V o l . 1 7 3 , N o .

2
J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 9 1 , p . 6 9 7 - 7 0 3
0 0 2 1 - 9 1 9 3 / 9 1 / 0 2 0 6 9 7 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
1 6 S R i b o s o m a l DN A A m p l i f i c a t i o n f o r P h y l o g e n e t i c S t u d y
WI L L I A M G . WE I S B U R G , * S U S A N M . B A R N S , DA L E A . P E L L E T I E R , A N D DA V I D J . L A N E
G E N E - T R A K S y s t e m s , 3 1 N e w Y o r k A v e n u e , Fr a m i n g h a m , M a s s a c h u s e t t s 0 1 7 0 1
R e c e i v e d 1 6 A p r i l 1 9 9 0 / A c c e p t e d 7 N o v e m b e r 1 9 9 0
A s e t o f o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s c a p a b l e o f i n i t i a t i n g e n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) o n
a p h y l o g e n e t i c a l l y a n d t a x o n o m i c a l l y wi d e r a n g e o f b a c t e r i a i s d e s c r i b e d a l o n g wi t h m e t h o d s f o r t h e i r u s e a n d
e x a m p l e s . O n e p a i r o f p r i m e r s i s c a p a b l e o f a m p l i f y i n g n e a r l y f u l l - l e n g t h 1 6 S r i b o s o m a l DN A ( r DN A ) f r o m
m a n y b a c t e r i a l g e n e r a ; t h e a d d i t i o n a l p r i m e r s a r e u s e f u l f o r v a r i o u s e x c e p t i o n a l s e qu e n c e s . M e t h o d s f o r
p u r i f i c a t i o n o f a m p l i f i e d m a t e r i a l , d i r e c t s e qu e n c i n g , c l o n i n g , s e qu e n c i n g , a n d t r a n s c r i p t i o n a r e o u t l i n e d . A n
o b l i g a t e i n t r a c e l l u l a r p a r a s i t e o f b o v i n e e r y t h r o c y t e s , A n a p l a s m a m a r g i n a l e , i s u s e d a s a n e x a m p l e ; i t s 1 6 S
r DN A wa s a m p l i f i e d , c l o n e d , s e qu e n c e d , a n d p h y l o g e n e t i c a l l y p l a c e d . A n a p l a s m a s a r e r e l a t e d t o t h e g e n e r a
R i c k e t t s i a a n d E h r l i c h i a . I n a d d i t i o n , 1 6 S r DN A s f r o m s e v e r a l s p e c i e s we r e r e a d i l y a m p l i f i e d f r o m m a t e r i a l
f o u n d i n l y o p h i l i z e d a m p o u l e s f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n . B y u s e o f t h i s m e t h o d , t h e
p h y l o g e n e t i c s t u d y o f e x t r e m e l y f a s t i d i o u s o r h i g h l y p a t h o g e n i c b a c t e r i a l s p e c i e s c a n b e c a r r i e d o u t wi t h o u t t h e
n e e d t o c u l t u r e t h e m . I n t h e o r y , a n y g e n e s e g m e n t f o r wh i c h p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n p r i m e r d e s i g n i s
p o s s i b l e c a n b e d e r i v e d f r o m a r e a d i l y o b t a i n a b l e l y o p h i l i z e d b a c t e r i a l c u l t u r e .
T h e c o m p a r i s o n o f r R N A s e qu e n c e s i s a p o we r f u l t o o l f o r
d e d u c i n g p h y l o g e n e t i c a n d e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p s a m o n g
b a c t e r i a , a r c h a e b a c t e r i a , a n d e u c a r y o t i c o r g a n i s m s . T h e s e
s e qu e n c e s h a v e b e e n d e r i v e d p r e v i o u s l y b y m e t h o d s i n c l u d -
i n g o l i g o n u c l e o t i d e c a t a l o g i n g ( 6 ) , s e qu e n c i n g o f c l o n e s ,
d i r e c t s e qu e n c i n g o f R N A b y u s i n g r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e
( 1 1 ) , a n d s e qu e n c i n g o f m a t e r i a l a m p l i f i e d b y p o l y m e r a s e
c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) ( 3 , 5 , 1 5 ) . T h e p r e s e n t s t u d y e x p a n d s
o n t h e u s e o f DN A a m p l i f i c a t i o n t e c h n o l o g y f o r t h e s t u d y o f
r R N A s e qu e n c e s wi t h i n t h e e u b a c t e r i a . S e v e r a l p r i m e r s a r e
d e s c r i b e d , a n d n o v e l m e t h o d s f o r t h e i r u s e a r e p r e s e n t e d .
S o g i n a n d c o wo r k e r s ( 1 5 ) d e s c r i b e d a p r i m e r p a i r f o r t h e
e n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n o f e u c a r y o t i c s m a l l - s u b u n i t r R N A
g e n e ( r DN A ) s e qu e n c e s . B o e t t g e r ( 3 ) a n d E d wa r d s a n d
c o wo r k e r s ( 5 ) e x a m i n e d t h e s e qu e n c e o f M y c o b a c t e r i u m
b o v i s 1 6 S r R N A P C R p r o d u c t s wi t h o u t c l o n i n g . T h e y a l s o
e x a m i n e d a l i m i t e d s e t o f o r g a n i s m s wi t h t h e i r P C R p r i m e r s :
f o u r g a m m a p u r p l e b a c t e r i a a n d t wo g r a m - p o s i t i v e s p e c i e s
wi t h h i g h G +C c o n t e n t we r e e x p e r i m e n t a l l y a m p l i f i e d .
T h e p r e s e n t s t u d y d e s c r i b e s p r i m e r s f o r t h e a m p l i f i c a t i o n
o f m o s t e u b a c t e r i a l 1 6 S r R N A s , d e t a i l s p r e p a r a t i o n o f s a m -
p l e s , a n d p r e s e n t s o u r c u r r e n t s e qu e n c i n g p r o c e d u r e s .
M A T E R I A L S A N D M E T HO DS
N u c l e i c a c i d p r e p a r a t i o n . G e n o m i c DN A s we r e p r e p a r e d
b y u s i n g s t a n d a r d m e t h o d s ( 1 3 , 1 4 ) . P r e p a r a t i o n o f DN A
f r o m l y o p h i l i z e d a m p o u l e s c o n s i s t e d o f s u s p e n d i n g t h e l y -
o p h i l i z e d c e l l s i n 0 . 2 m l o f 1 0 m M T r i s h y d r o c h l o r i d e ( p H
8 . 3 ) - 2 . 5 m M M g C l 2 - 5 0 m M KC l . T h i s wa s a d d e d t o a p p r o x -
i m a t e l y 0 . 1 m l o f 0 . 1 - m m - d i a m e t e r a c i d - wa s h e d g l a s s b e a d s ,
1 0 , u o f 2 0 % s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e , a n d a p p r o x i m a t e l y 2 0 0
R I
o f p h e n o l , s a t u r a t e d wi t h t h e a b o v e b u f f e r . T h i s s a m p l e
wa s s h a k e n i n a 5 0 0 - , u m i c r o c e n t r i f u g e t u b e , s e a t e d wi t h i n a
2 - m l t u b e , i n a M i n i - B e a d B e a t e r ( B i o s p e c P r o d u c t s ) f o r 2
m i n . A f t e r p h a s e s e p a r a t i o n ( 1 0 m i n a t a p p r o x i m a t e l y 1 5 , 0 0 0
x g ) , t h e a qu e o u s p h a s e wa s e t h a n o l p r e c i p i t a t e d . T h e p e l l e t
wa s s u s p e n d e d i n 2 0 t o 5 0
R I
o f T E b u f f e r ( 1 0 m M T r i s
h y d r o c h l o r i d e [ p H 8 . 0 ] , 1 m M E DT A ) , a n d b e t we e n 2 a n d
*
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
5 % o f t h i s r e s u s p e n d e d DN A wa s p u t i n t o t h e P C R a m p l i f i -
c a t i o n .
P C R a m p l i f i c a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f p r o d u c t . A p p r o x i -
m a t e l y 1 t o 3 , u g o f g e n o m i c DN A wa s a m p l i f i e d i n a 1 0 0 - p u
r e a c t i o n b y u s i n g t h e G e n e a m p k i t ( U . S . B i o c h e m i c a l s ,
C l e v e l a n d , O h i o ; p r e s e n t l y , t h e s e k i t s a r e o n l y a v a i l a b l e
f r o m P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r wa l k , C o n n . ) . Wh e n t h e l y -
o p h i l i z e d a m p o u l e DN A wa s a m p l i f i e d , 1 p l I wa s r o u t i n e l y
u s e d . C o n d i t i o n s c o n s i s t e d o f 2 5 t o 3 5 c y c l e s o f 9 5 C ( 2 m i n ) ,
4 2 C ( 3 0 s ) , a n d 7 2 C ( 4 m i n ) , p l u s o n e a d d i t i o n a l c y c l e wi t h
a f i n a l 2 0 - m i n c h a i n e l o n g a t i o n . T h e t e m p e r a t u r e a n d s a l t
c o n d i t i o n s we r e n o t o p t i m i z e d f o r l o w i n p u t s o f t e m p l a t e
DN A . B e t we e n 2 5 a n d 3 5 c y c l e s , t h e n u m b e r o f c y c l e s d i d
n o t s e e m t o a p p r e c i a b l y a f f e c t y i e l d o f p r o d u c t . A l l a m p l i f i -
c a t i o n s we r e p e r f o r m e d i n a P e r k i n - E l m e r t e m p e r a t u r e c o n -
t r o l l e r , a l t h o u g h a c u r s o r y e x a m i n a t i o n o f o t h e r i n s t r u m e n t s
i n d i c a t e d t h a t t h e y m a y a l l p e r f o r m a d e qu a t e l y u n d e r t h e s e
r e a c t i o n c o n d i t i o n s ( d a t a n o t s h o wn ) . T h e a m p l i f i c a t i o n
p r o d u c t s we r e p u r i f i e d o n C e n t r i c o n 1 0 0 c o l u m n s ( A m i c o n ) ,
b y f o l l o wi n g t h e s p e c i f i c a t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r , f o l l o we d
b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n .
