisela (oko 6.0).

Razni proizvoai proizvode trake impregnirane s indikatorom. Pomou ovih
test traka moe se vrlo jednostavno i priblino odrediti pH mokrae. Traka s
indikatorom uroni se u mokrau a nastala boja usporedi sa priloenom skalom.
Reagens papir polja za odreivanje pH na traci sadrava smjesu metilnog crvenila i
bromtimol plavila. Tako se u podruju od pH 5-9 dobivaju razliite boje od
naranaste-zelene-plave. Stajanjem mokraa postaje alkalna stoga pH vrijednost
odstajale mokrae nema dijagnostiku vrijednost. Rezultat na traci se oitava
odmah. Sumnja na infekciju mokranih organa postavlja se ako je pH mokrae
stalno od 7 do 8.

3
VOLUMEN MOKRAE

Pri rutinskom pregledu obino se ne mjeri volumen. Ako se mokraa koristi
za ispitivanje izluivanja pojedinih sastojaka tijekom 24 sata, tada se i jutarnjem
uzorku mjeri volumen.
Referentne vrijednosti 24-satnog volumena mokrae:

Odrasli 800 do 2.000 ml
Djeca oko 10 g 700 do 1.500 ml
Djeca oko 5 g 500 do 1.000 ml
Djeca oko 1 g 300 do 600 ml
Dojenad s 6 mj 250 do 500 ml
Dojenad oko 1 mj 150 do 400 ml

Volumen mokrae ovisi o koliini primljene vode i hrane, intenzitetu
metabolikih procesa, fizikoj aktivnosti i vodi, koja se izluuje znojenjem, fecesom i
dahom. Odrasli ovjek izlui tokom 24 sata 800 do 1500 ml a krajnje granice se
kreu izmeu 500 do 2000 ml.
Kod izvjesnih patolokih stanja izluuju se poveane koliine mokrae. P o l i
u r i j a je popratna pojava loe lijeene eerne bolesti, kada se izluuje 3 do 4 L
mokrae dnevno. Znatno vee koliine izluuju osobe s nedostatkom antidiuretskog
hormona (diabetes insipidus). Izluivanje manje koliine mokrae, o l i g u r i j a, a
posebno prestanak izluivanja, a n u r i j a, su popratne pojave oteenja i
funkcionalnog zastajenja bubrega.

K E M I J S K E P R E T R A G E M O K R A E

Kemijskim pretragama se dokazuje i ispituje da li mokraa sadri sastojke
kojih u mokrai zdravih osoba nema ili su prisutne u tako malim koliinama i
koncentracijama, da ih se ne moe dokazati uobiajenim reakcijama. Tako se
ispituje prisutnost proteina, krvnog pigmenta, eera, ketonskih spojeva, bilirubina,
nitrata. Za neke spojeve, kojih ima i u mokrai zdravih osoba (urobilinogen), ispituje
se da li ih ima vie ili manje nego normalno.
Kemijske pretrage se vre pomou testnih traka i rijetko klasinim kemijskim
postupcima u epruveti. Klasini postupci trae vlastitu pripravu manjih ili veih
koliina reagensa uz veliki utroak radnog vremena za vaganje, otapanje, filtriranje i
odravanje stalnosti reakcijskih otopina. Pri tom se troi mnogo kemikalija, vrlo
mnogo laboratorijskog posua i pribora.
Na ishod reakcije s testnim trakama utjeu razni faktori. Najvie neprilika
moe izazvati vlaga, a manje svjetlo i toplina. Zbog toga treba trake uvati u dobro
zatvorenim posudama na suhom i od svjetla zatienom mjestu.
Testne trake raznih proizvoaa izraene su u obliku uskih traka od celuloze i
prozirne plastike. Na plastinom nosau veliine 8 x 0.5 cm nalazi se jedna ili vie
kvadratia od celuloznog materijala, koji su impregnirani odgovarajuim reagensima.
4
Reagensi na testnim trakama obino su isti ili kemijski vrlo slini onima, koji
su se koristili u klasinim reakcijama u epruveti. Ipak, neki od njih su znatno
osjetljiviji i mnogo specifiniji. Pretrage se izvode uranjanjem trake u ispitivani
uzorak mokrae i nakon odreenog vremena (10, 20, 30 ili 60 sekunda) promatra
se, da li je dolo do promjene boje. Intenzitet te boje usporeuje s priloenom
skalom (vizualno oitavanje) ili .se rezultat oitava instrumentalno prema naelu
refleksne fotometrije.
Testne trake za pretragu mokrae omoguuju jednostavnim postupkom brzo i
pouzdano dobivanje podataka o patolokom nalazu u mokrai.
Zbog toga je rutinska pretraga mokrae testnim trakama u ambulanti i u
bolnici prvi korak na putu postavljanja dijagnoze, koja e se kasnije potvrditi
detaljnim klinikim pregledom i sloenijim kvantitativnim laboratorijskim pretragama.
Testne trake su vrlo pogodne i za sistematske preglede, za rano otkrivanje bolesti te
za epidemioloke studije.
Polja na testnoj traci sastoje se od reagens papira koji se nalazi iznad papira
za upijanje. Tanka najlonska mreica napeta je preko ta dva sloja i tako privruje
test polja na bijelu foliju; ujedno ih zatiuje od dodira i oneienja, a uz to
osigurava brzo i ravnomjerno prodiranje mokrae ime se postie homogena
obojenost polja. Sloj za upijanje uklanja suvinu mokrau i time spreava lane
rezultate. Test polje veliine 6 x 6 mm omoguuje lako i tono oitavanje rezultata jer
su na njemu vidljive i najmanje promjene boje (Slika 3.2)

Slika 1. Graa testne trake

Pretraga mokrae testnom trakama vrlo je jednostavna (Slika 2)
1. uranjanje u mokrau
2. odstranjivanje suvinog mokrae
3. oitavanje nakon 30 do 60 sekundi
5
Slika 2. Pretraga mokrae testnom trakom

Suvina mokrae se jednostavno otrese. Upotreba enzima i drugih novih
metoda temelj je specifinog dokazivanja patolokih promjena mokrae.
Vaan kriterij u procjeni testnih traka za mokrau je stupanj osjetljivosti reakcije. Pod
tim se razumijeva ona koncentracija traene tvari kod koje je u najmanje 90 od 100
razliitih uzoraka nalaz pozitivan.
Granica je osjetljivosti pojedinih testova praktiki takva da i vrlo male promjene u
sastavu mokrae izazivaju promjenu boje.
Testne trake su u aluminijskoj tubi zatvorenoj specijalnim epom u kome je sredstvo
za upijanje vlage iz zraka. Uz propisano uvanje (od +4
o
C do 30
o
C) i pravilnu
upotrebu (nakon vaenja trake tubu treba odmah zatvoriti) rok je valjanosti testnih
traka pouzdan do datuma otisnutog na pakovanju.
Testne trake za mokrau mogu se upotrijebiti za:
rutinske pretrage
kontrola za vrijeme terapije i kontrolu zbog mogunosti recidiva
samokontrolu
sistematske preglede

Za dnevne rutinske preglede mokrae u bolnici, ambulantnoj praksi ili uz
krevet bolesnika najracionalnije je odreivanje kompletnog kemijskog statusa
mokrae pomou univerzalne testne trake koja obuhvaa slijedee parametre:

nitrite pH glukozu ketonska tijela
urobilinogen proteine bilirubin krv leukociti

Jednom testnom trakom mogue je otkriti rane simptome triju velikih grupa bolesti:
poremeaje metabolizma ugljikohidrata
bolesti bubrega i urogenitalnog trakta
hemolitike bolesti i bolesti jetre.
Za kontrolu tokom terapije prikladne su specijalne test trake za odreenu
indikaciju. U mokrai dijabetiara valja izvriti pretrage na glukozu i ketonska tijela.
Tim se testom mogu otkriti promjene u stanju metabolizma ili pogreke u dijeti. U
mokrai bolesnika s bolesti bubrega i urogenitalnog trakta znaajne su pretrage
6
mokrae na nitrite, pH, proteine i krv. Dokazivanje unih boja, urobilinogena i
bilirubina, u mokrai omoguuje ciljani pregled u bolesti jetre.
Specijalne testne trake upotrebljavaju se za
opi pregled (prosijavanje) u sistematskim pregledima
za ope i ciljani pregled u epidemiolokim istraivanjima
rano otkrivanje odreenih patolokih stanja
za vrijeme odreivanja individualne doze antidijabetika
za kontrolu terapije

Tablica 1. Mogue jedinice oznaene na spremnicima testnih traka

Parametar Konvencionalne
jedinice
SI Arbitrarne jedinice

glukoza

mg/dl

mmol/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

bilirubin

mg/dl

mol/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

ketonski spojevi

mg/dl

mmol/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

eritrociti/hemoglobin

Erc/L

Erc x 10
6
/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

proteini

mg/dl

g/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

urobilinogen

mg/dl

mmol/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

nitriti

neg/poz

neg/poz

neg/poz

leukocitna esteraza

Lkc/L

Lkc x 10
6
/L
neg/0
1/+
2/++
3/+++
4/++++

7
DOKAZIVANJE PROTEINA U MOKRAI

a) Dokazivanje s indikatorskom testnom trakom

Reagens papir polja za odreivanje proteina sadri smjesu pufera i indikatora
(3,3,5,5-tetraklorfenol-3,4,5,6-tetrabrom-sulfoftalein) koji uz stalni pH mokrae
mijenja boju u prisutnosti proteina od ute-svjetlozelene-zelene. Posebno je osjetljiv
na albumine dok nije naroito osjetljiv na ostale proteine (globulini, Bence-Jones
protein).

