Agronomfa Costarricense 17(1): 103-109, 1993

Nota Tecnica

EVALUACION DE MEDIOS PARA LA SELECCION DE CEPAS

DE Rhizobium leguminosarum bv phaseoli TOLER ANTES A BAJA
CONCENTRACION DE FOSFATO EN MEDIO DE CULTIVOI/*
Lidieth

Uribe **

ABSTRACT
Evaluation
of media for the selection of strains of Rhizobium
leguminosarum bv phaseoli tolerant to a low concentration
of phosphate in culture
medium. WiLh the goal of selecting Lhe medium which grows the largest quantity
of Rhizobium leguminosarum bv phaseoli, Lhe growth of 19 strains were determined in the media defined by Cassman et al. (1981a), Date and Halliday (1979),
Munns and Keyser (1981) and Lhe same media modified with Lhe addition of vitamins (4 mg/L Thiamine, 4 mg/L pantothenic acid and 1 ~g/L Biotin) (CIAT,
1988) and a high concentration of phosphate (2870 ~M). Variation of the capacity to grow in the different media was observed among strains. Bacterial growth
was largest in Lhe Munns and Keyser medium wiLh vitamin, Lherefore it was chosen as Lhe medium for selecting strains tolerant to low levels of phosphate (5
~M). Among ten strains of R, leguminosarum bv phaseoli tested, 5 were determined tolerant and 5 not tolerant. The initial pH of the media rose with bacterial
growth and Lhese alkalinization
coincided wiLh Lhe appearance of turbidity. The
results indicated that for purposes of screening strains tolerant of low levels of
phosphate in culture media, Lhe Munns and Keyser (1981) medium modified with
the addition of vitamins is Lhe most adcquated and turbidity can be used as a criterion for selection.

INTRODUCCION

al., 1981a; 1981b; Beck y Munns,

1984; Morales,

1987).
Se ha observado
entre
las cepas de
Rhizobium
y Bradyrhizobium
un amplio ambito
de eficiencia en el uso de concentraciones
bajas
de fosfato inorganico
(Pi) en medio de cultivo.
Algunos autores sugieren que las cepas tolerantes
a estas condiciones pueden tener un mayor exito
en el establecimiento de la simbiosis (Cassman e t

1/

.bid

bli

"

110 d

d"

1992

ecI 0 parapu caclone

e Iclem re e,
Partede la tesisdeM,Sc.presentada
porlidieth Uribe
Lorio ante la Escuelade Biologfa, liniversidad de

CentroColombia,
Cali
Intemaclonal de Agncultura TropIcal (CIAT),

.
..
.
medlo de cultlvo utllizado.
Existen ademas algunos problemas con el
uso de medios definidos para seleccionar cepas
tolerantes. En un estudio en el que se utiliz6 la
aparici
. .6n d e tur b Ie
. d ad como cnterlo
.,
d e seI ecCI' 6 n,

Cen~rode Investigaciones
Agron6micas,
Universidad
deCostaRica,SanJose,CostaRica,

.se encontro relaci6n entre esta y una poblaci6n de

aproximadamente 107 bacterias/ml (Keyser y

Costa Rica, San Jose, Costa Rica. EI trabajo rue finan-

ciadopor el Pr~grama
de Mi,crobiologia
d.elFrijol del

..

En el caso de Rhizobium leguminosarum bv

phaseoli no se dispone de un medio de cultivo
adecuado para la selecci6n de cepas. Morales
(1987) evaluo la capacidad de crecimiento de 32
cepas en bajas concentraciones
de fosfato en el
medio propuesto por Cassman et al, (1981a). En
condiciones de alta concentraci6n
de Pi, I1nicamente crecieron 9 cepas. Este resultado indica que
se puede haber eliminado
cepas con potencial
como inoculante debido a que no se adaptaron al

104

AGRONOMIACOSTARRICENSE

Munns, 1979).Sin embargo,se ~ observado que

CuadroI, Procedencia
de las cepasde RhizobiwnlegumillOsarwnbvphaseoliutilizadas.

ocurre
debido

Cepas

P
d
'a
roce enCt

OAT 381 1
OAT 385 1
CIAT390 1

ClAT57,resistente
S.
P~aY8n,CoIanbia
P~ayan,Colanbia

CIAT
CIAT

P~aY8n,
P~aY8n

en condicionesde bajaconcentraci6n
de fosfato
un aumento
a una mayor

en la turbiedad
del cultivo
producci6n
de polisacaridos

(Cassman et aI., 1981a).