C l o n i n g . C l o n i n g o f P C R p r o d u c t s wa s d o n e b y u s i n g
s t a n d a r d m e t h o d s ( 1 3 ) . A m p l i f i e d p r o d u c t s we r e p a r t i a l l y
p u r i f i e d wi t h s p i n c o l u m n s ( s e e a b o v e ) , c l e a v e d a t t h e
a p p r o p r i a t e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s i t e s wi t h i n t h e l i n k e r s
( s e e T a b l e 1 a n d Fi g . 1 ) a n d l i g a t e d i n t o c o r r e s p o n d i n g l y
r e s t r i c t e d p G E M - 3 o r p G E M - 4 v e c t o r s ( P r o m e g a C o r p . ,
M a d i s o n , Wi s . ) . We we r e a b l e t o s u c c e s s f u l l y c l o n e r DN A s
t h a t h a d b e e n e i t h e r a g a r o s e g e l p u r i f i e d o r n o t g e l p u r i f i e d .
P l a s m i d p r e p a r a t i o n wa s p e r f o r m e d b y u s i n g t h e a l k a l i n e
l y s i s m e t h o d ( 2 , 1 3 ) f o l l o we d b y p h e n o l e x t r a c t i o n . Fo r
c l o n i n g o f P C R p r o d u c t s i n t o p l a s m i d v e c t o r s , a p p r o x i -
m a t e l y 2 0 , g o f p l a s m i d DN A r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e c u t
wi t h a c o m b i n a t i o n o f S a l I a n d B a m HI ( r a r e l y f o u n d i n t e r -
n a l l y wi t h i n 1 6 S ) wa s d e p h o s p h o r y l a t e d wi t h c a l f i n t e s t i n a l
a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , g e l p u r i f i e d , a n d s t o r e d f r o z e n . T h i s
v e c t o r p r e p a r a t i o n s h o u l d b e e n o u g h f o r 2 0 o r m o r e c l o n i n g
e x p e r i m e n t s . A n a p l a s m a m a r g i n a l e r DN A wa s c l o n e d i n t o
t h e S a l I - B a m HI s i t e i n t h i s m a n n e r .
S e qu e n c i n g m e t h o d s . T h e s e qu e n c i n g m e t h o d o f p l a s m i d -
c l o n e d m a t e r i a l u s e d t h e T 7 p o l y m e r a s e ( S e qu e n a s e ; U . S .
B i o c h e m i c a l s ) k i t , a n d s t a n d a r d p r o c e d u r e s we r e f o l l o we d
6 9 7
6 9 8 WE I S B U R G E T A L . J . B A C T E R I O L .
T A B L E 1 . S u m m a r y o f p r i m e r s f o r t h e P C R a m p l i f i c a t i o n o f e u b a c t e r i a l 1 6 S r DN A a
P r i m e r S e qu e n c e ( 5 ' t o 3 ' ) De s i g n e d f o r :
f Dl c c g a a t t c g t c g a c a a c A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G M o s t e u b a c t e r i a
f D2 c c g a a t t c g t c g a c a a c A G A G T T T G A T C A T G G C T C A G E n t e r i c s a n d r e l a t i v e s
f D3 c c g a a t t c g t c g a c a a c A G A G T T T G A T C C T G G C T T A G B o r r e l i a s p i r o c h e t e s
f D4 c c g a a t t c g t c g a c a a c A G A A T T T G A T C T T G G T T C A G
C h l a m y d i a e
r Dl c c c g g g a t c c a a g c t t A A G G A G G T G A T C C A G C C M a n y e u b a c t e r i a
r P l c c c g g g a t c c a a g c t t A C G G T T A C C T T G T T A C G A C T T E n t e r i c s ( a n d m o s t e u b a c t e r i a )
r P 2 c c c g g g a t c c a a g c t t A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T T M o s t e u b a c t e r i a
r P 3 c c c g g g a t c c a a g c t t A C G G A T A C C T T G T T A C G A C T T Fu s o b a c t e r i a ( a n d m o s t e u b a c t e r i a )
a
P r i m e r a b b r e v i a t i o n s : f , f o r wa r d ; r , r e v e r s e ; D, d i s t a l ; P , p r o x i m a l . A l l p r i m e r s e qu e n c e s a r e p r e s e n t e d i n 5 ' t o 3 ' o r i e n t a t i o n . L i n k e r s e qu e n c e s c o n t a i n i n g r e s t r i c t i o n
s i t e s f o r c l o n i n g a r e d e s i g n a t e d i n l o we r c a s e l e t t e r s . T h e " f
'
s e r i e s o f l i n k e r s a l l c o n t a i n E c o R I a n d S a l I s i t e s , a n d t h e " r " s e r i e s a l l c o n t a i n Hi n d I J l , B a m HI , a n d Xm a I
r e c o g n i t i o n s e qu e n c e s . R e v e r s e p r i m e r s p r o d u c e s e qu e n c e s c o m p l i m e n t a r y t o t h e r R N A . P r i m e r s r P l , r P 2 , a n d r P 3 a r e i d e n t i c a l e x c e p t f o r t h e 1 7 t h b a s e f r o m t h e 3 '
e n d . U n d e r m o s t a m p l i f i c a t i o n c o n d i t i o n s , t h e y s h o u l d b e f u n c t i o n a l l y e qu i v a l e n t . P r i m e r r P 2 h a s t h e s e qu e n c e c o r r e s p o n d i n g t o t h e g r e a t e s t d i v e r s i t y o f b a c t e r i a .
C O N S =9 0 % A G A G U U U G A U C U G G C U C A G G A A C G C U G G C G G - G C U A A C A U G C A A G U C G C G
E . c o l i A A A U U G A A G A G U U U G A U C A U G G C U C A G A U U G A A C G C U G G C G G C A - - G G C C U A A C A C A U G C A A G U C G A A C G G U A A C A G G A A G A A G C U U G C
A n . m a r g i a g a g u u u g a u c c u g g c u c a g A A C G A A C G C U G G C G G C A - A G C U U A A C A C A U G C A A G U C G A A C G G A C C G U A U A C G C A G C U U G C
f Dl 5 ' c c a a t t c g t c g a c a a c A G A G T T G A T C C T G G C T C A G - 3 '
( e x t e n d ) >
f D2 5 ' c c qa a t t c g t c g a c a a c A G A G T I T G A T C A T G G C T C A G - 3 ' ( e x t e n d ) - - - - >
f D3 5 ' c c qa a t t c g t c g a c a a c A G A G T l ' G A T C C T G G C T r A G - 3 ' ( e x t e n d ) - - - - >
f D4 5 ' c c qa a t t c g t c g a c a a c A G A A T T G A T C ' I T G G T T C A G - 3 ' ( e x t e n d ) - - - - >
C O N S =9 0 % G G G C A C G G G U G G U A A U A U C C G G A A C G A A A U A A U A C C A U
E . c o l i U U C U U U G C U G A C G A G U G G C G G A C G G G U G A G U A A U G U C U G G G A A A C U G C C U G A U G G A G G G G G A U A A C U A C U G G A A A C G G U A G C U A A U A C C G C A U A A C G U C G
A n . z u a r g i U G C G U G U A U G G U U A G U G G C A G A C G G G U G A G U A A U G C A U A G G A A U C U A C C U A G U A G U A U G G G A U A G C C A C U A G A A A U G G U G t G U A A U A C U G U A U A A U C C U G
C O N S =9 0 % A A A G G A A U A G U G U U G G G G U A A G G C A C C A A G C A G A U
E . c o l i C A A G A C C A A A G A G C G G G A C C U U C G G G C C U C U U G C C A U C G G A U G U G C C C A G A U G G G A U U A G C U A G U A G G U G G G G U A A C G G C U C A C C U A G G C G A C G A U C C C U
A n . m a r qi C - G G G G G A A A G A - - - - - - - - U U U A - - - - - U C G C U A U U A G A U G A G C C U A U G U C A G A U U A G C U A G U U G G U G G G G U A A U G G C C U A C C A A G G C G G U G A U C U G U
C O N S =9 0 % A C G C U G A G A G G G A C G C A C A U G G A C U G A G A C A C G G C C A A C U C C U A C G G G A G G C A G C A G U G G A A U U U C A A U G G G A A C U
E . c o l i A G C U G G U C U G A G A G G A U G A C C A G C C A C A C U G G A A C U G A G A C A C G G U C C A G A C U C C U A C G G G A G G C A G C A G U G G G G A A U A U U G C A C A A U G G G C G C A A G C C U
A n . m a r g i A G C U G G U C U G A G A G G A U G A U C A G C C A C A C U G G A A C U G A G A C A C G G U C C A G A C U C C U A C G G G A G G C A G C A G U G G G G A A U A U U G G A C A A U G G WG C A A G C C U
C O N S =9 0 % G A A G C A G C C G C G U G G A G A G U G G G U A A A C U U G A G U G A C U A
E . c o l i G A U G C A G C C A U G C C G C G U G U A U G A A G A A G G C C U U C G G G U U G U A A A G U A C U U U C A G C G G G G A G G A A G G G A G U A A A G U U A A U A C C U U U G C U C A U U G A C G U U A
A n . m a r g i G A U C C A G C U A U G C C G C G U G A G U G A G G A A G G C C U U A G G G U U G U A M A A C U C U U U C A G U A G G G A A G A U -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - M U G A C G G U A
C O N S =9 0 % A A A G C C G G C U A A C U G U G C C A G C A G C C G C G G U M U A C A G G G C A G C G U U C G G A U A U G G G C G U A A A G G G A G G G
E . c o l i C C C G C A G A A G A A G C A C C G G C U A A C U C C G U G C C A G C A G C C G C G G U A A U A C G G A G G G U G C A A G C G U U A A U C G G M U U A C U G G G C G U A A A G C G C A C G C A G G C G