P o s t u p a k
Traka se uroni u svjeu mokrau i promjena boje odmah usporedi s
priloenom skalom na kutiji.
Lano pozitivni rezultat javlja se u jako alkalnoj mokrai (pH oko 9), ako su
prisutne kvarterne amonijeve soli (dezinficijensi), te niz lijekova i njihovih metabolita
(kinina, kinidini, fenazopiridini, trimetoprim).
Uvjerljivu obojenost test trake daju ve koncentracije od 6 mg/100 ml
albumina u mokrai. Test za proteine je jednako osjetljiv kao test kuhanjem s
acetatnim puferom.
Izvori pogreaka su infuzije polivinil pirolidona ili ostaci dezinfekcijskih
sredstava koji sadre kvarterne amonij baze ili klorheksidin te uzimanje lijekova.
Granica osjetljivosti metode: 0.02 - 0.46 g/L

b) Dokazivanje sa sulfosalicilnom kiselinom

eto se koristi reakcija sa 20%-tnom sulfosalicilnom kiselinom, koja raskida
hidratacijski omota oko proteinskih molekula, oslobaa polarne skupine i kemijski
se za njih vee. U reakciji se povezuju ogoljele molekule u aglomerate, koji se
zapaaju kao zamuenje ili talog. Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo
osjetljiva i njen pozitivni ishod se mora potvrditi i drugim reakcijama.

R e a g e n c i j e
Sulfosalicilna kiseliina, 0.80 mol/L (200 g/L)

P o s t u p a k
U epruvetu se ulije oko 5 ml bistre slabo kisele mokrae i dokapa najvie 10
kapi sulfosalicilne kiseline. Ako su u mokrai prisutni proteini u mjerljivim koliinama
(iznad 100 mg/L), svaka kap reagensa izazvat e oblai zamuenja ili ak stvaranje
taloga.
Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo osjetljiva, pa se djelomino
pozitivni rezultat, opalescencija, dobiva uz fizioloku koncentraciju proteina u mokrai
(oko 20 mg/L). Zbog toga je negativni rezultat reakcije sa sulfosalicilnom kiselinom
siguran podatak da u ispitivanoj mokrai nema proteina. Ako je rezultat reakcije
pozitivan, treba ga provjeriti drugim reakcijama.
8
Lano pozitivni rezultat pri dokazivanju proteina sa sulfosalicilnom kiselinom
mogu izazvati velike koliine mokrane kiseline, metaboliti organskih kontrastnih
sredstava za rendgensko snimanje, tolbutamid, neki sulfonamidi.

c) Dokazivanje kuhanjem

esto se izvodi reakcija kuhanja. Poveanjem temperature dolazi do raskidanja
hidratacijskog omotaa, proteinske molekule se denaturiraju i povezuju u
aglomerate, to se zamjeuje kao zamuenje. Ova reakcija se mora provoditi u
kiseloj sredini (pH oko 5), jer se u alkalnom mediju taloe tercijarni fosfati i
karbonati.

R e a g e n c i j e
Octena kiselina, 0.83 mol/L (50 g/L)

P o s t u p a k
U epruvetu se ulije 10 do 15 ml bistre mokrae i gornji dio tekuine zagrije do
vrenja direktnim plamenom. Ako ima proteina, zamutit e se zagrijani dio tekuine i
jasno e se uoiti razlika izmeu zamuenog vrueg i bistrog hladnog sloja. Mokraa
mora biti slabo kisela (pH oko 5), jer se iz alkalne mokrae izluuju uz grijanje
tercijarni fosfati i karbonati kalcija i magnezija. Ako je prilikom ispitivanja dolo do
zamuenja, oprezno se kapne 1 do 2 kapi octene kiseline i pri tom se fosfati i
karbonati otope, a istovremeno pojaa mute istaloenih proteina.

DOKAZIVANJE ERITROCITA I HEMOGLOBINA U MOKRAI

Dokazivanje eritrocita najsigurnije se vri pregledom sedimenta svjee, slabo
kisele mokrae. Stajanjem dolazi do morfolokih promjena. Eritrociti se mogu
smeurati i skupiti u hipertoninoj ili nabubriti i lizirati u hipotoninoj mokrai.
Kemijske reakcije za dokazivanje hemoglobina temelje se na njegovom
pseudoperoksidaznom djelovanju, jer hemoglobin posjeduje svojstvo oksidacije
kromogenih spojeva (aromatskih amina i polifenola) u prisutnosti vodik peroksida.
Za kemijski nain dokazivanja hemoglobina potrebno je mokrau prethodno
promijeati, da se eritrociti ravnomjerno raspodjele i zatim prokuhati radi inaktiviranja
pravih peroksidaza iz eventualno prisutnih leukoocita.

a) Dokazivanje pomou testne trake

Test se temelji na pseudoperoksidativnom djelovanju hemoglobina odnosno
mioglobina, koji kataliziraju oksidaciju indikatora s organskim peroksidom (2,5-
dimetiheksan-2,5-dihidroperoksid) u plavo-zeleni kromogen koji na utom polju
izaziva sve prijelaze ute boje prema zelenom. Dodatkom aktivatora poveana je
osjetljivost reakcije. Intaktni eritrociti se hemoliziraju a osloboeni hemoglobin
uzrokuje nastajanje boje oko eritrocita stvarajui uoljive zelene toke.

9
P o s t u p a k
Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 30 sekundi usporeuje
promjena boje s priloenom skalom.
Osjetljivost reakcije je 5 eritrocita/Lmokrae. Osjetljivost reakcije se protee
gotovo do normalnog podruja (0-3 eritrocita/L). Ako je prisutno dosta eritrocita,
polje na traci moe jednolino poprimiti zelenu boju kao u sluaju hemoglobinurije pa
je pretragu potrebno ponoviti nakon razrijeivanja mokrae.
Reakcija je specifina za hemoglobin i mioglobin.
Lano pozitivnu reakciju uvjetuje prisustvo jakih oksidansa koji neposredno oksidiraju
aromatski amin, dok lano negativni rezultat moe izazvati vea koliina askorbinske
kiseline.

b) Reakcija s aminopirinom

N a e l o
Hemoglobin uz pomo vodik peroksida oksidira aminopirin na ljubiasto
obojeni spoj (rubazonska kiselina).

R e a g e n c i j e
1. Octena kiselina, glacijalna
2. Aminopirin u 96%-tnom etanolu, 60 g/L
3. 10%-tna otopina vodik peroksida

P o s t u p a k
3 ml mokrae zakiseli se s 2 do 3 kapi koncentrirane octene kiseline, prokuha
i ohladi, a zatim nadsloji s 3 ml otopine aminopirina. Dokapanjem nekoliko kapi
svjee pripravljene l0%-tne otopine vodik peroksida stvara se ljubiasto crveni prsten
u dodirnoj zoni, ako je prisutan krvni pigment.
Peroksidaze iz leukocita mogu uzrokovati lano pozitivnu reakciju.

DOKAZIVANJE EERA U MOKRAI

a) Dokazivanje testnom trakom

N a e l o
Dio testne trake impregniran je puferiranom smjesom glukoza oksidaze,
peroksidaze i aromatskog amina (tolidin, ABTS-diamonijeva sol 2,2-azino-di/3-etil-
benzotiazolin/sulfonska kiselina). Katalitikim djelovanjem glukoza oksidaze
pregrauje se glukoza u glukonolakton uz stvaranje vodik peroksida, koji s
peroksidazom prevodi aromatski amin u obojeni oksidirani produkt.

P o s t u p a k
10
Slabu ali zamjetljivu promjenu boje (svijetlo zeleno) izaziva 0.7 mmol glukoze/L
mokrae.
Lano pozitivni rezultat izazivaju oksidansi (hipoklorit, klor, jod), koji mogu direktno
oksidirati aromatski amin. Enzimsko odreivanje glukoze u mokrai ometa
askorbinska kiselina.

DOKAZIVANJE KETONSKIH SPOJEVA U MOKRAI


N a e l o
Dio trake impregniran je s natrij nitroprusidom i puferom. Acetoctena kiselina i
aceton reagiraju s natrij nitroprusidom i glicinom u alkalnom mediju dajui ljubiasto
obojeni spoj. -hidroksimaslana kiselina ne reagira.