Otro factor a considerar es la alcalinizaci6n
del media de cultivo par efecto del metabolismo

'

actenano.

S. b.
I

len

Hall
ate

' da
(1979)
I
Y

reco-

579
580

1
1

CoIanbla
CoIanbia

mendaron en sus estudios de tolerancia a acidez

sustituir el manitol par arabinosa y galactosa, para
evitar cambios en el pH, varios autores han observado alcalinizaci6n del media relacionada con el

CIAT405 1
CIAT406 1
CIAT407 1
CIAT008 1

OAT, C~lanbia
CIAT,Colanbia
~T, ~olanbia .
Chmc~n',Colombia

. .
creclmlento

CIAT ro9 1
OAT 611 1

Chmchina, Colombia
Chinchina Colombia

10 celulas/ml, Keyser y Munns (1979) surleren

el usa de in6culos
pequenos,
10 -104
bacterias/ml. ,
Algunos estudios indican sin embargo que
'.
d'
1a concentraci 6n InlCla
. , . 1 de bactenas
pue e ser

CIAT632 1
OAT 460 1
OAT 515 1
OAT 70441
CIAT876 2
CIAT9492
CR436 2
KIM 5
2
KIM 5S 2
57
2

Guatemal~
Bayment,
Belg~ca
Ba~ent, Belglca,
Quilichao,Colombla
Marinilla Colombia
SanLQ. c.uca,Colombia
Puriscal,
CostaRica
Idaho,USA
Kim 5 resistente
S.
Sd '

Importante en a eterrnmaci n e to erancla de

lag cepas cuando se usa el criteria de turbiedad.
En una investigaci6n de tolerancia a la acidez se
observ6 que la aparici6n de turbiedad de la cepa

CIAT652 3
OAT 166 3
CR477 3
ClAT 899 3

evaluada
dependi6del tamano
inicial del inocula.
A ,
.,
"'
Sl, con una concentraclonmlCIald e 102 bacterias/ml no se observ6turbiedad,mientrasque con
inoculos mayoresla cepase mostnScomo tolerante (Wood y Cooper,1988).

1
2

celular

(Keyser

y Munns,

1979;

Beck

y Munns, 1984; Howieson, 1985; Wood Y Cooper,

1988). En vista de que el aumento en el pH
coincidi6 con una poblaci6n de aproximadamente

'

I d

.6 d

EI objetivo de estetrabajo fue evaluarel usa

de un media de cultivo no restrictivo al crecimiento de lag cepasde R. leguminosarumbv phaseoli
en la selecci6nde cepastolerantesa bajosniveles
de Pi.
MATERIALES Y METODOS
Ubicaci6n
Los experimentos se realizaron en el
Laboratorio de Microbiologia de Suelos del
Centro de Investigaciones Agron6micas de la
Universidad de Costa Rica y en la Secci6n de
Microbiologia de Frijol del Centro Intemacional
de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.
Cepas
..
.,.
Se uullzaron ~epasde .Rhizobiumlegumlnosa:umbv p.haseollper:teneclente~
a ambo~laboratonos antenorrnentecltados. La mforrnacl6nde
lagcepassedetalla en el Cuadra 1.