A n . m a r g i C C U A C A G A A G A A G U C C C G G C A A A C U C C G U G C C A G C A G C C G C G G U A A U A C G G A G G G G G C A A G C G U U G U U C G G A M U A U U G G G C G U A A A G G G C A U G U A G G C G
C O N S =9 0 % G A G U G G U A A A G C U A A C A A C C U G A A G G G G A A U U G U G U A
E . c o l i G U U U G U U A A G U C A G A U G U G A A A U C C C C G G G C U C A A C C U G G G A A C U G C A U C U G A U A C U G G C A A G C U U G A G U C U C G U A G A G G G G G G U A G A WU U C C A G G U G U A
A n . m a r g i G U U U G G U A A G U U A A A G G U G A A A U A C C A G G G C U U A A C C C U G G G G C U G C U U U U A A U A C U G C A G G A C U A G A G U C C G G A A G A G G A U A G C G G A A U U C C U A G U G U A
C O N S =9 0 % G G G U G A M U C G U A G A A U A G A A A C C U G C G A A G G C C U G G A U G A C C U A G C G A M G C G U G G G G A G C M C A G A
E . c o l i G C G G U G A A A U G C G U A G A G A U C U G G A G G A A U A C C G G U G G C G A A G G C G G C C C C C U G G A C G M G A C U G A C G C U C A G G U G C G A M G C G U G G G G A G C A M C A G G A
A n . m a r g i G A G G U G A A A U U C G U A G A U A U U A G G A G G A A C A C C A G U G G C G A A G G C G G C U G U C U G G U C C G G U A C U G A C G C U G A G G U G C G A A A G C G U G G G G A G C A A A C A G G A
C O N S =9 0 WU A G A U A C C C U G G U A G U C C A C G C U A A A C G A U G U G U G G A G A A C G C U A A C C G C C U G G G
E . c o l i U U A G A U A C C C U G G U A G U C C A C G C C G U A A A C G A U G U C G A C U U G G A G G U U G U G C C C U U G A G G C G U G G C U U C C G G A G C U A A C G C G U U A A G U C G A C C G C C U G G G
A n . m a r qi U U A G A U A C C C U G G U A G U C C A C G C U G U A A A C G A U G A G U G C U G A A U G U WG G G C - U U U U - - G C C U WG U G WG U A g c U A A C G C G WA A G C A C U C C G C WG G G
C O N S =9 0 % A G U A C G C G C A A G U A A A C U C A A A G A A U U G A C G G G G C C C G C A C A A G C G G G G A G A U G U G G U U U A A U U C G A G A C G C G G A A C C U U A C C
E . c o l i G A G U A C G G C C G C M G G U U A A A A C U C A A A U G A A U U G A C G G G G G C C C G C A C A A G C G G U G G A G C A U G U G G U U U A A U U C G A U G C A A C G C G A A G A A C C U U A C C U G
A n . m a r g i G A C U A C G G U C G C A A G A C U A M A C U C A A A G G A A U U G A C G G G G A C n C G C A C A A G C G G U G G A G C A U G U G G U U U A A U U C G A U G C A A C G C G A A A A A C C WA C C A C
C O N S =9 0 % U U G A C A U - G A A - - A C A G G U G U G C A U G G U G U C G U C A G C U C G U G C G U G A G U
E . c o l i G U C U U G A C A U C C A C G G A A - G U U U U C A - G A G A U G A G A A U - G U G C C WC G - G G A A C C G U G A G A C A G G U G C U G C A U G G C U G U C G U C A G C U C G U G WG U G A A A U
A n . m a r g i U U C U U G A C A U G G A G G C U A G A U C C U U C U U A A C A G A A G G G C G - C A G U U C G G C U G G G C C U C G C A C A G G U G C U G C A U G G C U G U C G U C A G C U C G U G U C G U G A G A U
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C O N S - 9 0 % G G G A G A C G U C A A U C U C A U G C C C U U A G G G G C U A C A C A C G U C U A C A A U G G A C A G G G C A G G A A G C A A C
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C O N S - 9 0 % A A A U C A G U C G G A U G C U G C A A C U C G C U G M G G G A U G C U A G U A A U C G A U C A G A C G G U G A A U A C G U U C
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C O N S =9 0 % C G G G C U U G U A C A C A C C G C C C G U C A C A G A G A A G A A C C G G A C A G U G
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A n . s u a r g i U C G G G U C U U G U A C A C A C U G C C C G U C A C G C C A U G G G M U U G G C U U C U C G A A G C U G G U G C G C C A A C C G U M A G G A G G C A G C C A U U U A A G G U U G G G U C G G U G
C O N S =9 0 % A U G G G A A G U C G U A A C A A G G U A C C U A G A A U G G G U G G A U A C C U C C U U U
E . c o l l A C U G G G G U G A A G U C G U A A C A A G G U A A C C G U A G G G G A A C C U G C G G U U G G A U C A C C U C C U U A
A n . a r g i A C U G G G G U G A A G U C G U A A C A A G G U A G C U G U A G G U G A A C C U G C g g c u qg a u c a c c u c c u u
r Dl ( - - - - ( e x t e n d ) 3 ' - C C G A C C T A G T G G A G G A A t t c g a a c c t a g qg c c c 5 '
r P l <- - - - 3 ' - T T C A G C A T T G T T C C A T T G C A t t c g a a c c t a a a g c c c - 5 '
r P 2 ( - - - - 3 ' - T T C A G C A T T G T T C C A T C G G C A t t c g a a c c t a qg qc c c - 5 '
r P 3 <- - - - 3 ' - T T C A G C A T T G T T C C A T A G G C A t t c g a a c c t a g g g c c c - 5 '
1 6 S r DN A A M P L I FI C A T I O N 6 9 9
T A B L E 2 . P r i m e r c o m b i n a t i o n s t h a t h a v e b e e n p r o v e n t o
p r o d u c e a n a p p r o x i m a t e l y l , 5 0 0 - b p f r a g m e n t
S p e c i e s P r i m e r p a i r
N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
C o x i e l l a b u r n e t i i . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
A n a p l a s m a m a r g i n a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
N e i s s e r i a m e n i n g i t i d i s . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
B a c t e r o i d e s f r a g i l i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . f D + r P 2
B o r r e l i a b u r g d o r f e r i . . . . . . . . . . . . . . . . . . f D3 + r Dl
B o r r e l i a h e r m s i i . . . . . . . . . . . . . . . . . . f D3 + r Dl
C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
M y c o p l a s m a p n e u m o n i a e . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r P l
M y c o p l a s m a h o m i n i s . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r P l
M y c o p l a s m a g e n i t a l i u m . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r P l
U r e a p l a s m a u r e a l y t i c u m . . . . . . . . . . . . . . . . . i f D + r P l
C a m p y l o b a c t e r j e j u n i . . . . . . . . . . . . . . . . . i t D + r P l
S h i g e l l a f l e x n e r i . . . . . . . . . . . . . . . . . f D2 + r P l
S h i g e l l a s o n n e i . . . . . . . . . . . . . . . . . f D2 + r P l
C h l a m y d i a p s i t t a c i . . . . . . . . . . . . . . . . . . f 4 + r Dl
C h l a m y d i a t r a c h o m a t i s . . . . . . . . . . . . . . . . . f 4 + r Dl
C h l a m y d i a p n e u m o n i a e . . . . . . . . . . . . . . . . . f 4 + r Dl
M y c o b a c t e r i u m b o v i s . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a . . . . . . . . . . . . . . . . . f Dl + r Dl
( 1 ; s e e S e qu e n a s e p a c k a g e i n s e r t ) , i n c l u d i n g t h e a l k a l i n e
d e n a t u r a t i o n m e t h o d r e c o m m e n d e d b y t h e m a n u f a c t u r e r .
Fo r s e qu e n c i n g o f a m p l i f i e d m a t e r i a l d i r e c t l y , f o u r i d e n t i -
c a l
1 0 0 - R I
a m p l i f i c a t i o n r e a c t i o n s we r e p e r f o r m e d o n e a c h
s a m p l e , wi t h t h e r e s u l t a n t m a t e r i a l b e i n g p o o l e d a n d p u r i f i e d
( s e e a b o v e ) . A 5 0 0 - n g a m o u n t o f t e m p l a t e ( a m p l i f i c a t i o n
p r o d u c t ) wa s c o m b i n e d wi t h 1 0 n g o f p r i m e r , 2 , u l o f
S e qu e n a s e b u f f e r , a n d wa t e r t o 1 0 , u l . T h i s s a m p l e wa s h e l d
a t 9 8 C f o r 7 m i n a n d c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 m i n ,
a n d t h e n t h e l a b e l i n g r e a c t i o n wa s p e r f o r m e d a t e i t h e r r o o m
t e m p e r a t u r e o r 3 7 C f o r 5 m i n . ( T h e s e a r e s l i g h t m o d i f i c a -
t i o n s o f t h e p r o c e d u r e s o u t l i n e d i n r e f e r e n c e 1 9 . ) C h a i n
e l o n g a t i o n wa s t e r m i n a t e d wi t h s a m p l e l o a d i n g b u f f e r , a n d
s e qu e n c i n g wa s p e r f o r m e d o n b u f f e r - g r a d i e n t g e l s ( 1 ) .