P o s t u p a k
promjena boje s priloenom skalom. Granica osjetljivosti testne trake je 0.15-1.0
mmol/L acetoctene kiseline odnosno 7-12 mmol/L acetona u mokrai.
Pozitivni rezultat za ketonske spojeve s test trakama i tabletama daju isti lijekovi kao
i kod kemijskih reakcija.

DOKAZIVANJE BILIRUBINA U MOKRAI


Dio trake impregniran je mjeavinom pufera i stabilne diazonij soli (2,6-diklor-
benzoldiazonijumfluoroborat) koja s bilirubinom u kiselom stvara crvenoljubiastu
azo-boju.

P o s t u p a k
promjena boje sa priloenom skalom. Granica osjetljivosti je 3.5 -14 mol
bilirubina/L. Lano pozitivni rezultat daju lijekovi koji su crveno obojeni u kiselom
mediju (fenazopiridini).
Lano negativni rezultat daju nitriti i askorbinska kiselina.
Dokazivanje bilirubina mora se vriti u svjeoj mokrai jer stajanjem na zraku
bilirubin oksidira.

DOKAZIVANJE UROBILINOGENA U MOKRAI

a) Ispitivanje s testnom trakom

11
Dio trake impregniran je s stabilnom diazonijevom soli (p-
metoksibenzendiazonijum fluoroborat) koja s urobilinogenom daje u kiselom crvenu
azoboju.

P o s t u p a k
promjena boje sa priloenom skalom.
Granica osjetljivosti je oko 1.7 - 17mol/L.
Reakcija je specifina za urobilinogen. Ne reagiraju ostale diazo pozitivne
tvari kao u reakciji po Ehrlichu (indikan, porfobilinogen sulfonamidi i druge).
Lano pozitivni rezultat daju razni lijekovi i metaboliti (fenazopiridin, neki sulfonamidi,
aminosalicilna kiselina, antipirin, BSP).

DOKAZIVANJE NITRITA U MOKRAI

a) Dokazivanje s testnom trakom

N a e l o
U kiseloj otopini sulfanilna kiselina i nitriti nastali djelovanjem bakterija
stvaraju diazobenzen-sulfonsku kiselinu, koja reagira s alfa-naftilaminom stvarajui
crveno obojeni azo-spoj.

P o s t u p a k
Traka se uroni u sasvim svjeu mokrau i nakon 30 sekundi usporeuje
Granica osjetljivosti trake je 3 - 17 mol/L nitrita u mokrai.
Lano pozitivni rezultat daju biljne boje (cikla) ili lijekovi (piridazol).

PRETRAGA MOKRANOG SEDIMENTA

Jednostavni rutinski pregled mokrae zavrava vanim mikroskopskim
pregledom sedimenta. Ova pretraga je naroito vrijedna u sluajevima, kada su u
mokrai dokazani proteini ili hemoglobin, jer se prema sastavu sedimenta mogu
donijeti zakljuci o mjestu i vrsti oboljenja mokranih organa. Iz svake, pa i
najbistrije, mokrae taloi se stajanjem neto sedimenta. Normalno se sediment
mokrae sastoji od razliitih teko topivih tvari, staninih elemenata, i raznih
primjesa. Sastojci sedimenta dijele se na dvije skupine, na organizirani i
neorganizirani dio sedimenta.
N e o r g a n i z i r a n i dio sedimenta ine kristali teko topivih spojeva,
ponajee mokrane kiseline, kalcijevog oksalata, raznih fosfata, amorfni urati i
fosfati, te rijee kristali teko topivih aminokiselina, prirodnih spojeva, te lijekova i
njihovih metabolita.
12
O r g a n i z i r a n i dio sedimenta sainjavaju eritrociti, leukociti, epitelne
stanice, mikroorganizmi, paraziti i njihova jajaca, spermiji i dijagnostiki neobino
vani cilindri. Ponekad se nailazi na sluajne primjese (dlaice, vlakanca, kapljice
masti, zrnca kroba i dr.).
Za pregled sedimenta preporuuje se uzeti svjea jutarnja, najkoncentriranija
mokraa. Mokraa mora biti slabo kisela (pH nii od 6), a specifina teina vea od
1.010.
5-12 ml promijeane mokrae ulije se u centrifugirku i centrifugira 5 minuta uz
manji broj okretaja (400 x g) (do 1500 u minuti), da se ne unite krhki elementi.
Bistra mokraa iznad taloga se najveim dijelom odlije, a uz sediment ostaje 20-ti dio
poetnog volumena mokrae (npr. ukupni volumen mokrae 10 mL - volumen
sedimentamokrae 0.5 mL) (bistra mokraa slui za ispitivanje prisutnosti proteina).
Danas je preporuka svjee pripremljeni sediment bojati vodenim otopinama
boja kako bi se postigla dobra vidljivost staninih struktura. Za takovo bojanje mogu
se koristiti slijedee boje: Steinheimerova boja koja sadri Alcian plavilo i pironin B ili
Toluidinsko plavilo O.

Od tako pripremljenog sedimenta mokrae uzima se uvijek isti volumen (10-
12 l) i nanosi na predmetno stakalce te pokrije pokrovnicom uvijek iste povrine
(npr. 18 x 18) i promatra pod mikroskopom:
pod malim poveanjem objektiva - za grubu procjenu sadraja
sedimenta pregledava se cijeli preparat, ukljuujui i rubove
pokrovnice
pod velikim poveanjem objektiva - za kvantificiranje prisutnih
elemenata u paljivo pretraenih 20 vidnih polja

Obilati talozi urata, amorfnih fosfata ili karbonata smetaju pri pregledu
sedimenta, pa ih treba ukloniti.
Crvenkasti uratni talog lako se otapa zagrijavanjem na 37C. Mokraa se zagrije na
40C, centrifugira i dekantira od sedimenta, dok je jo topao. Gusti amorfni talog od
kalcij i magnezij fosfata otapa se dodatkom 10%-tne octene kiseline do pH 5.

Najuobiajenije je izraavanje staninih elemenata po vidnom polju velikog
poveanja (x400), a preporuka je je izraavanje staninih elemenata u SI sustavu
(stanini element x 10
6
/L)
U sedimentu mokrae zdravog ovjeka normalno se nalaze kristali mokrane
kiseline, kalcij oksalata i ponekad fosfata, ako je mokraa alkalna. Uz to se nailazi na
sluzne niti, poneku ploastu epitelnu stanicu i naroito kod ena, poneki leukocit.
Ako se pregled sedimenta ne moe izvriti u svjeoj mokrai, ako su u
sedimentu naeni rijei ili ak nedovoljno jasni elementi, sediment treba konzervirati i
pretragu ponoviti u drugo vrijeme ili drugom laboratoriju. Kao konzervans se dodaje 1
ml 40%-tnog formalina u 10 ml mokrae.
13
ODREIVANJE KONCENTRACIJE NATRIJA I KALIJA
PLAMENIM FOTOMETROM

N a e l o
Razrijeeni uzorak seruma (ili mokrae) raspri se u plamenu smjese
propana, butana ili gradskog plina i zraka. Natrij i kalij karakteristino oboje plamen -
natrij uto, a kalij ljubiasto. Svjetlosna energija koju emitiraju u plamenu pobueni
ioni tih elemenata prolazi kroz odgovarajui filtar i prevodi se u fotostanici
(fotoelement, fotoumnoiva) u elektrinu energiju koja se opaa pomou
galvanometra. Intenzivnost emitiranog svjetla razmjerna je koncentraciji natrija
odnosno kalija u ispitivanoj otopini. Kako intenzivnost emitiranog svjetla, osim same
koncentracije iona, ovisi jo i o nekim drugim faktorima, prije svega o jaini plina i
dovodu zraka (natrij i kalij potrebna temperatura iznosi 1900C, to se istodobno pod
istim uvjetima mjere i otopine poznatih koncentracija natrija i kalija (standardi).

R e a g e n c i j e
1. Standardna otopina za odreivanje natrija i kalija u serumu, natrij 140
mmol/L, kalij 5 mmol/L
2. Standardna otopina za odreivanje natrija i kalija u mokrai, natrij 100
mmol/L, kalij 5 mmol/L
3. Nulta otopina.
U plastinu bocu od razrijeivaa stavi se 5 ml koncentriranog aspiracijskog
standarda i dopuni do 500 ml redestiliranom vodom. Tako pripremljena otopina
sadri 3 mmol/L LiCl. Ova otopina slui za podeavanje nule i kao unutarnji standard
instrumenta. Otopina je stabilna 3 dana.

P o s t u p a k
A. Ukljuivanje plamenog fotometra RADIOMETAR FLM 3
1. otvoriti ventil za dovod propana
2. ukljuiti kompresor za zrak
3. ukljuiti glavni prekida (POWER)
Upale se diode za plin, zrak i plamen.
Plameni fotometar je spreman za rad.