ccm

y ney, A ust raIi a

BuitreraColombia
Buga,C~lombia
Paraiso,
CostaRica
CarmenViboral,Colanbia

utilizadasen la evaluaci6nde medios

utilizadasen la toleranciaa bajaconcentraci6n

de fos-

fatoenmediodewltivo,
3. = utilizadas,e~ambosexperimentos
S = estreptomlcma
Medios de cultivo
Las cepasde Rhizobium se conservaronen
tubas inclinados con Agar Levadura Manitol
(ALM) (Vincent, 1970). En la evaluaci6n de
medias para la selecci6n de cepas se utiliz6 el
media definido propuesto par Cassman et al.
(1981a) (medio C), el media Date y Halliday
(1979) (medio D), el media de Munns y Keyser
(1981) (medi? ~ y log.mis.msmediasmod~fi~dog con la adicl6,nde vltamln.as(4 mg/L de u~m~na,4 mg/L de acldo panto~ernco
y 1 ~g/L d.eblobna) (CIAT, 1988),~enommadosaqui ~edlos CV,
DV y MV" respectlvamente.Los mediascon alta
concentracl6nde fosfato se aforarona I L con el
buff~r KH2P?4-K2HPO4 .2870 ~M, pH 5,7. EI
media con baJaconcentracl6nde fosfato se afor6
con un buffer KH2PO4-K2HPO4 5 ~M, pH 5,7.
La composici6nde log medias se especificaen el
Cuadra2. A todoslog mediasse legcorrigi6 el pH
a 5,7 con HCI IN debido a que la condici6n de
bajo P generalmenteestArelacionadaa suelosacidog.

URIBE: Evaluaci6nde medics para la selecci6nde cepas

10S

Cuadro2. Composici6nde los medics de cu1tivoutilizados en

1acva1uaci6nde medics con a1taconccntraci6nde
fosfato (2870 JotM).

previos en que se compar6 con 540 nm y 610

nm, resulto maS sensible a los cambios en turbiedad.

COMPONENTES

Se determin6 la tasa de crecimiento especifico J.l = (Af- Ai)/(tf-ti)

donde Af es la absorbancia final, Ai la absorbancia inicial, tf el tiempo
final, y ti el tiempo inicial para cada una de las
1 da
1 d ...
. d
.
cepas eva ua s en os Ilerentes medias e culu-

C
(u/L)

D
(ull..)

M
(ull..)

10,000g
0,220 g

0,300 g
0,300 g
1,800g

Arabmosa
Galactosa
G1utamato

1iamina
Biotina
~2S04
C~ (}.H
Mags54f1~20
FeNaEDTA
MnSO4lH20

3,000g
3,000g
1,100 g

0,100mg
0,250mg
0,250rnM
0300mM
0:300mM
0,050mM
2,000~

0268=\1
0:300mM
0,100mM

CuSO4f5H20
CoCLz/6H20 0,500
0,002~M
~

0,005~\1

Na2MoO4f2H20 0,100 ~
MnC12/4H20
CuO2(}.H20
H3B04

0,050 ~\1
2,000 ~\1
0,250 ~\1

ZnSO4f1H20

1,000~

1,000~\1

0050 M
O'500:M
0:500mM
0,025mM
1,000~
0,500 ~

Yo. Se utiliz6 un diseno experimental irrestricto al

azar con un arreglo factorial de 19 X 6 con 2 repeticiones donde el factor A esta constituido par las
19 cepas y el factor B par los medias de cultivo.

Seeligi6 el mediaenel queseobservomayorcrecimiento de las cepas.

0,025 ~M

de fosfato
Se evalu6 la tolerancia de 10 cepas de R .
ieguminosarum bv phaseoii a niveles bajos de fosfato en el media de cultivo propuesto POTMunns y

0,010 rnM

d.

0,100
~
0,005~

.,

d 1

va uaclon e me 10con mvees aJos(5 ~M)

C = mediodeCassmanMunnsy Beck (1981)

Keyser

D = mediadeDatey Halliday(1979)
M = mediodeMunnsyKeyser(1981)
..
A 10smediasCV, DV y MV se adiciono4mg/L de

vitarninas (medio MV). Las bacterias se cultivaran en platos de ALM a 28'C durante 4 dias, se
hizo una suspensi6n a partir de 2 colonias de cada

1iamina, 4 mg/L Acido Pantotenico y l~g/L biotina.