S e qu e n c i n g p r i m e r s . S e qu e n c i n g p r i m e r s u s e f u l f o r c o n -
s e r v e d r e g i o n s wi t h i n 1 6 S r DN A g e n e s , b o t h f o r wa r d a n d
r e v e r s e , h a v e b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 1 , 2 0 ) . Fo r wa r d
p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y s p a n n e d p o s i t i o n s ( E s c h e r i c h i a
c o l i n u m b e r s ) ( 4 ) a s f o l l o ws : 3 3 9 t o 3 5 7 , 7 8 5 t o 8 0 5 , 9 0 7 t o
9 2 6 , 1 3 9 1 t o 1 4 0 6 . R e v e r s e p r i m e r s i n c l u d e d 3 5 7 t o 3 4 2 , 5 3 6
t o 5 1 9 , 8 0 2 t o 7 8 5 , 9 2 6 t o 9 0 7 , 1 1 1 5 t o 1 1 0 0 , 1 4 0 6 t o 1 3 9 2 , a n d
1 5 1 3 t o 1 4 9 4 .
R E S U L T S A N D DI S C U S S I O N
P r i m e r s f o r 1 6 S r DN A g e n e a m p l i f i c a t i o n . T h e p r i m e r s
u s e d f o r a m p l i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l 1 6 S r DN A a r e d i s p l a y e d i n
T a b l e 1 a s we l l a s i n a n a l i g n e d f o r m a t i n Fi g . 1 . T h e i r
e m p i r i c a l a n d t h e o r e t i c a l u t i l i t y a r e d e s c r i b e d i n T a b l e s 2 a n d
3 . T h e i r i m p l i e d h y b r i d i z a t i o n i s m e a s u r e d a g a i n s t t h e c o l -
l e c t i o n o f c o m p l e t e 1 6 S r R N A s e qu e n c e s a v a i l a b l e t o u s a t
t h e p r e s e n t t i m e . I t wo u l d b e p o s s i b l e t o i n t r o d u c e n u c l e o -
t i d e a m b i g u i t i e s d u r i n g t h e DN A s y n t h e s i s o f t h e s e p r i m e r s
t o o b t a i n a s m a l l e r s e t o f p r i m e r s t h a t wo u l d wo r k o n
v i r t u a l l y a l l b a c t e r i a , a l t h o u g h i t i s l i k e l y t h a t t h i s wo u l d
c a u s e t h e a p p e a r a n c e o f s p u r i o u s a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s .
T h e
p r i m e r p a i r d e s i g n a t e d f Dl a n d r Dl i s
c a p a b l e o f
a m p l i f y i n g
a wi d e
v a r i e t y
o f b a c t e r i a l t a x a .
R e p l a c i n g r Dl
wi t h r P l e x t e n d s t h e d i v e r s i t y o f s p e c i e s e v e n f u r t h e r , b u t
f r o m t h e
p e r s p e c t i v e o f
a m p l i f y i n g t h e m a x i m u m n u m b e r o f
n u c l e o t i d e s o f 1 6 S
r DN A , r Dl i s p r e f e r a b l e ; i t i s c l o s e r t o t h e
3 ' e n d .
A m p l i f i c a t i o n o f 1 6 S r DN A s f r o m s e v e r a l d i f f e r e n t b a c t e -
r i a l t a x a
b y u s i n g
d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f p r i m e r s i s s h o wn
i n
Fi g .
2 . T h e P C R c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y we r e n o t
r i g o r o u s l y o p t i m i z e d f o r e i t h e r
s p e c i f i c i t y o r l o w- i n p u t t a r -
g e t .
I n
g e n e r a l ,
t h e s e c o n d i t i o n s s e e m t o
g i v e
a
d e p e n d a b l e
y i e l d o f f u l l - s i z e d
p r o d u c t . A d d i t i o n a l p r o d u c t s o f
v a r y i n g
i n t e n s i t i e s we r e p r o d u c e d f r o m s o m e o f t h e DN A s . A s
s h o wn i n
Fi g . 2 ,
t h e s m a l l e r - s i z e d b a n d p r o d u c e d f r o m
B a c t e r o i d e s
f r a g i l i s DN A , d e r i v e d f r o m b o t h c u l t u r e a n d
l y o p h i l i z e d a m p o u l e , i s t h e m o s t a b u n d a n t s p u r i o u s b a n d
wi t h i n t h e b a c t e r i a l s t r a i n s e x a m i n e d . T h e o c c u r r e n c e o f t h e
a d d i t i o n a l P C R
p r o d u c t i n B .
f r a g i l i s d i d n o t i n t e r f e r e wi t h
t h e
a b i l i t y t o c l o n e t h e 1 6 S r DN A . O f n o t e i s t h e f a c t t h a t t h e
o n l y
r e a c t i o n s h o wn i n wh i c h t h e r P 2
p r i m e r wa s u s e d wa s
t h e B .
f r a g i l i s a m p l i f i c a t i o n ; i n a n o t h e r
e x p e r i m e n t ( n o t
s h o wn ) , t h e s a m e s p u r i o u s b a n d wa s p r o d u c e d wh e n
p r i m e r
r P l wa s s u b s t i t u t e d f o r r P 2 .
A .
m a r g i n a l e 1 6 S r R N A . T o t e s t t h e u t i l i t y o f t h e s e
m e t h o d s f o r p h y l o g e n e t i c s t u d y , A . m a r g i n a l e , a m e m b e r o f
t h e R i c k e t t s i a l e s , wa s u s e d a s a n e x a m p l e . A . m a r g i n a l e i s
a n
o b l i g a t e i n t r a c e l l u l a r , e r y t h r o c y t i c , a r t h r o p o d - t r a n s m i t t e d
p a r a s i t e wh o s e
p a t h o g e n i c r a n g e i n c l u d e s s e v e r a l r u m i n a n t
s p e c i e s ( 1 6 ) . P r e v i o u s a t t e m p t s a t s e qu e n c i n g d i r e c t l y f r o m
t h e R N A i s o l a t e d f r o m R e n o g r a f i n - p u r i f i e d A .
m a r g i n a l e
c e l l s
( s u p p l i e d b y J . S a m u e l , P u l l m a n , Wa s h . ) we r e u n s u c -
c e s s f u l
( d a t a n o t
s h o wn ) . A t t e m p t s a t c l o n i n g i n t o l a m b d a
p h a g e v e c t o r s a l s o we r e wi t h o u t s u c c e s s . A DN A
p r e p a r a -
t i o n ( b y s t a n d a r d p h e n o l m e t h o d s ) ( 1 3 , 1 4 ) f r o m t h i s s a m e
g r a d i e n t - p u r i f i e d m a t e r i a l wa s u s e d f o r a m p l i f i c a t i o n . B y
u s i n g t h e g e n e r a l l y a p p l i c a b l e p r i m e r p a i r , f Dl +
r Dl ,
a m p l i f i c a t i o n o f t h e 1 6 S r DN A o f A . m a r g i n a l e wa s e n a b l e d .
T h e 1 6 S r R N A
s e qu e n c e d e t e r m i n e d f o r A . m a r g i n a l e i s
s h o wn i n
Fi g . 1 , a l i g n e d wi t h E . c o l i a n d wi t h t h e
p r i m e r s .
A p p r o x i m a t e l y 2 5 0 n u c l e o t i d e s o f s e qu e n c e we r e
i n i t i a l l y
d e t e r m i n e d d i r e c t l y f r o m P C R - a m p l i f i e d m a t e r i a l b y u s i n g a
p r i m e r l o c a t e d a t p o s i t i o n 5 1 9 ( E . c o l i n u m b e r s ) ( 4 ) , r e a d i n g
t o wa r d t h e 5 ' e n d o f t h e m o l e c u l e . A f t e r c l o n i n g t h e a m p l i -
f i c a t i o n p r o d u c t i n t o a p G E M v e c t o r , t h a t s a m e
s e qu e n c e
wa s a g a i n d e t e r m i n e d t o v a l i d a t e t h e a c c u r a c y o f t h e d i r e c t
s e qu e n c i n g , wi t h o u t d i s a g r e e m e n t . A l i g n i n g t h e
s e qu e n c e
wi t h t h e a c c e p t e d s e c o n d a r y s t r u c t u r e ( 8 , 2 5 ) i n d i c a t e d a
d e l e t e d h e l i x wi t h i n t h e 4 5 5 t o 4 8 0 r e g i o n ( E . c o l i
n u m b e r s )
( 4 ) c h a r a c t e r i s t i c o f a f e w b a c t e r i a l g r o u p s ( 8 , 2 5 ) . T h e
c o m p l e t e A . m a r g i n a l e 1 6 S r R N A s e qu e n c e wa s d e t e r m i n e d
f r o m t h e c l o n e d a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t . T h e s t r u c t u r e o f t h e
h e l i c e s b e t we e n p o s i t i o n s 1 8 0 a n d 2 2 0 ( E . c o l i n u m b e r s ) ( 4 )
s t r o n g l y s u g g e s t e d t h a t t h i s wa s a m e m b e r o f t h e a l p h a
s u b d i v i s i o n o f t h e p u r p l e b a c t e r i a . S i m i l a r i t y a n d e v o l u t i o n -
a r y d i s t a n c e d a t a ( T a b l e 4 ) p r o v e A . m a r g i n a l e t o b e r e l a t e d
t o o t h e r R i c k e t t s i a l e s wi t h i n t h e a l p h a s u b d i v i s i o n o f t h e
p u r p l e b a c t e r i a ( 1 9 , 2 1 ) , s p e c i f i c a l l y r e l a t e d t o t h e g e n e r a
R i c k e t t s i a a n d E h r l i c h i a ( 1 9 ) . A p h y l o g e n e t i c t r e e d i s p l a y i n g
t h i s t h r e e - wa y r e l a t i o n s h i p i s s h o wn i n Fi g . 3 .
FI G . 1 . S e qu e n c e a l i g n m e n t o f t h e a m p l i f i c a t i o n p r i m e r s wi t h 1 6 S r R N A s o f E . c o l i , A . m a r g i n a l e , a n d a e u b a c t e r i a l c o n s e n s u s s e qu e n c e .