B. Kalibracija Na/K kanala
1. Okrenuti sklopku na odgovarajuu oznaku (Na, K, Li) prema tome to se
hoe mjeriti.
2. Mjerenje se vri u posebnim aicama. Pritisnuti prekida razrijeivaa.
(slijedi faza uzimanja uzorka u ovom sluaju zraka, ponovno pritisnuti prekida
razrijeivaa (slijedi izbacivanje otopine za razrijeivanje). Podizanjem prekidaa na
kojem se nalazi nulta otopina ispod rasprivaa zapoinje mjerenje, potrebno je
podesiti za Na:000 a za K:0.0
3. Kalibracija uz pomo stnadardne otopine za natrij i kalij u serumu (140 i 5
mmol/L). Pritiskom na prekida razrijeivaa uzima se 50 l standarda (1), uz
ponovljenu aktivaciju prekidaa izbaci se razrijeeni standard (1:200) u istu aicu.
Staviti raspriva u aicu sa standardom i kalibrirati instrument, (namjestiti na
14
digitalnom mjerilu 140 za natrij i 5.0 za kalij). Sada je aparat spreman za mjerenje
uzoraka.

C. Mjerenje natrija i kalija u serumu
Razrijeeni uzorak (1:200) staviti pod raspriva i oitati na digitalnom mjerilu
izmjerenu koncentraciju. Stabilne vrijednosti se dobivaju za 5 do 7 sekundi. Kako
plameni fotometar radi uz unutarnji standard (Litij, 3 mmol/L), tokom rada nije
potrebno provjeravati nulu.

D. Iskljuivanje instrumenta
Nakon zavrenog mjerenja, instrument ispirati 10 minuta s destiliranom vodom.
Zatvoriti dovod plina, iskljuiti kompresor i pritisnuti glavni prekida (POWER).

N a p o m e n a
Vie faktora utjee na tonost mjerenja plamenom fotometrijom:
Za razliku od izvora svjetlosti kod fotometra (lampa), ovdje je izvor svjetla
plamen, a njegova stabilnost i intenzivnost ovise o jednolinom dotoku i tlaku plina i
zraka. Zato je bolje raditi s plinom iz boce (propanom ili butanom) nego s gradskim
plinom. istoa plina je takoer vana. Kompresor za zrak mora jednolino
opskrbljivati aparat zrakom, pa se zato kompresor mora odravati u besprijekornom
stanju. Moderniji aparati stoga rade uz upotrebu internog standarda. Kao interni
standard koriste se litijeve soli. Litijeva sol dodaje se standardima i probama.
Promjene u stabilnosti automatski se izravnavaju, ime se poveava preciznost
mjerenja.
Plamenik i raspriva moraju biti uvijek isti, da bi se osigurao jednolian
protok otopine. U rasprivau se s vremenom istaloe proteini koji mogu smanjiti
prohodnost, i time protok probe, ili ga potpuno zaepiti. Zato se raspriva mora
povremeno istiti tankom icom. Iz istog razloga se probe i standardi razrijeuju
otopinom koja sadri deterent slobodan od iona (npr. Exstran), jer to pogoduje
jednolinom dotoku otopina u plamen i stvara jednoline i male kapljice prilikom
rasprivanja tekuine koja se mjeri.
Stupanj razrijeenja probe ovisi o svojstvima aparata i koncentraciji elektrolita
u otopini koja se mjeri. Razrijediti treba toliko da se dobije optimalna osjetljivost i
tonost instrumenta. Zato se valja dosljedno drati uputa proizvoaa aparata.
Razrijeivanjem se smanjuje koncentracija proteina u tekuini i viskoznost, a to
pogoduje jednolinom protoku u rasprivau.
Zbog blizine spektralnih linija natrija i kalija, ovi kationi smetaju jedan drugom
prilikom mjerenja. Zato, da bi se ta greka svela na to manju mjeru, a kako se
mjerenje izvodi usporeivanjem intenzivnosti emisije svjetla probe sa standardima,
dobro je da i standardi sadre oba kationa.

L i t e r a t u r a
Propisi tvrtke Radiometar
15
ODREIVANJE KALCIJA U SERUMU
metoda s o-k r e z o l f t a l e i n o m

N a e l o
O-krezolftalein komplekson s kalcijem u alkalnom daje ljubiasto obojeni
helatni kompleks iji je intenzitet proporcionalan s koncentracijom kalcija u uzorku.

R e a g e n c i j e

Priprema i stabilnost otopine reagensa
Radni reagens: Prema broju odreivanja pomijeati pufer i kolor reagens u odnosu
1+1. Stabilnost: 8 sati na 20-25C.

R1 Kolor reagens
o-krezolftalein
8-hidroksikinolin
polivinilpirolidin

R2 Pufer
2-amino-1-metilpropanol

R3 standard
Kalcij

R4 EDTA

0.16 mmol/L
6.90 mmol/L
0.07 mmol/L

260 mmol/L

2.50 mmol/L

150 mmol/L

P o s t u p a k
Slijepa Standard Proba
proba reagensa
ml ml ml

H
2
0 0.020 - -
Uzorak - - 0.020
Standard - 0.020 -
Radni reagens 1.0 1.0 1.0

Promijeati. Izmjeriti absorbancije standarda i proba prema slijepoj probi reagensa
na 575 nm (540-600 nm)..

R a u n
Serum
A
probe

------------ x 2.5 = mmol kalcija/L
A
standarda

16
N a p o m e n a
Uzorak za analizu je nehemolizirani serum, Li-heparinat plazma ili mokraa.
Boja je stabilna 50 minuta. Linearnost metode je do 3.4 mmol/L. Iznad ove
vrijednosti uzorak treba razrijediti s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) u odnosu 1+1,
ponoviti odreivanje a rezultat pomnoiti sa 2.
Antikoagulancije EDTA, citrat i oksalat se ne smiju upotrebljavati. Izbjegavati
stazu i kontraminaciju s tkivnom tekuinom. Po mogunosti ispitanik treba leati 15
minuta i u tom poloaju izvaditi krv (inae 10% vie vrijednosti). Koncentracija kalcija
u serumu se ne mijenja 8 sati na 20-25C, 10 dana u hladnjaku, 12 mjeseci na -
20C.
24-satna mokraa: U posudu za sakupljanje mokrae stavi se 10 ml 6 M
HCL. Skupljena mokraa u toku 24 sata, dobro se promijea, odfiltrira, uzme 10-12
ml za analizu, razrijedii s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) ili destiliranom vodom u
odnosu 1+2, a rezultat pomnoiti s 3.
Kalcij je esto prisutan u mnogim materijalima pa se preporuuje testiranje
plastinih ili staklenih epruveta i kiveta. Sav pribor se treba prati razrijeenom HCl
(1:4), te isprati s redestiliranom ili deioniziranom vodom.
Za serume koji sadre 2 g/L hemoglobina, >300 mol/L bilirubina ili su jako
lipemini nakon odreivanja dodati u slijepu probu i probe po 1 kap EDTA, te nakon
5 minuta ponovo oitati absorbancije.

L i t e r a t u r a
Sarkar R, Chandan UPC. Anal Biochem 1967; 20: 155.

17
ODREIVANJE UKUPNIH PROTEINA U SERUMU
b i u r e t m e t o d a

N a e l o
Proteini i peptidi reagiraju s bakrenim ionima u alkalnom mediju stvarajui
ljubiasto obojeni produkt. Intenzitet boje je proporcionalan s brojem peptidnih
vezova odnosno s koncentracijom proteina u ispitivanom uzorku.

R e a g e n c i j e
1. Biuret reagens
45 g kalij natrij tartarata otopi se u 200 ml 0.2 mol/L NaOH, zatim se otapa 5 g
CuSO
4

x 5H
2
O i konano 5 g KI, te dopuni luinom na 1 L. Tartarat stabilizira
reagens, a jodid spreava spontanu redukciju bakra. Reagens se sprema u tamnoj
boci koja je iznutra parafinirana i dobro zaepljena gumenim epom. Upotrebljiv je 2
do 3 mjeseca. Kada se zamuti uz dodatak seruma reagens je neupotrebljiv.
2. Natrij hidroksid, 0.20 mol/L (8 g/L)
8 g NaOH otapa se u 1 L destilirane vode
3. Natrij klorid, 0.154 mol/L (9 g/L)
4. Standardna otopina proteina, 70 g/L
7 g albumina otopi se u 100 ml 0.02 mol/L kalij klorida (KCl, Mr 74.56) iji je pH
podeen na 6.5-6.8 natrij bikarbonatom. Pod sterilnim uvjetima otopina je na +4C
stabilna nekoliko mjeseci. Najbolje je otopinu razdijeliti u ampule koje slue samo za
dnevnu upotrebu.

P o s t u p a k
Slijepa Proba Standard
ml ml ml

NaCl (3) 5.0 4.8 4.8
Serum - 0.2 -
Standard (4) - - 0.2
Biuret reagens (1) 5.0 5.0 5.0
Pomijea se i fotometrira 30-90 minuta nakon dodavanja biuret reagensa na 546 nm
ili uz zeleni filter s maksimumom propustljivosti od 546 do 565 nm.