Evaluacion
de medios con alta concentracion
(2870 ~M) de fosfato
Con el fin de seleccionar un media en el que
crecie~ la mayor cantidad de cepas de R. ieguminosarum bv phaseoii, se determin6 el crecimiento
de 19 cepas en los medias C, D, M, CV, DV y
MV. Se utiliz6 una concentraci6n (2870 J.lM) de Pi
similar a la del media Levadura Manitol (LM) de
usa convencional.
El media C se utiliz6 previamente
en la
selecci6n
de
cepas
de
Rhizobium
y
Bradyrhizobium
tolerantes a condiciones de bajo
fosfato en media de cultivo y los medias D y M
en la seleccion de cepas tolerantes a acidez (Date
y Halliday, 1979; Cassman et ai., 1981a; Munns
y Keyser,
1981). Las bacterias
se cultivaron
durante 72 h en platos con ALM. Para estandarizar el in6culo a aproximadamente
103, 104 bacterias/ml,
se hizo una suspension a partir de 2
colonias de cada una de las cepas en 100 ml de
agua destilada esteril y se inocul6 par duplicado
25 J.ll en tubas de 18 x 150 mm con 6 ml de cada
media. Los cultivos se incubaron a temperatura
ambiente con agitaci6n con stante. Se midi6 la
absorbancia a 420 nm ya que en experimentos

(1981)

y modificado

con la adicion

de

una d e 1as cepas en 100 m 1 d e agua d est 1

.1ad a es~,.<

ril y se inocul6. par duplicado, 100 ~l en tubas de

16 X 125 mm con 3 ml de media alto en fosfato
(2870 J.iM) y en tubos con media bajo en fosfato
(5 J.lM). Se determin6 la concentraci6n de bacterias presente en el inocula con el usa de la tecnica
de recuento en gala (Somasegaran
y Hoben,
1985). Los cultivos se incubaron a 28'C bajo agitaci6n constanle. A los 5 dias se determin6 visualmente la presencia de turbiedad.
A fin de determinar si la capacidad de crecer en bajos niveles de Pi podia evaluarse con
base en la turbiedad en media de cultivo, se realizaron curvas de crecimiento alas cepas que resultaron tolerantes en el media con baja concentraci6n (5 ~M) de Pi y a la cepa no tolerante Kim 5.
Para ello se hizo una suspensi6n a partir de
2 colonias de cada una de las cepas y se inocula
par duplicado 100 ~l de cada suspensi6n en erlenmeyers con 100 ml del media. Los cultivos se
incubaron durante 6 dias a 28'C bajo agitacion
constante. Para evitar la fase de adaptacion que
ocurre despues de la transferencia
de bacterias
procedentes de ALM a un media con arabinosa y
galactosa (Cassman et ai., 1981a), el sexto dia se
hizo, a partir de cada cultivo, un subcultivo de 100
~l a un media bajo en fosfato. Se determin6 la
absorbancia a 420 nm y el pH cada 24 h. A las

106

880
II:

AGRONOMlA COSTARRlCENSE

Cuadro3. Poblaci6n inicial de bacteriasutilizada en la evaluaci6n de 6 medios de cultivo coo alta coocentn-

OIAf'"
OI

0' 80
Ar 880
W
C:J OIAr70..
A.

CI6n de fosfato (2870 ~).

=
- OIAr
581
W40

NOCULO
UFC/ml X 103

~
W30

CEPAS

CIAT632
CIATre8

3;7
0,8

CIAT407

17,0

CIAT 652
CIAT@

40
19:0

CIAT 7044
CIAT 580

83
4'6

CR 477
CIAT 579
CIAT 390

170
870
32

CIAT 406
CIAT405

71
8'4

~ 20

CIAT 385

()

W
Q 10

i
t"' 0

D
DV
MEDIO DE CULTIVO

MY

F. 1 Eli
del edi d
1.
b 1
..
Ig..
ecto
m 0 e cu Uvo so.re e creClmlentode cuatro cepasde RhizobiumlegumlllOsarumbv phaseoli.

58
'

cepas tolerantes se les hizo recuento en gota a los

dfas 4 y 6, Y a la cepa Kim 5 a los dfas 1,3 Y 6

g~i ~:

39:0

CIAT611

6~,~

despuesdeinoculado.