T h e c o n s e n s u s s h o ws p o s i t i o n s t h a t a r e g r e a t e r t h a n 9 0 % c o n s e r v e d f o r a p h y l o g e n e t i c a l l y d i v e r s e c o l l e c t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 8 5 b a c t e r i a l
s e qu e n c e s .
V O L . 1 7 3 , 1 9 9 1
7 0 0 WE I S B U R G E T A L .
P r i m e r
f D2
f D3
f D4
r Dl
r P l , r P 2 , o r r P 3 ( p r o b a b l y a l l
f u n c t i o n a l l y e qu i v a l e n t )
T A B L E 3 . T h e o r e t i c a l s p e c i f i c i t y o f a m p l i f i c a t i o n p r i m e r s f o r 1 6 S r DN A
P h y l o g e n e t i c g r o u p i n g a n d g e n e r a wh i c h s h o u l d a m p l i f y wi t h i n d i c a t e d p r i m e r '
G r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a a n d r e l a t i v e s
B a c i l l u s , C l o s t r i d i u m , S t a p h y l o c o c c u s , L i s t e r i a , L a c t o b a c i l l u s , S t r e p t o c o c c u s , M y c o p l a s m a , S p i -
r o p l a s m a , U r e a p l a s m a , A c h o l e p l a s m a , E r y s i p e l o t h r i x , Fu s o b a c t e r i u m , A r t h r o b a c t e r , M y c o -
b a c t e r i u m , S t r e p t o m y c e s
P u r p l e b a c t e r i a a n d r e l a t i v e s ( p r o t e o b a c t e r i a )
R o c h a l i m a e a , B r u c e l l a , R h o d o p s e u d o m o n a s , A g r o b a c t e r i u m , R h o d o s p i r i l l u m , P s e u d o m o n a s ,
N e i s s e r i a , C a u l o b a c t e r , M y x o c o c c u s , C a m p y l o b a c t e r , R i c k e t t s i a , E h r l i c h i a
C y a n o b a c t e r i a
A n a c y s t i s ( S y n e c h o c o c c u s )
B a c t e r o i d e s l f l a v o b a c t e r i a
B a c t e r o i d e s , Fl a v o b a c t e r i u m
De i n o c o c c u s a n d r e l a t i v e s
De i n o c o c c u s , T h e r m u s
S p i r o c h e t e s
T r e p o n e m a , S p i r o c h a e t a
P l a n c t o m y c e s a n d r e l a t i v e s
P l a n c t o m y c e s
C h l o r o b i u m - g r e e n s u l f u r b a c t e r i a
C h l o r o b i u m
T h e r m o t o g a
T h e r m o t o g a
E n t e r i c m e m b e r s o f g a m m a s u b d i v i s i o n o f p r o t e o b a c t e r i a
E s c h e r i c h i a , S h i g e l l a , S a l m o n e l l a , S e r r a t i a , E r wi n i a , a n d C i t r o b a c t e r , e t c . ( a l l t h e e n t e r i c s ) ;
O c e a n o s p i r i l l u m , Ha e m o p h i l u s , A c t i n o b a c i l l u s , V i b r i o , P a s t e u r e l l a
S p i r o c h e t e s o f t h e g e n u s B o r r e l i a
G e n u s C h l a m y d i a
P u r p l e b a c t e r i a a n d r e l a t i v e s ( p r o t e o b a c t e r i a )
P s e u d o m o n a s , N e i s s e r i a , R o c h a l i m a e a ,
A g r o b a c t e r i u m , M y x o c o c c u s , De s u l f o v i b r i o
G r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a a n d r e l a t i v e s
B a c i l l u s , S t a p h y l o c o c c u s , A r t h r o b a c t e r , S t r e p t o m y c e s ,
M y c o b a c t e r i u m , He l i o b a c t e r i u m
C y a n o b a c t e r i a
A n a c y s t i s ( S y n e c h o c o c c u s )
S p i r o c h e t e s
T r e p o n e m a , L e p t o s p i r a
P l a n c t o m y c e s
P l a n c t o m y c e s
C h l o r o b i u m
C h l o r o b i u m
T h e r m o t o g a
T h e r m o t o g a ( p l u s s e l e c t e d a r c h a e b a c t e r i a )
S h o u l d p r i m e a l l b a c t e r i a , p l u s p l a n t m i t o c h o n d r i a , c h l o r o p l a s t s , a r c h a e b a c t e r i a , a n d Di c t y o s t e l i u m ,
b u t n o t y e a s t s o r v e r t e b r a t e s
a
P r i m e r s a r e c o n s i d e r e d a p p l i c a b l e i f t h e r e i s a p e r f e c t m a t c h f o r a p p r o x i m a t e l y 1 5 b a s e s a t t h e 3 ' e n d o f t h e p r i m e r . T h e l i s t i s d e f i n i t i v e o n l y i n t h e s e n s e t h a t
t h e t a x a m e n t i o n e d r e p r e s e n t t h e s e qu e n c e s a v a i l a b l e t o t h e a u t h o r s . T h e a b s e n c e o f a g e n u s f r o m t h e l i s t d o e s n o t i m p l y t h a t t h e p r i m e r wi l l n o t wo r k . B e c a u s e
t h e m a j o r i t y o f t h e a v a i l a b l e r R N A s e qu e n c e s a r e d e r i v e d f r o m d i r e c t s e qu e n c i n g o f r R N A s wi t h r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , t h e r e i s f a r l e s s i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e a b o u t
t h e 3 ' e n d o f t h e 1 6 S . I n s o m e c a s e s , t h e i n d i c a t e d g e n u s i s r e p r e s e n t e d b y n u m e r o u s s p e c i e s ; i n o t h e r c a s e s t h e i n d i c a t e d g e n u s i s r e p r e s e n t e d b y o n l y o n e . T h e
s e qu e n c e a l i g n m e n t f r o m wh i c h t h e s e d a t a we r e d e r i v e d i s u n p u b l i s h e d ( 1 2 , 2 4 ) . P h y l o g e n e t i c g r o u p i n g s a r e t h o s e o f Wo e s e ( 2 3 ) .
A . m a r g i n a l e h a s h i s t o r i c a l l y b e e n a d i f f i c u l t o r g a n i s m t o
s t u d y ( 1 6 ) b e c a u s e o f t h e l a c k o f a c u l t u r e s y s t e m . I t s
p h y l o g e n e t i c p l a c e m e n t , wh i c h wa s m a d e p o s s i b l e b y a m p l i -
f i c a t i o n wi t h b r o a d - s p e c i f i c i t y 1 6 S r DN A P C R p r i m e r s , h a s
i m p l i c a t i o n s wh i c h s h o u l d s h e d l i g h t o n t h e b i o l o g y o f t h i s
f a s t i d i o u s p a t h o g e n . M a n y p r o p e r t i e s f o u n d i n t h e g e n e r a
R i c k e t t s i a o r E h r l i c h i a , s u c h a s t h e u t i l i z a t i o n o f h o s t A T P
( 2 2 ) , m a y a l s o b e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e g e n u s A n a p l a s m a .
O b v i o u s l y , t h e s e qu e n c e o f t h e 1 6 S r R N A o f A . m a r g i n a l e
p r o v i d e s b a s i c i n f o r m a t i o n u s e f u l f o r d e s i g n i n g p r o b e s o r
P C R p r i m e r s s p e c i f i c f o r t h e d e t e c t i o n o f t h i s v e t e r i n a r y
p a t h o g e n .
A s s h o wn wi t h A . m a r g i n a l e , a p o t e n t i a l a d v a n t a g e o f t h i s
t e c h n o l o g y i n t h e s t u d y o f b a c t e r i a l p h y l o g e n y i s t h e a b i l i t y
t o wo r k wi t h r e l a t i v e l y s m a l l n u m b e r s o f c e l l s . T h i s a b i l i t y i s
o f g r e a t e s t u s e wh e n t h e t a r g e t s p e c i e s i s e i t h e r e x t r e m e l y
f a s t i d i o u s o r h i g h l y p a t h o g e n i c . I n t h e c a s e o f A . m a r g i n a l e ,
o b t a i n i n g s u f f i c i e n t m a t e r i a l f o r p h y l o g e n e t i c s t u d y wo u l d
h a v e r e qu i r e d t h e s a c r i f i c e o f s e v e r a l c o ws ; t h i s i s t h e o n l y
e s t a b l i s h e d c u l t u r e s y s t e m . I t i s a l s o h i g h l y d e s i r a b l e t o k e e p
c u l t u r e v o l u m e s s m a l l wh e n d e a l i n g wi t h h i g h l y i n f e c t i o u s
o r g a n i s m s s u c h a s r e s p i r a t o r y p a t h o g e n s .
1 6 S r DN A a m p l i f i e d f r o m A T C C l y o p h i l i z e d a m p o u l e s . O n e
o b v i o u s s o u r c e o f e i t h e r f a s t i d i o u s o r p a t h o g e n i c o r g a n i s m s
J . B A C T E R I O L .
1 6 S r DN A A M P L I FI C A T I O N 7 0 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
FI G . 2 . E t h i d i u m - b r o m i d e - s t a i n e d 0 . 7 5 % a g a r o s e
a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s . L a n e s : 1 , B . f r a g i l i s DN A ( f D1
p e r f r i n g e n s DN A ( f D1 + r D1 ) ; 3 , C . p s i t t a c i DN A ( f i
B . b u r g d o r f e r i DN A ( f D3 + r D1 ) ; 5 , l y o p h i l i z e d a m p o u
s a n g u i s DN A ( f D1 + r P 2 ) ; 6 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i N
DN A ( f f 1 + r P 2 ) ; 7 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i v e d C
DN A ( f f 1 + r D1 ) ; 8 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i v e d Y .