R a u n

A
probe

-------------- x koncentracija standarda = g proteina/L seruma.
A
standarda

Ako se usporedo ne radi standard rezultati se oitavaju iz badarnog
dijagrama, koji se izrauje na slijedei nain:
U mijeanom serumu odredi se ukupni i neproteinski duik mikrokjeldahl postupkom
i izrauna koncentracija proteina prema formuli (UN - NPN) x 6.25 = g proteina/L.
18
Serum s poznatom koncentracijom proteina razrijedi se s fiziolokom otopinom 10
puta. Za analizu se uzima 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 i 2.5 ml razrijeenog seruma, dopunjava
se fiziolokom otopinom do 5.0 ml i dodaje 5.0 ml biuret reagensa, a nakon 30
minuta izmjere se absorbancije.

Primjer: UN = 12.0 g/L
NPN = 0.45 g/L
(12.0 - 0.45) x 6.25 = 72 g proteina/L.

volumen razrijeenog seruma,
ml

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5
g proteina u uzetom volumenu 0.0036 0.0072 0.0108 0.0144 0.018

odgovara koncentraciji proteina
u g/L ()

18

36

54

72

90
absorbancija 0.075 0.16 0.26 0.32 0.40

() koliine proteina treba mnoiti sa 5000, jer se u postupku uzima 0.2 ml seruma,
a rezultat se izraava na 1 L.

N a p o m e n a
Odreivanje proteina pomou jednostavnog biuret reagensa oteano je u
lipeminim serumima. U svrhu izbjegavanja greaka dodaje se ureja i mijea matina
otopina biureta s otopinom za razrjeivanje. Takva otopina biureta je nestabilnija i
treba je pripravljati svaki tjedan.
Jedan od provjerenih je biuret reagens prema Richterichu, 1971.
a) Matina otopina kalij natrij tartarata 159 mmol/L, bakar(II) sulfata 60
mmol/L, kalij jodida 30 mmol/L i natrij hidroksida 200 mmol/L
4.5 g kalij natrij tartarata otopi se u 40 ml 0.2 M natrij hidroksida. Zatim se otapa 1.5
g CuSO
4

x 5H
2
O, te 0.5 g KJ i nadopuni s NaOH na 100 ml.
uva se u tamnoj boci na sobnoj temperaturi.
b) Otopina za razrijeivanje: kalij jodid, 30 mmol/L i natrij hidroksid, 200
mmol/L
5 g KJ otopi se u 1000 ml 0.2 mol/L NaOH. Dri se na sobnoj temperaturi.
c) Konani biuret reagens: kalij natrij tartarat 31.8 mmol/L, bakar(II) sulfat 12
mmol/L, natrij hidroksid 200 mmol/L, kalij jodid 30 mmol/L i ureja 6 mol/L
180 g ureje stavlja se u smjesu od 100 ml matine otopine (a) i 250 ml otopine za
razrijeivanje (b) i konano nadopuni otopinom za razrijeivanje na 500 ml. Dri se
na sobnoj temperaturi a stabilan je 7 dana.

L i t e r a t u r a
Wolfson WA., Cohn C., Calvary E., Ichiba F.: Am.J.Clin.Path., 18, 723 (1948)
Richterich P.: Klinische Chemie, III izd., Karger, Basel, 1971. str. 305

19
RAZDVAJANJE PROTEINA SERUMA
e l e k t r of or e z om na c e l oge l t r a k a ma

N a e l o
Putovanje nabijenih estica u elektrinom polju naziva se eklektroforeza.
Brzina putovanja ovisi o naboju estica. Da bi se naboj odrao konstantnim,
potrebno je da se tijekom elektroforeze odrava stalnost sredine u kojoj se ona
odvija. To se postie tako da elektroforeza tee u puferu odreenog pH, ionske
jakosti i vodljivosti.
Proteini su amfoterni jer naboj aminokiselina zavisi od pH sredine. Nanoenjem
seruma na vlanu celogel traku, elektroforetski se razdvajaju proteinske skupine,
bojaju, suviak boje ukloni a obojene zone izreu, boja eluira i absorbancije mjere
fotometrijski. ee se traka uini providnom i kvantitativno mjerenje izvri direktno
denzitometrijski.

R e a g e n c i j e i p r i b o r
1. Veronal pufer, 40 mmol/L, pH 9.2
8.24 g natrij dietilbarbiturata (C
8
H
11
N
2
O
2
Na) (M
r
206) otopi se u 1 L
2. Otopina za bojanje, Ponceau S, 5 g/L
0.5 g boje Ponceau S otopi se u 100 ml 0.3 mol/L trikloroctene kiseline CCl
3
COOH
(M
r
163)
3. Otopina za odbojavanje
5 ml glacijalne octene kiseline razrijedi se na 100 ml
4. Otopina za otapanje celogela, octena kiselina, 80 % (v/v)
5. Otopina za postizavanje prozirnosti traka
Pomijea se 86 ml metanola, 14 ml octene kiseline i 0.1 ml glicerola
6. Celogel trake veliine 2.5 x 14 ili 2.5 x 17 cm
Trake se moraju uvati u zatvorenom paketu, a otvoreno pakovanje se mora drati u
vertikalnom poloaju. Ako se trake upotrebe u roku 7 dana, potrebno je dodati vodu,
a ako se koriste due od 15 dana, trake se stavljaju u pokrivenu posudu s 30 %-tnim
(v/v) metanolom. Prosuene trake gube karakteristiku gela.

P o s t u p a k
Pufer se ulije u kadicu za elektroforezu i nivo tekuine izjednai. Celogel
trake se stavljaju u pufer najmanje 10 minuta, a najdulje preko noi. Suviak
tekuine uklanja se stavljanjem traka izmeu dva filter papira, ali traka se ne smije
pritiskati. Trake se stavljaju na most kade za elektroforezu i to tako da penetrantna
strana traka bude okrenuta na gore. Slobodne krajeve traka treba prekriti filter
papirom. Trake moraju biti napete i postupak nanoenja treba izvoditi to bre da bi
se izbjeglo prosuivanje traka. Normalna elektroforeza vri se na trakama veliine
2.5 x 17 cm, koje su razapete na mostu od 11 cm. Nanaa se 3 do 4 l seruma 1.5
cm od katodnog kraja. Ukljui se struja, podesi napon od 200 V, stavi pokrov na
kadu i elektroforetsko razdvajanje provodi 75 minuta. Uz navedene uvjete proteini se
pomaknu maksimalno 6 cm i dobivaju se frakcije albumina, alfa-1, alfa-2, beta- i
gama-globulina. Ponekad se beta-globulinska frakcija razdvaja u dvije polufrakcije.
20
Po zavretku elektroforetskog razdvajanja trake se oznae brojevima pomou pera
umoenog u razrijeeni serum.
Trake se stavljaju 5 minuta u otopinu boje, zatim se suviak boje odstranjuje
trokratnim stavljanjem u razrijeenu otopinu octene kiseline.
Obojene frakcije mogu se izrezati i staviti u 5 epruveta. U svaku se dodaje
smjesa za otapanje celogela, 80%-tna octena kiselina i to 3 ml za globulinske
frakcije i 6 ml za albuminsku frakciju. Absorbancija svjetla otopina proteinskih frakcija
mjeri se prema eluatu dijela trake bez proteina na 520 nm.
Na temelju oitanih absorbancija izraunavaju se relativni postoci proteinskih
frakcija.
Mjerenje relativnih postotaka proteinskih frakcija moe se vriti i na trakama
koje su uinjene transparentnima. Trake se nakon bojanja proteina i uklanjanja
suvika boje stavljaju u metanol, da se izvri dehidratacija. Nakon samo 30 sekunda
odlije se metanol i doda otopina za postizanje prozirnosti traka, a nakon jedne
minute trake se stavljaju na staklenu plou i suviak tekuine ukloni filter papirom.
Trake se zagriju na 50 do 60C kroz 5 minuta i postaju sasvim prozirne. Preokrenuta
staklena ploa se stavi na komad bijelog papira, hladi se oko 20 minuta i zatim se
trake skidaju i stavljaju u plastini ili papirnati omot. Prozirne trake mogu posluiti za
denzitometrijsko odreivanje relativnih postotaka proteinskih frakcija.

ODREIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRAI
Metoda s u r e a z o m i Berthelot-reakcijom
(f e n o l i h i p o k l o r i t)

N a e l o
Djelovanjem ureaze razgrauje se ureja na ugljini dioksid i amonijak, koji u
reakciji s fenolom i hipokloritom u prisutnosti nitroprusida stvara plavo obojeni
indofenolni spoj, koji se mjeri na 540 nm.