DN A ( f D2 + r P l ) ; 9 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i v e d P . A
( f D1 + r D1 ) ; 1 0 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i v e d M . s i n e
( f D1 + r P 1 ) ; 1 1 , l y o p h i l i z e d a m p o u l e - d e r i v e d M . p h l i e
r D1 ) ; 1 2 , Hi n d l l l d i g e s t o f l a m b d a p h a g e . L a b e l e d b
2 3 , 1 3 0 , 9 , 4 1 6 , 6 , 5 5 7 , 2 , 3 2 2 , a n d 2 , 0 2 7 b p .
wh i c h a r e i n v i a b l e c o n d i t i o n i s a c u l t u r e c o i l e d t
t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( A T C C ) .
t o t h e M a n u a l o f M e t h o d s f o r G e n e r a l B a c t e r i o
s t a n d a r d d o u b l e - v i a l l y o p h i l i z e d a m p o u l e c o n t a
c e l l s . De p e n d i n g o n t h e qu a n t i t a t i o n o f t h e i n p i
e x a m p l e , c o u n t i n g o f c e l l s i n t e r m s o f v i a b l e C I
g r o wt h p h a s e o f t h e p r e s e r v e d c e l l s , t h e r e c o u l d
f o l d m o r e g e n o m e s p r e s e n t i n t h e
l y o p h i l i z e 4
Fa c t o r i n g i n t h e m u l t i c i s t r o n i c n a t u r e o f r R N '
( s e v e n c o p i e s i n E . c o l i ) ( 1 0 ) c o n t r i b u t e s t o e ,
t a r g e t n u m b e r s a v a i l a b l e f o r g e n e a m p l i f i c a t i o n .
L y o p h i l i z e d a m p o u l e s o f v a r i o u s t y p e s f r o m C
we r e s e l e c t e d t o e x a m i n e t h e i r p o t e n t i a l t o y i e l d . I
wo u l d i n i t i a t e 1 6 S r DN A a m p l i f i c a t i o n . DN A s
A T C C d o u b l e - v i a l a n d s i n g l e - v i a l p r e p a r a t i o n s w
a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e f o l l o ,
we r e a m p l i f i e d wi t h t h e i n d i c a t e d p r i m e r p a i r ( Fi g . 2 ) :
S t r e p t o c o c c u s s a n g u i s A T C C 1 0 5 5 6 ( f D1 + r Dl ) , B . f r a g i l i s
2 3 1 K b p A T C C 2 5 2 8 5 ( f D1 + r P 2 ) , C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s A T C C
1 3 1 2 4 ( f D1 + r Dl ) , P e p t o s t r e p t o c o c c u s m a g n u s A T C C
9
K5
b p 2 9 3 2 8 ( f D1 + r Dl ) , Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a A T C C 2 3 7 1 5 ( f D2
+ r P l ) , M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s A T C C 1 4 4 6 8 ( f D1 +
2 . 3 K b p r P l ) , a n d M y c o b a c t e r i u m p h l e i A T C C 1 1 7 5 8 ( f D1 + r P l ) .
2 . O K b p T h e l a s t f o u r s p e c i e s l i s t e d a b o v e we r e a l s o a m p l i f i e d wi t h a
f o r wa r d p r i m e r s i m i l a r t o f D1 ; i t s r DN A - l i k e s e qu e n c e wa s
t h a t o f f Dl , b u t t h e l i n k e r wa s r e p l a c e d wi t h a T 7 p r o m o t e r
s e qu e n c e ( s e e d i s c u s s i o n o f t r a n s c r i p t i o n b e l o w) . T h e f a c t
t h a t Y . e n t e r o c o l i t i c a a m p l i f i e d wi t h t h i s p r i m e r s u g g e s t s
t h a t , u n d e r t h e r i g h t c o n d i t i o n s , o n e f o r wa r d a n d o n e o r t wo
r e v e r s e p r i m e r s m a y a m p l i f y a l m o s t a l l o f t h e e u b a c t e r i a l 1 6 S
r DN A s . A s i m i l a r i n t e r c h a n g e a b i l i t y o f p r i m e r s wa s f o u n d
wi t h C a m p y l o b a c t e r j e j u n i r DN A ( d a t a n o t s h o wn ) .
g e l d i s p l a y i n g T h e l y o p h i l i z e d a m p o u l e s o f S . s a n g u i s a c t u a l l y h a d a n
4
+
r P 2 ) ; 2 ,
C .
e x p i r a t i o n d a t e 8 m o n t h s p r i o r t o t h e s e e x p e r i m e n t s . M e t h -
I 4
- d e r i v d S .
o d s e v e n s i m p l e r t h a n t h e s i n g l e p h e n o l e x t r a c t i o n o r b e a d -
v e d
B f r a g i l i s
b e a t i n g
m e t h o d we r e t e s t e d wi t h S .
s a n g u i s - l y o p h i l i z e d
' . p e r f r i n g e n s
a m p o u l e s .
T h e
s i m p l e s t
m e t h o d i n v o l v e d
r e s u s p e n d i n g
a
e n t e r o c o l i t i c a l y o p h i l i z e d a m p o u l e i n 1 0 0 , u l o f t h e b u f f e r ( d e s c r i b e d a b o v e )
n a g n u s DN A c o n t a i n i n g
0 . 4 5 % e a c h o f T we e n 2 0 a n d N o n i d e t P - 4 0
g g m a t i s DN A d e t e r g e n t s . T h i s s a m p l e wa s b o i l e d f o r 5 m i n , a n d 1 p l wa s
DN A ( f D1 + u s e d t o p r i m e a n a m p l i f i c a t i o n r e a c t i o n . A l t h o u g h s u c c e s s -
) a n d s i n c l u d e
f u l , t h i s m e t h o d wa s r e j e c t e d f r o m f u r t h e r e x p l o r a t i o n b e -
c a u s e i t i s n o t l i k e l y t o wo r k f o r e v e r y b a c t e r i u m , u n l i k e t h e
b e a d - b e a t i n g m e t h o d .
Fi d e l i t y o f a m p l i f i c a t i o n . T o e x a m i n e wh e t h e r t h e r e we r e
t i o n s u c h a s p o t e n t i a l a r t i f a c t s d u e t o P C R a m p l i f i c a t i o n , p o r t i o n s o f
. A c c o r d i n g s e v e r a l s e qu e n c e s we r e e x a m i n e d a n d c o m p a r e d wi t h s e -
o l o g y ( 7 ) , a qu e n c e s wh i c h h a d p r e v i o u s l y b e e n d e t e r m i n e d b y o t h e r
L i n s 2 x 1 0 5 m e t h o d s . A c o m p a r i s o n o f a c l o n e d e r i v e d f r o m P C R wi t h
u t c e l l s ( f o r o n e d e r i v e d b y c o n v e n t i o n a l m e a n s s h o u l d b e t h e m o s t
FU ) a n d t h e i n f o r m a t i v e . T h e f o l l o wi n g n u m b e r s o f b a s e s we r e d e t e r -
b e s e v e r a l - m i n e d f r o m t h e c l o n e s i n d i c a t e d ( a l l i n p G E M v e c t o r s ) . ( i )
d a m p o u l e . A n a m p l i f i c a t i o n c l o n e - d e r i v e d B o r r e l i a b u r g d o r f e r i s e -
4 A o p e r o n s qu e n c e r e v e a l e d o n e d i s c r e p a n c y wi t h i n 1 , 5 1 7 b a s e s a s
v e n g r e a t e r c o m p a r e d wi t h a n R N A s e qu e n c e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) , r e -
s o l v e d i n f a v o r o f t h e c l o n e s e qu e n c e , o n t h e b a s i s o f
d i v e r s e t a x a s e qu e n c e c o m p o s i t i o n o f r e l a t e d s p e c i e s a t t h i s p o s i t i o n . I n
DN A wh i c h a d d i t i o n , s e v e n u n r e s o l v e d n u c l e o t i d e a s s i g n m e n t s ( N s )
f r o m b o t h f r o m wi t h i n t h e s e qu e n c e a b l e r e g i o n o f t h e r R N A s e qu e n c e
' e r e p u r i f i e d we r e d e t e r m i n e d f r o m t h e c l o n e , a n d s e v e r a l o t h e r b a s e s
wi n g s t r a i n s we r e d e t e r m i n e d f r o m t h e 3 ' e n d o f t h e r R N A . ( A p p r o x i -
T A B L E 4 . P e r c e n t a g e s i m i l a r i t y a n d e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e ( 9 ) f o r n i n e b a c t e r i a b e l o n g i n g t o t h e a l p h a s u b d i v i s i o n o f t h e p u r p l e b a c t e r i a
( 2 3 ) , p l u s E . c o l i ( a g a m m a b a c t e r i u m ) a s a n o u t g r o u p a
% S i m i l a r i t y / e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e ( x 1 0 0 ) "
B a c t e r i u m
E . c o l i R . p a l u s t r i s R . r u b r u m A . m a r g i n a l e E . r i s t i c i i R . p r o wa z e k i i R . r i c k e t t s i i R . qu i n t a n a B . a b o r t u s A . t u m e f a c i e n s
E s c h e r i c h i a c o l i 8 1 . 0 8 4 . 0 8 1 . 2 7 8 . 6 8 0 . 5 8 0 . 3 8 1 . 2 8 1 . 9 8 1 . 2
R h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i s 2 1 . 8 - 8 8 . 5 8 3 . 3 8 2 . 1 8 5 . 4 8 5 . 3 8 9 . 3 9 0 . 0 8 9 . 3
R h o d o s p i r i l l u m r u b r u m 1 8 . 0 1 2 . 4 8 4 . 9 8 4 . 9 8 4 . 9 8 4 . 9 8 7 . 9 8 8 . 9 8 8 . 4
A n a p l a s m a m a r g i n a l e 2 1 . 5 1 8 . 8 1 6 . 8 8 6 . 9 8 6 . 0 8 6 . 2 8 5 . 6 8 5 . 3 8 5 . 8
E h r l i c h i a r i s t i c i i 2 5 . 2 2 0 . 4 2 0 . 0 1 4 . 3 8 4 . 6 8 4 . 6 8 3 . 2 8 3 . 8 8 4 . 2
R i c k e t t s i a p r o wa z e k i i 2 2 . 7 1 6 . 2 1 6 . 8 1 5 . 4 1 7 . 2 9 9 . 0 8 7 . 0 8 7 . 1 8 6 . 9
R i c k e t t s i a r i c k e t t s i i 2 2 . 7 1 6 . 3 1 6 . 8 1 5 . 2 1 7 . 1 0 . 9 8 7 . 1 8 7 . 1 8 6 . 9
R o c h a l i m a e a qu i n t a n a 2 1 . 7 1 1 . 5 1 3 . 1 1 6 . 0 1 8 . 9 1 4 . 2 1 4 . 1 9 5 . 3 9 4 . 7
B r u c e l l a a b o r t u s 2 0 . 7 1 0 . 7 1 1 . 9 1 6 . 3 1 8 . 2 1 4 . 1 1 4 . 1 4 . 8 - 9 4 . 9
A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s 2 1 . 7 1 1 . 5 1 2 . 6 1 5 . 7 1 7 . 6 1 4 . 3 1 4 . 3 5 . 5 5 . 2
a
A m a s k wa s u s e d wh i c h e l i m i n a t e d a s m a l l n u m b e r o f p o s i t i o n s f r o m c o n s i d e r a t i o n wi t h i n t h e a l i g n m e n t ; a l l p o s i t i o n s i n wh i c h b a s e c o m p o s i t i o n wa s n o t a t
l e a s t 5 0 % c o n s e r v e d we r e e l i m i n a t e d . A l l o f t h e s e qu e n c e s r e p r e s e n t e d m a y b e o b t a i n e d f r o m G e n b a n k e x c e p t R . p a l u s t r i s wh i c h wa s u s e d c o u r t e s y o f C . R .
Wo e s e .
b
N u m b e r s b e l o w t h e d i a g o n a l i n d i c a t e e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e .
V O L . 1 7 3 , 1 9 9 1
7 0 2 WE I S B U R G E T A L .
E . c o l i
I I I I I
0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 1 4
'
E v o l u o n y De
FI G . 3 . P h y l o g e n e t i c d i s t a n c e t r e e d i s p l a y i n g t h e e v o l u t i o n a r y o r i g i n o f A . m a r g i n a l e wi t h i n a l i n e a g e s h a r e d b y t h e g e n e r a R i c k e t t s i a a n d
E h r l i c h i a . A l l s p e c i e s b e l o n g i n g t o t h e o r d e r R i c k e t t s i a l e s a r e s h o wn i n b o l d f a c e t y p e . E . c o l i i s u s e d a s a n o u t g r o u p s e qu e n c e .
m a t e l y 6 0 n u c l e o t i d e s a t t h e 3 ' e n d o f 1 6 S r R N A c a n n o t b e
s e qu e n c e d d i r e c t l y f r o m t h e r R N A . ) ( i i ) A t o t a l o f 2 2 6 b a s e s
we r e d e t e r m i n e d f r o m a N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e P C R c l o n e ,
wi t h n o d i s a g r e e m e n t wi t h t h e R N A s e qu e n c e o r a p u b l i s h e d
r DN A s e qu e n c e ( 1 7 ) . ( i i i ) T h e s e qu e n c e f r o m t h e N e i s s e r i a
m e n i n g i t i d i s c l o n e s h o we d n o d i s a g r e e m e n t wi t h 2 5 0 b a s e s
o f R N A - d e r i v e d s e qu e n c e . O n e N f r o m t h e R N A s e qu e n c e
wa s n o w d e t e r m i n a b l e f r o m t h e c l o n e . ( i v ) I n 2 1 2 b a s e s o f a
C h l a m y d i a t r a c h o m a t i s s e qu e n c e , t h e r e wa s n o d i s a g r e e -
m e n t wi t h t h e c o n v e n t i o n a l l y c l o n e d s e qu e n c e ( u n p u b l i s h e d
d a t a ) . ( v ) I n a C . j e j u n i P C R - d e r i v e d c l o n e , 3 2 8 b a s e s we r e
i n s p e c t e d , a n d t h e r e wa s o n e d i s c r e p a n c y wi t h t h e R N A -
d e r i v e d s e qu e n c e ( a n A - t o - G t r a n s i t i o n ) wh i c h m a y b e t h e
r e s u l t o f m i n o r c i s t r o n - t o - c i s t r o n v a r i a t i o n . Fi v e N ' s we r e
r e s o l v e d .
I n s u m m a r y , t h e r e a p p e a r s t o b e n o r e a s o n f o r m o r e t h a n
t h e u s u a l c o n c e r n , b e c a u s e o f T a q p o l y m e r a s e f i d e l i t y o f
r e p l i c a t i o n , a b o u t s e qu e n c e a c c u r a c y i n t h i s m e t h o d . S e v e r a l
p o s i t i o n s t h a t h a d p r e v i o u s l y b e e n s c o r e d a s u n k n o wn o r
a m b i g u o u s a r e n o w d e t e r m i n a b l e b y t a k i n g a d v a n t a g e o f
b i d i r e c t i o n a l g e n e s e qu e n c i n g a n d t h e a b s e n c e o f a r t i f a c t s
d u e t o r R N A s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d p o s t t r a n s c r i p t i o n a l l y
m o d i f i e d n u c l e o t i d e s . A s a l wa y s , a c a u t i o u s a p p r o a c h s h o u l d
b e t a k e n b y c h e c k i n g a n y s e qu e n c e a n o m a l i e s a n d c o n -
f i r m i n g k n o wn s e c o n d a r y s t r u c t u r a l c o n s t r a i n t s o n s e -
qu e n c e s .
A l t h o u g h we h a v e s p e n t c o n s i d e r a b l e t i m e o p t i m i z i n g a n d
t e s t i n g t h e d i r e c t s e qu e n c i n g o f P C R - a m p l i f i e d r DN A , we
h i g h l y r e c o m m e n d c l o n i n g t h e f r a g m e n t s i f a n e a r - p e r f e c t
s e qu e n c e i s d e s i r e d .
T r a n s c r i p t i o n o f a m p l i f i e d m a t e r i a l . O n e a d d i t i o n a l a p p l i -
c a t i o n o f p r i m e r s s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d h e r e i n i s t h e i n
v i t r o t r a n s c r i p t i o n o f P C R - a m p l i f i e d m a t e r i a l . We h a v e t r a n -
s c r i b e d v i r t u a l l y f u l l - l e n g t h p s e u d o - r R N A f r o m b o t h c l o n e d
m a t e r i a l a n d d i r e c t l y f r o m a m p l i f i e d p r o d u c t ( n o t s h o wn ) .
C l o n e d r DN A s , i n p G E M v e c t o r s , we r e t r a n s c r i b e d b y u s i n g
e i t h e r T 7 o r S P 6 p o l y m e r a s e s , d e p e n d i n g o n c l o n e o r i e n t a -
t i o n . I n a d d i t i o n , P C R p r i m e r s s i m i l a r t o f Dl , i n wh i c h t h e
c l o n i n g l i n k e r wa s r e p l a c e d wi t h a T 7 p r o m o t e r s e qu e n c e
( 5 ' - T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G - f o l l o we d b y t h e 1 6 S
r DN A - l i k e s e qu e n c e ) , r e a d i l y a m p l i f i e d a n d t r a n s c r i b e d f u l l -
l e n g t h p s e u d o - r R N A . T h i s m a t e r i a l c a n b e u s e d f o r s e qu e n c -
i n g , h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s ( d a t a n o t s h o wn ) , o r p o t e n t i a l l y f o r
r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s .
C o n c l u s i o n . T h e a m p l i f i c a t i o n b y P C R o f a t a x o n o m i c a l l y
d i v e r s e c o l l e c t i o n o f e u b a c t e r i a l 1 6 S r DN A g e n e s i s p o s s i b l e
wi t h a s m a l l n u m b e r o f p r i m e r s . T h e s e p r o d u c t s c a n r e a d i l y
b e c l o n e d f o r s e qu e n c i n g o r t h e y c a n b e s e qu e n c e d d i r e c t l y .
T h e a b i l i t y t o d e t e r m i n e r R N A s e qu e n c e s f r o m A T C C
l y o p h i l i z e d a m p o u l e s , wi t h o u t c u l t u r e , e n a b l e s t h e s t u d y o f
f a s t i d i o u s o r p a t h o g e n i c s p e c i e s wi t h o u t e m p l o y i n g t r i c k y o r
e x p e n s i v e m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s . Wh i l e t h i s s h o u l d n o t b e
a r o u t i n e s u b s t i t u t e f o r g r o wi n g b a c t e r i a , p i c k i n g i n d i v i d u a l
c o l o n i e s , a n d c o n f i r m i n g t h e i r p h e n o t y p i c a n d b i o c h e m i c a l
i d e n t i t i e s , i t wi l l e n a b l e e x p e r i m e n t s t o b e p e r f o r m e d t h a t
we r e n o t p r e v i o u s l y p o s s i b l e .
J . B A C T E R I O L .
1 6 S r DN A A M P L I FI C A T I O N 7 0 3
A C KN O WL E DG M E N T S
We g r e a t l y a p p r e c i a t e t h e wo r k o f J . S a m u e l , wh o p r o v i d e d A .
m a r g i n a l e c e l l s p u r i f i e d f r o m b o v i n e e r y t h r o c y t e s . C a r l Wo e s e
g r a c i o u s l y p r o v i d e d u n p u b l i s h e d r R N A s e qu e n c e s f o r a n a l y s i s .