R e a g e n c i j e
1. Fosfatni pufer, 0.10 mol/L, pH 7.4
a) otopina natrij hidrogen fosfata, 0.1 mol/L
14.2 g Na
2
HPO
4
ili 17.8 g Na
2
HPO
4
x 2H
2
O otopi se u 1L destilirane vode
b) otopina kalij hidrogen fosfata, 0.10 mol/L
13.6 g KH
2
PO
4
otopi se u 1 L destilirane vode
c) fosfatni pufer, 0.l0 mol/L, pH 7.4 pripravlja se mijeanjem 808 ml otopine natrij
hidrogen fosfata (a) i 192 ml otopine kalij hidrogen fosfata (b)
2. Puferirana otopina ureaze
100 mg kupovne ureaze razmuti se u 100 ml pufera, pH 7.4 (1c), filtrira se,
konzervira s nekoliko kapi kloroforma, te uva na +4C. Otopinu ureaze moe se
pripremiti suspendiranjem 200 mg bezmasnog sojinog brana u 100 ml pufera.
Razriba se u tarioniku i profiltrira nakon 20 minuta.
3. Standardna otopina ureje, 5 mmol/L (300 mg/ml)
4. Koncentrirani fenolni reagens, fenol 540 mmol/L, nitroprusid 0.85 mmol/l
21
50 g fenola (bezbojnog) i 0.25 g nitroprusida Na
2
Fe(CN)
5
NO x 2H
2
O otopi se u 1 L
destilirane vode (pazite - fenol stvara opekotine ako doe u doticaj sa koom).
5. Koncentrirani hipokloritni reagens: natrij hipoklorit NaOCl, 28 mmol/L u
natrij hidroksidu, 625 mmol/L
2.1 g NaOCl i 25 g NaOH otopi se u destiliranoj vodi i nadopuni do 1 L
6. Razrijeeni fenolni reagens, 106 mmol/L
100 ml koncentrirane otopine fenola razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom
7. Razrijeeni hipoklorit reagens - 5.6 mmol/L
100 ml koncentriranog reagensa razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom

P o s t u p a k
ml ml ml

Ureaza (2) 0.10 0.10 0.10
Standard (3) - 0.20 -
Serum ili mokraa (1:100) - - 0.20

Pomijea se, inkubira 15 minuta na 37C, a nakon toga dodaje

Otopina fenola (6) 5.0 5.0 5.0
Otopina hipoklorita (7) 5.0 5.0 5.0

Promijea se i ostavi 20 minuta na 37C ili 30 minuta na 25C.
Apsorbancija slijepe, probe i standarda oita se prema vodi na 540 nm ili uz zeleni
filter.

R a u n
A
probe
- A
slijepe
----------------------------- x 5 = mmol/L seruma
A
standarda
- A
slijepe

A
probe
- A
slijepe

------------------------------ x 0.5 = mol/L mokrae
A
standarda
- A
slijepe

ili se prerauna na 24-satni volumen mokrae

N a p o m e n a
Nove modifikacije postupka koriste salicilat umjesto fenola, reakcija se
provodi kod sobne temperature, a osjetljivost reakcije je bitno poveana. Aminofenol,
asparagin i hemoliza daju lano vee rezultate, a klorpromazin i inhibitori ureaze
(fluoridi, spojevi ive, timol) lano smanjene rezultate.

L i t e r a t u r a
Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156.
22
ODREIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRAI
u r e a z a - GLDH

N a e l o
Djelovanjem ureaze razgrauje se ureja na ugljik dioksid i amonijak,
koji u reakciji s -ketoglutaratom i reduciranim koenzimom (NADH) djelovanjem
glutamat dehidrogenaze stvara glutamat i oksidirani oblik koenzima. Pad
absorbancije reduciranog koenzima na 340 nm proporcionalan je koncentraciji ureje
u uzorku.

Ureja + H
2
O Ureaza 2NH
3
+ CO
2
NH
3
+-ketoglutarat+NADH GLDH Glutamat + NAD
+

R e a g e n c i j e

R1 Reagens
Tris pufer pH 8.5 0.1 (20C)
-ketoglutarat
NADH
Ureaza
GLDH

R2 Standard
Ureja

70 mmol/L
5.2 mmol/L
>0.14 mmol/L
> 5600 U/L
> 400 U/L

17.81 mmol/L

Priprema otopine reagensa i stabilnost
Sadraj boice reagensa (TR-1055) otopiti u 20 ml destilirane vode. Otopljeni
reagens stabilan 90 dana na2 8 C.

P o s t u p a k
Proba Standard
ml ml

Reagens 2.0 2.0
Uzorak 0.02 -
Standard - 0.02

Promijeati. Na 340 nm izmjeriti A1 nakon 30 sekundi i A2 nakon 90 sekundi od
poetka reakcije.
O-instrumenta: destilirana voda
Izraunati A / min = A1 A2

23

R a u n
Serum (plazma)

A / min uzorka
--------------------------- x 17.81= mmol ureje / L
A / min standarda

N a p o m e n a
Uzorak za analizu moe biti nehemolizirani serum, plazma (sa EDTA ili Natrij
heparinom), ili mokraa razrijeena 1+20 sa vodom.
Linearnost metode je do 40 mmol/L. Iznad ove vrijednosti uzorak treba
razrijediti s destiliranom vodom koja ne sadri amonijeve ione i ponoviti analizu.
Rezultat mnoiti s faktorom razrijeenja.
Mora se izbjegavati zagaenje s amonijakom i amonij ionima. Fluorid je
poznati inhibitor ureaze te smanjuje brzinu reakcije a prisutnost amonij iona u
antikoagulancijama (naprimjer amonij heparin) uzrokuje lano poviene vrijednosti.

L i t e r a t u r a
Talke H, Schubert GE. Klin Wochenschr. 1965; 43: 17.
Fearon WR. Biochem 1931; 331: 802.
Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156.
Westgard JO, Hunt MR. Clin Chem 1973; 19: 49.

ODREIVANJE KREATININA U SERUMU I MOKRAI
d i r e k t n a m e t o d a
N a e l o
Serum (ili razrijeena mokraa 1:50) deproteinizira se trikloroctenom
kiselinom. Kreatinin s alkalnom otopinom pikrata stvara kompleks naranaste boje,
koji se mjeri na 546 nm.

R e a g e n c i j e
1. Trikloroctena kiselina, 3.0 mol/L
490 g trikloroctene kiseline CCl
3
COOH (Mr 163) otopi se u 1 L destilirane vode
2. Pikrinska kiselina, 40 mmol/L
9.3 g pikrinske kiseline, trinitrofenola (M
r
229) otopi se u 500 ml destilirane vode uz
zagrijavanje do 80C. Otopina se ohladi i nadopuni destiliranom na 1 L
3. Natrij hidroksid, 4.1 mol/L
164 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode
4. Matini standard kreatinina, 10 mmol/L
113 mg kreatinina (M
r
113) otopi se u 100 ml 0.1 mol/L HCl
5. Radni standard kreatinina, 100 mol/L
1.0 ml matinog standarda (4) razrijedi se s 0.1 mol/L HCl na 100 ml

24
P o s t u p a k
Proba Standard Slijepa
ml ml ml

Serum (ili mokraa 1:50) 2.0 - -
Radni standard (5) - 1.0 -
Destilirana voda 2.0 1.0 2.0
Trikloroctena kiselina (1) 2.0 1.0 1.0

Promijea se i proba centrifugira 10 minuta na 3000 okretaja/minuta. U daljnji
postupak uzima se ukupni sadraj u epruvetama za standard i slijepu, te alikvot
bistre tekuine - probe

Bistra tekuina (proba) 3.0 - -
Pikrinska kiselina (2) 1.0 1.0 1.0
Natrij hidroksid (3) 1.0 1.0 1.0

Promijea se i nakon 15 minuta mjeri absorbancija probe i standarda prema slijepoj
na 546 nm ili uz zeleni filter (530 do 550 nm).

R a u n
Serum
A
probe
------------ x 100 = mol kreatinina/L
A
standarda

Mokraa
A
probe
100
-------------- x ---------- x 50 = mmol/L mokrae
A
standarda
1000

Rezultat se prerauna na 24-satni volumen mokrae.

N a p o m e n a
Pri odreivanju kreatinina direktnim postupkom s pikratom u alkalnoj sredini
reagiraju mnogi prirodni supstrati (glukoza, fruktoza, proteini, hemoglobin), lijekovi i
njihovi metaboliti (PSP, BSP, askorbinska kiselina), a naroito intenzivno acetoacetat
i aceton.
Zbog toga postoji mnogo modifikacija reakcije s pikratom u kojima se kreatinin
adsorbira na aluminij silikat (tonzil, Lloydov reagens, Fullerova zemlja) ili ionske
izmjenjivae. Zadnjih godina razvijene su i kinetike metode za koje je vano to to
ostali kromogeni sporije reagiraju s alkalnim pikratom od kreatinina, pa se mjeri
poetna brzina razvijanja boje. Potpuno enzimske metode odreivanja kreatinina su
specifine, ali vrlo skupe.