R E FE R E N C E S
1 . B i g g i n , M . D. , T . J . G i b s o n , a n d G . F. Ho n g . 1 9 8 3 . B u f f e r
g r a d i e n t g e l s a n d 3 5 S l a b e l a s a n a i d t o r a p i d DN A s e qu e n c e
d e t e r m i n a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 : 3 9 6 3 - 3 9 6 5 .
2 . B i r n b o i m , H. C . , a n d J . Do l y . 1 9 7 9 . A r a p i d a l k a l i n e e x t r a c t i o n
p r o c e d u r e f o r s c r e e n i n g r e c o m b i n a n t p l a s m i d DN A . N u c l e i c
A c i d s R e s . 7 : 1 5 1 3 - 1 5 1 8 .
3 . B o e t t g e r , E . C . 1 9 8 9 . R a p i d d e t e r m i n a t i o n o f b a c t e r i a l r i b o s o m a l
R N A s e qu e n c e s b y d i r e c t s e qu e n c i n g o f e n z y m a t i c a l l y a m p l i f i e d
DN A . FE M S M i c r o b i o l . L e t t . 6 5 : 1 7 1 - 1 7 6 .
4 . B r o s i u s , J . , J . L . P a l m e r , J . P . Ke n n e d y , a n d H. F. N o l l e r . 1 9 7 8 .
C o m p l e t e n u c l e o t i d e s e qu e n c e o f a 1 6 S r i b o s o m a l R N A g e n e
f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 5 : 4 8 0 1 -
4 8 0 5 .
5 . E d wa r d s , U . , T . R o g a l l , H. B l o e c k e r , M . E m d e , a n d E . B o e t t g e r .
1 9 8 9 . I s o l a t i o n a n d d i r e c t c o m p l e t e n u c l e o t i d e d e t e r m i n a t i o n o f
e n t i r e g e n e s . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a g e n e c o d i n g f o r 1 6 S r i b o -
s o m a l R N A . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 7 : 7 8 4 3 - 7 8 5 3 .
6 . Fo x , G . E . , E . S t a c k e b r a n d t , R . B . He s p e l l , J . G i b s o n , J .
M a n i l o f f , T . A . Dy e r , R . S . Wo l f e , W. E . B a l c h , R . T a n n e r , L .
M a g r u m , L . B . Z a b l e n , R . B l a k e m o r e , R . G u p t a , L . B o n e n , B . J .
L e wi s , D. A . S t a h l , K. R . L u e h r s e n , K. N . C h e n , a n d C . R .
Wo e s e . 1 9 8 0 . T h e p h y l o g e n y o f p r o k a r y o t e s . S c i e n c e 2 0 9 : 4 5 7 -
4 6 3 .
7 . G h e r n a , R . L . 1 9 8 1 . P r e s e r v a t i o n , p . 2 0 8 - 2 1 7 . I n P . G e r h a r d t ,
R . G . E . M u r r a y , R . N . C o s t i l o w, E . W. N e s t e r , W. A . Wo o d ,
N . R . Kr i e g , a n d G . B . P h i l l i p s ( e d . ) , M a n u a l o f m e t h o d s f o r
g e n e r a l b a c t e r i o l o g y . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y ,
Wa s h i n g t o n , D. C .
8 . G u t e l l , R . R . , B . We i s e r , C . R . Wo e s e , a n d H. F. N o l l e r . 1 9 8 5 .
C o m p a r a t i v e a n a t o m y o f 1 6 S - l i k e r i b o s o m a l R N A . P r o g . N u -
c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . 3 2 : 1 5 5 - 2 1 6 .
9 . J u k e s , T . H. , a n d C . R . C a n t o r . 1 9 6 9 . E v o l u t i o n o f p r o t e i n
m o l e c u l e s , p . 2 1 - 1 3 2 . I n H. N . M u n r o ( e d . ) , M a m m a l i a n p r o t e i n
m e t a b o l i s m . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Y o r k .
1 0 . Ke n e r l e y , M . E . , E . A . M o r g a n , L . P o s t , L . L i n d a h l , a n d M .
N o m u r a . 1 9 7 7 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f h y b r i d p l a s m i d s c a r r y i n g
i n d i v i d u a l r i b o s o m a l r i b o n u c l e i c a c i d t r a n s c r i p t i o n u n i t s o f
E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 3 2 : 9 3 1 - 9 4 9 .
1 1 .
L a n e , D. ,
B .
P a c e , G . J . O l s e n , D. A . S t a h l , M . L . S o g i n , a n d
N . R . P a c e . 1 9 8 5 .
R a p i d d e t e r m i n a t i o n o f 1 6 S r i b o s o m a l R N A
s e qu e n c e s f o r p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
U S A 8 2 : 6 9 5 5 - 6 9 5 9 .
1 2 .
L a n e ,
D.
J . ,
a n d W. G .
We i s b u r g . U n p u b l i s h e d d a t a .
1 3 .
M a n i a t i s , T . ,
E . F.
Fr i t s c h , a n d J . S a m b r o o k . 1 9 8 2 . M o l e c u l a r
c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l . C o l d S p r i n g Ha r b o r
L a b o r a t o r y ,
C o l d
S p r i n g Ha r b o r , N . Y .
1 4 .
M a r m u r , J . 1 9 6 1 . A p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f
d e o x y r i b o -
n u c l e i c a c i d f r o m m i c r o o r g a n i s m s . J . M o l . B i o l . 3 : 2 0 8 - 2 1 8 .
1 5 .
M e d l i n , L . ,
H. J . E l wo o d , S . S t i c k e l , a n d M . L . S o g i n . 1 9 8 8 . T h e
c h a r a c t e r i z a t i o n o f
e n z y m a t i c a l l y a m p l i f i e d e u k a r y o t i c 1 6 S - l i k e
r R N A
c o d i n g r e g i o n s . G e n e 7 1 : 4 9 1 - 4 9 9 .
1 6 . R i s t i c , M . , a n d J . P . Kr e i e r . 1 9 8 4 . Fa m i l y I I I . A n a p l a s m a t a c e a e
P h i l i p 1 9 5 7 , 9 8 0 A L , p . 7 1 9 - 7 2 9 . I n N . R . Kr i e g a n d J . H. Ho l t
( e d . ) , B e r g e y ' s m a n u a l o f
s y s t e m a t i c b a c t e r i o l o g y , v o l . 1 . T h e
Wi l l i a m s & Wi l k i n s
C o . , B a l t i m o r e .
1 7 .
R o s s a u , R . , L . He y n d r i c k x , a n d H. V . He u v e r s wy n . 1 9 8 8 .
N u c l e o t i d e s e qu e n c e o f a 1 6 S r i b o s o m a l R N A g e n e f r o m N e i s -
s e r i a
g o n o r r h o e a e . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 6 : 6 2 2 7 .
1 8 .
T h e i n , S . L . 1 9 8 9 . A s i m p l i f i e d m e t h o d o f d i r e c t s e qu e n c i n g o f
P C R a m p l i f i e d DN A wi t h S e qu e n a s e T 7 DN A p o l y m e r a s e , p . 8 .
I n U . S . B i o c h e m i c a l t e c h n i c a l l i t e r a t u r e , v o l . 1 6 , n o . 1 . C l e v e -
l a n d , O h i o .
1 9 . We i s b u r g , W. G . , M . E . Do b s o n , J . E . S a m u e l , G . A . Da s c h ,
L . P .
M a l i a v i a , 0 . B a c a , L . M a n d e l c o , J . E . S e c h r e s t , E . We i s s ,
a n d C . R . Wo e s e . 1 9 8 9 . P h y l o g e n e t i c d i v e r s i t y o f t h e r i c k e t t s i a e .
J . B a c t e r i o l . 1 7 1 : 4 2 0 2 - 4 2 0 6 .
2 0 . We i s b u r g , W. G . , Y . O y a i z u , H. O y a i z u , a n d C . R . Wo e s e . 1 9 8 5 .
N a t u r a l r e l a t i o n s h i p b e t we e n b a c t e r o i d e s a n d f l a v o b a c t e r i a . J .
B a c t e r i o l . 1 6 4 : 2 3 0 - 2 3 6 .
2 1 . We i s b u r g , W. G . , C . R . Wo e s e , M . E . Do b s o n , a n d E . We i s s .
1 9 8 5 . A c o m m o n o r i g i n o f r i c k e t s i a e a n d c e r t a i n p l a n t p a t h o -
g e n s . S c i e n c e 2 3 0 : 5 5 6 - 5 5 8 .
2 2 . We i s s , E . , J . C . Wi l l i a m s , G . A . Da s c h , a n d Y . - H. Ka n g . 1 9 8 9 .
E n e r g y m e t a b o l i s m o f m o n o c y t i c E h r l i c h i a . P r o c . N a t l . A c a d .
S c i . U S A 8 6 : 1 6 7 4 - 1 6 7 8 .
2 3 . Wo e s e , C . R . 1 9 8 7 . B a c t e r i a l e v o l u t i o n . M i c r o b i o l . R e v . 5 1 : 2 2 1 -
2 7 1 .
2 4 . Wo e s e , C . R . U n p u b l i s h e d d a t a .
2 5 . Wo e s e , C . R . , R . G u t e l l , R . G u p t a , a n d H. R . N o l l e r . 1 9 8 3 .
De t a i l e d a n a l y s i s o f t h e h i g h e r - o r d e r s t r u c t u r e o f 1 6 S - l i k e r i b o -
s o m a l r i b o n u c l e i c a c i d s . M i c r o b i o l . R e v . 4 7 : 6 2 1 - 6 6 9 .
V O L . 1 7 3 , 1 9 9 1