L i t e r a t u r a
Modifikacija postupka Owen JA et al. Biochem J 1954; 58: 426.
25
ODREIVANJE UKUPNOG BILIRUBINA U SERUMU
m e t o d a Jendrassik-Grof

N a e l o
Nakon dodatka puferirane otopine akceleratora, konjugirani i nekonjugirani
bilirubin reagiraju s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij nitrit) stvarajui
azoboju. Dodatkom askorbinske kiseline razgradi se preostali reagens a s alkalnom
otopinom tartarata (Fehlingova otopina), crvena boja azobilirubina prelazi u plavu
boju, koja se mjeri na 600 nm.

R e a g e n c i j e
1. Otopina akceleratora
Kofein 260 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L, natrij benzoat 520 mmol/L i EDTA 2.69
mmol/L
7.5 g natrij benzoata otopi se u priblino 80 ml destilirane vode, zagrije na 60C, te
doda 5.0 g kofeina, 7.5 g bezvodnog natrij acetata ili 12.5 g CH
3
COONa x 3H
2
O i
0.1 g Na
2
EDTA x 2H
2
O. Bistra otopina ohladi se na sobnu temperaturu i dopuni
destiliranom vodom do 100 ml
1.a) Jo bolji akcelerator je:
Difilin 194 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L i EDTA 2.69 mmol/L
5.0 g difilina (2,2,,3,-dihidroksipropil teofilina), 7.5 g bezvodnog natrij acetata i 0.1 g
Na
2
EDTA x 2H
2
O otopi se u priblino 80 ml destilirane vode i zagrije na 50C.
Otopina se ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destilirantom vodom do 100 ml.

2. Diazo reagens
Otopina A - sulfanilna kiselina, 29 mmol/L
5 g sulfanilne kiseline (anilin-p-sulfonska kiselina) (M
r
173) otopi se u 800 ml
destilirane vode uz dodatak 15 ml koncentrirane HCl i zagrije do 60C. Otopina se
ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destiliranom vodom do 1 L.
Otopina B - natrij nitrat, 72 mmol/L
0.5 g NaNO
2
otopi se u 100 ml destilirane vode. Otopina je stabilna 14 dana u
tamnoj boci na +4C.

Konani diazo reagens
Pomijea se 10 ml otopine A - sulfanilna kiselina s 0.25 ml otopine B - natrij nitrit.
Reagens je stabilan 30 minuta.
3. Askorbinska kiselina, 227 mmol/L
0.4 g askorbinske kiseline otopi se u 10 ml destilirane vode. Priprema se svaki dan
svjea otopina.
4. Fehlingova otopina, kalij natrij tartarat, 1.24 mol/L, NaOH 2.5 mmol/L.
350 g kalij natrij tartarata x 4H
2
O i 100 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode.

26
P o s t u p a k
Proba Slijepa
ml ml

Serum 1.0 1.0
Askorbinska kiselina - 0.1
Akcelerator (1) 2.0 2.0
Konani diazo reagens (2) 0.5 0.5

Promijea se i nakon 10 minuta dodaje

Askorbinska kiselina (3) 0.1 -
Fehlingov reagens (4) 1.5 1.5

Promijea se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili
uz crveni filter u kiveti s debljinom sloja 10 mm.
Rezultat se oita iz badarnog dijagrama ili se istovremeno vri postupak sa
standardnim serumom.

ODREIVANJE KONJUGIRANOG BILIRUBINA
m e t o d a Jendrassik-Grof

N a e l o
Konjugirani bilirubin reagira s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij
nitrit) bez dodataka akceleratora, stvarajui azoboju. Reakcija se prekida s
askorbinskom kiselinom, a uz alkalnu otopinu tartarata crvena boja azobilirubina
prelazi u plavu boju koja se mjeri na 600 nm.
R e a g e n c i j e
Iste kao za odreivanje ukupnog bilirubina
P o s t u p a k
Proba Slijepa
ml ml

Serum 1.0 1.0
Askorbinska kiselina - 0.1
Akcelerator (1) - 2.0
Konani diazo reagens (2) 0.5 0.5
Promijea se, i nakon 10 minuta dodaje
Askorbinska kiselina (3) 0.1 -
Akcelerator (1) 2.0 -
Fehlingova otopina (4) 1.5 1.5
Promijea se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili
uz crveni filter.
N a p o m e n a
27
Odreivanje bilirubina vri se u svjeem serumu, jer svjetlo, a posebno
suneve zrake razgrauju bilirubin. U pravilu serum se razrijeuje s fiziolokom
otopinom u omjeru 1:10.
Lano vii rezultat daju tirozin, histidin, askorbinska kiselina, aminofenol, rifampicin,
DOPA i metil-DOPA. Sniene vrijednosti javljaju se pri jakoj hemolizi.

L i t e r a t u r a
Michaelssonova modifikacija metode Jendrassik L. Grof P. Biochem J 1938; 297: 81.
razraena u Verley H, Gowenlock AH, Bell M. Practical Clinical Biochemistry, vol.1,
W.Hainmann Medical Books LTD, London, 1980, str. 1022.
28
ODREIVANJE GLUKOZE U SERUMU
enzimska metoda s g l u k o z a
o k s i d a z o m i p e r o k s i d a z o m

N a e l o
Glukoza se katalitikim djelovanjem glukoza oksidaze (GOD) oksidira u
glukonsku kiselinu i pri tom nastaje vodikov peroksid, koji reagira s kromogenom
tvari (aromatskim aminom) u prisutnosti peroksidaze (POD) stvarajui obojeni
produkt. Intenzitet boje mjeri se fotometrijski.

Glukoza + O
2

+ H
2
O GOD glukonska kiselina +H
2
O
2

2H
2
O
2
+ fenol + 4-aminoantipirin POD kinonimin + 4H
2
O

R e a g e n c i j e
R1 Reagens
4-aminoantipirin
Glukoza oksidaza (GOD)
Peroksidaza (POD)

R2 Pufer
Fosfatni pufer pH 7.4 0.05
Fenol

R3 Standard

Dodatni reagens

0.40 mmol/L
>300 kat/L
> 17 kat/L

100 mmol/L
10 mmol/L

5.56 mmol/L

0.4 mmol/L uranilacetat ili
0.33 mol/L perklorna kiselina
Priprema i stabilnost otopina
Sadraj boice reagensa (TR-2000 otopiti u 250 ml pufera, TR-2001 otopiti u 500 ml
pufera, TR-2002 otopiti u 1000 ml pufera) otopiti u puferu i sadraj vratiti u boicu
pufera. Stabilnost: 4 tjedna na 2-8C, 2 tjedna na 20-25C. uvati na tamnom
mjestu.

P o s t u p a k
Standard Probe
ml ml

Standard 0.01 -
Serum - 0.01
Otopina reagensa 1.0 1.0

Promijea se i inkubira 30 minuta na 20-25C, 25 minuta na 30C ili 15 minuta na
37C. Oitaju se absorbancije standarda i proba prema slijepoj reagensa na 500 nm
(492-550 nm).
29
R a u n
A
probe

------------ x koncentracija standarda = mmol glukoze/L
A
standarda

N a p o m e n a
Uzorak za analizu moe biti kapilarna krv, serum, heparinizirana plazma,
likvor. Linearnost metode je do 27.8 mmol/L. Iznad ove vrijednosti, uzorak se mora
razrijedi destiliranom vodom u odnosu 1+2 (0.1 ml uzorka + 0.2 ml destilirane vode)
ponoviti odreivanje a rezultat mnoiti sa 3.
Glukoza je u serumu i plazmi stabilna 8 sati na 20-25C ili 3 dana na 2-8C.
Kod koritenja kapilarne krvi za inhibiciju glikolize upotrebljava se natrij ili kalij fluorid.
Glukoza je u takvom uzorku stabilna 1 dan na 20-25C ili 7 dana na 2-8C (ako se
uva u zatvorenoj epruveti). Glukoza je u nadsloju (kapilarna krv s uranil acetatom)
stabilna 3 dana na 2-8C u zatvorenoj epruveti.
Mokrana kiselina, askorbinska kiselina, glutation, antikoagulancije, bilirubin i
kreatinin u fiziolokim koncentracijama ne utjeu na test.
Otopina reagensa sadri natrij azid.

L i t e r a t u r a:
Trinder P. Ann Clin Biochem 1969; 6: 24.
30
ODREIVANJE KOLESTEROLA U SERUMU
e n z i m s k a CHOD-PAP metoda

N a e l o
Kolesterol esteri se djelovanjem kolesterol esteraze hidroliziraju, a ukupni
kolesterol oksidira uz kolesterol oksidazu u kolestenon i vodik peroksid koji s
aminofenazonom i fenolom u prisustvu peroksidaze (POD) stvara obojeni
fenazonkinonimin koji se mjeri na 500 nm.

kolesterol-esteri+H
2
O kolesterol esteraza kolesterol + masna kiselina
kolesterol+O
2
kolesterol oksidaza 4- kolestenon + H
2
O
2
2 H
2
O
2
+ 4-aminoantipirin + HBA POD kinonimin + 4 H
2
O
HBA hidroksibenzojeva kiselina

R e a g e n c i j e

R1 Reagens
Kolesterol esteraza (KE)
Kolesterol oksidaza (KO)
Peroksidaza (POD)
4-aminoantipirin
HBA
Pufer, pH 6.7 0.1 (20C)

R2 Standard

>500 U/L
>200 U/L
>300 U/L
0.25 mmol/L
10 mmol/L
50 mmol/L

5.17 mmol/L
Priprema otopine reagenasa i stabilnost
Sadraj boice reagensa TR-1032 otopiti u 20 ml destilirane vode, TR-1033 otopiti u
100 ml destilirane vode. Stabilnost je 14 dana na 2-8C, 2 dana na 20-25C.

P o s t u p a k
reagensa
ml ml ml

Standard - 0.010 -
Serum - - 0.010
Otopina reagensa 1.0 1.0 1.0

Promijea se i inkubira 15 minuta na 25C, 10 minuta na 30C ili 5 minuta na 37C.
Izmjeri absorbancije proba (A
p
) i standarda (A
s
) prema slijepoj reagensa na 500 nm
(500-550 nm).

R a u n
A
probe

------------ x 5.17 = mmol kolesterola/L
A
standarda

31

N a p o m e n a
Uzorak za analizu moe biti serum, heparinizirana ili EDTA plazma.
Kolesterol je u uzorku stabilan 6 dana na 20-25C ili na 2-8C (6 mjeseci ako
se zamrzne). Stabilnost boje je 20 minuta. Linearnost metode je do 20 mmol/L.
Ako je apsorbancija slijepe probe > 0.200, reagens moe biti zagaen.
Standardi kolesterola ili kalibratori koji sadre tvari kao to su octena kiselina,
deterdenti ili surfaktanti mogu inhibirati enzime u reagensu i ne mogu se koristiti.

L i t e r a t u r a:
Allain CC, Poom L,.Chan SG, Richmond W, Pu F. Clin Chem.1974; 20: 470.
32
ODREIVANJE KATALITIKE KONCENTRACIJE
ALANIN AMINOTRANSFERAZE (ALT)
Metoda kontinuiranog mjerenja
Modifikacija metode po Karmenu

N a e l o
L-alanin + -ketoglutarat ALT piruvat + L-glutamat
Piruvat + NADH + H
+
LDH laktat + NAD
+

R e a g e n c i j e

R1 reagens
-ketoglutarat
L-alanin
Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid
(NADH
2
)
Laktat dehidrogenaza (LDH)
Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA)
Pufer (pH 7.4 0.1)
Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L
400 mmol/L

0.15 mmol/L
33.3 kat/L

5 mmol/L
80 mmol/L

P o s t u p a k
Proba
ml

Otopina reagensa 2.0
(ugrijana na 30C ili 37C)
Serum (ili plazma) 0.2

Promijeati, inkubirati 90 sekundi na 30C ili 37C. Oitati absorbanciju probe prema
destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute. Izraunati A/minuta.

R a u n
ALT (U/L) = A/minuta x 1746

N a p o m e n a
Nehemolizirani serum ili plazma su najei uzorci za odreivanje katalitike
koncentracije ALT. Katalitika koncentracija ALT u serumu stabilna je tjedan dana na
2-8C. Fluoridi, EDTA i heparin u uobiajenim koncentracijama ne utjee na analizu.
Linearnost metode je do 350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak
razrijediti s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod rauna.
Young i suradnici objavili su popis lijekova i drugih tvari koje utjeu na ALT u
cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitike koncentracije ovog enzima.

33
L i t e r a t u r a
Kamen A. J Clin Investigation 1955; 34: 131.
Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical
Physiology: Scand J Clin Lab Invest. 1974; 33: 291.
International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special
Report: Clin Chem 1977; 23: 887.
Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:
34
ASPARTAT AMINOTRANSFERAZE (AST)
Metoda kontinuiranog mjerenja
Modifikacija metode po Karmenu

N a e l o
L-aspartat + -ketoglutarat AST oksalacetat + L-glutamat
oksalacetat + NADH
+
+ H
+
MDH malat + NAD
+

R e a g e n c i j e

R1 reagens
-ketoglutarat
L-aspartat
Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH
2
) Malat
dehidrogenaza (MDH)
Laktat dehidrogenaza (LDH)
Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA)
Pufer (pH 7.7 0.1)
Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L
200 mmol/L
0.15 mmol/L
10 kat/L
22 kat/L
5 mmol/L

80 mmol/L

P o s t u p a k
Proba
ml

Otopina reagensa 2.0
(ugrijana na 30C ili na 37C)
Serum (ili plazma) 0.2

Promijeati, inkubirati 90 sekundi (na 30C ili 37C). Oitati absorbanciju probe
prema destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute na 340 nm (334 nm; 356 nm). Izraunati
A/minuta.

R a u n
AST (U/L) = A/minuta x 1746

N a p o m e n a
Nehemolizirani serum (katalitika koncentracija AST u serumu stabilna je
tjedan dana na 2-8C) ili plazma (fluoridi, EDTA i heparin u uobiajenim
koncentracijama ne utjee na analizu) su pogodni uzorci. Linearnost metode je do
350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak razrijediti s fiziolokom otopinom
(0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod rauna.
Young i suradnici su objavili popis lijekova i drugih tvari koje utjeu na AST u
cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitike koncentracije enzima.
35
L i t e r a t u r a
Karmen AJ. Clin Investigation 1955; 34: 131.
Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical
Physiology: Scand J Clin Lab Invest 1974; 33: 291.
International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special
Report: Clin Chem 1977; 23: 887.
Young DS, Prestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:

36
ALKALNE FOSFATAZE (ALP)
Metoda jedne toke

N a e l o
Alkalna fosfataza u prisutnosti magnezijevih iona djeluje na p-nitrofenilfosfat
pri pH 10.2 i temperaturi reakcijske smjese od 30C stvarajui p-nitrofenol. Intenzitet
ukastog obojenja je proporcionalan koncentraciji osloboenog produkta odnosno
aktivnosti alkalne fosfataze i mjeri se na 405 nm.

R e a g e n c i j e
1. Puferirani supstrat p-nitrofenilfosfat, 4.0 mmol/L, amino metil propanol 840
mmol/L, magnezij sulfat 0.5 mmol/L
1.052 g dinatrij p-nitrofenilfosfata C
6
H
4
NO
2
PNa
2
(M
r
263.1) i 123.3 mg magnezij
sulfata MgSO
4
x 7H
2
O (M
r
246.5) se otopi u destiliranoj vodi, doda 74.9 ml 2-amino-
2-metilpropanola (M
r
89.1), podesi pH 10.2 i nadopuni destiliranom vodom na 1 L.
Reagens je postojan 2 mjeseca uz uvanje u hladioniku.
2. Natrij hidroksid, 50 mmol/L (2 g/L)
2 g NaOH se otopi i nadopuni destiliranom vodom do 1 L.
3. Matini standard p-nitrofenola 0.36 mmol/L (50 mg/L)
5.0 mg p-nitrofenola (M
r
139) se otopi u 50 mmol/L NaOH i dopuni s NaOH u
odmjernoj tikvici na 100 ml.
4. Radni standard p-nitrofenola, 45 mol/L
2.5 ml matinog standarda (3) razrijedi se s 50 mmol/L NaOH na 20 ml. Radni
standard pripravlja se svakodnevno.

P o s t u p a k
Proba Slijepa
ml ml

Puferirani supstrat (1) 1.0 1.0

Predinkubira se u vodenoj kupelji na 30C tijekom 5 minuta i zatim doda

Serum 0.050 -

Dri se 30 minuta na 30C i zatim prekida inkubacija dodatkom

NaOH (2) 10.0 10.0
Serum - 0.050

Mjeri se absorbancija probe prema slijepoj na 405 nm.

Rezultat se izraunava iz badarnog dijagrama koji se pripravlja mijeanjem razliitih
volumena radnog standarda p-nitrofenola s otopinom natrij hidroksida (2).
37

ml radnog standarda 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
ml NaOH (2) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5
odgovara katalitikoj 60 120 180 240 300
koncentraciji ALP-U/L

U epruvetu se stavi s 1.0 ml radnog standarda koji sadri 4.5 x 10
-2
mol p-
nitrofenola u volumenu od 5.5 ml. Ako se ta koliina p-nitrofenola stvori tokom 30
minuta, tada je katalitika koncentracija alkalne fosfataze u 50 l ispitivanog uzorka
koji je konano razrijeen na 11.0 ml slijedei:

11.0 1 1000
------- x 4.5 x 10
-2
mol x ------- x ------------ = 60 mol/minuta/L = 60 U/L
5.5 30 0.05

L i t e r a t u r a
Modifikacija postupka s gotovim reagencijama i postupka koji preporua Britanska
asocijacija klinikih biokemiara, 1980.

Klinička Biokemija - Propisi

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Klinička Biokemija - Propisi

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Klinika biokemija Propisi

You might also like