CIAT381
CIAT 460
CIAT515

1'6
3'3
3:5

RESULTADOS Y DISCUSION
Evaluacion de medias con alia concentracion
de fosfato
Se observo diferencia entte cepas en la
capacidadde creceren los mediasde cultivo evaluados. Esto se evidencia par la interacci6naltamente significativa (P<O,OOI)entre los factores
cepay media de cultivo (Figura 1).
En tcrminos generaleslas cepas crecieron
mejor en el media MV. En la Figura 1 semuestIan
5 casasrepresentativosde las 19 cepas.El menor
crecimiento se registr6en el media C, 10que concuerda con 10 observado par Morales (1987) quien

sefialaque estemedia rue restrictivo al crecimiento de R. legwninosarumbv phaseoli; esteresultado pudo debersea que el media C rue disefiado
para el estudio de cepasde Bradyrhizobium que

UFC=

unidadesfonnadorasde colooias

La variaci6n en turbiedad se atribuye

principalmente a diferencias en el crecimiento
de las cepas y en menor medida al tamafio inicial del in6culo (Cuadro 3) y producci6n de
polisacaridos.
Evaluacion del medio con bajos niveles de fosfato
. Todas las.cepas evaluadascrecieron en el
media alto en PI, usadocomo control. Se observ6
diferenciaen el nivel de toleranciade las 10 cepas
de R. leguminosarum bv phaseoli estudiadas
(Cuadro 4). Se obtuvo 5 cepastolerantesy 5 no

poseenrequerimentos
nutricionalesdiferentesa

tolerantes.
La cepaCIAT 166queresult6tolerante

las del genera Rhizobium. Si bien la adicion de

vitaminasmejor6 considerablemente
el crecimiento de las cepas,el mediaMunns (M) se ajust6mas
alas necesidadesnutricionales de las mismas
(Figura 1).
En estemismoestudiose observ6quede las
19 cepasevaluadas,CIAT 652, CIAT 406 Y CIAT
381 no presentaron turbiedad a 420 nm en el
media C; de igual manera,la cepa CIAT 381 no
present6 crecimiento en forma detectableen los
medias CV, D Y DV, mientrasque todaslas cepas
presentaronturbiedaden los mediasM y MV.

en este experimento,tambien rue catalogadapreviamentecomo toleranteen los ensayosrealizados

par Morales (1987). En el Cuadra 5 se observa
que las cepasCIAT 949 y CIAT 652 capacesde
crecer en media alto en Pi no presentaronturbiedad cuandose utiliz6 un inocula menor.Paraevitar el efecto de tamafiodel inocula serecomienda
el usa de las ~blaciones utilizadasen esteexperimento (103_1()4bacterias/ml).
Al realizar las curvas de crecimiento se
observoun c?mpartamientosimilar en los valores
de absorbanclay pH de las cepastolerantesCIAT

'

URIBE: Evlluaci6n de mediosparala selecci6nde cepas

107

Cuadro4. Crecimienlo de 10 cepasde Rhizobiwn leguminosarum bv phaseoli en el medio propuesto For

Munns y Keyser y modificado coo la adici6n de
vitaminas, en niveles bajos (5 ~) y altos (2870
J.IM)de fosfatos.

Cuadro5. Efeclo deltamaiio del in6culo sobreel crecimiento

de 2 cepasde Rhizobiumleguminosarumbv phaseoli en el medio de cullivo propuestoFOrMunns y
Keyser(1981)y modificado con la adici6n de vitaminas,en nivelesde alto (2870 J.IM)fosfato.

Cepas

Cepas

In6culo
UFC/ml X 103

CIAT 899
CIATI66
CR 477
CIAT 876
CR 436
57ccm
KIM 5
KIM55
CIAT 949
CIAT652

5~

32,0
11,0
55,0
24,0
16,0
11,0
8,0
7,0
3;2
0,8

PO4

2870~

+
+
+
+
+

PO4

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

CIAT949
CIAT949
CIAT 652
CIAT 652

2870 ~

32,0
0,1
8,0
0,4

PO4

= presenciade turbiedad
=. ausencia de turbiedad
UFC =unidadesfonnadorasde colonias

C d

+= presenciadeturbiedad
rb' ed d
. de
ausenCla
UFC
.d
detuf 1 ad
d
I .
urn a s onna oras e co omas

-=

In6culo
UFC/rnIX 102

ua ro.

6 Ef
d I
..
d 5
d Rh O b .
ecto e crecunlento e
cepas e
IZO lum
bv p haseoII. sobre 1a turbIe
" d aye
d
I
Iegwnlnosarum
.
MY
.,
Hd I
d d ul '
p
e me 10 e c Uvo
a una concentraclon
'

baja (5 J.IM) de fosfato.

L cultlw
Cuarto dia*

10

E 0.8 - A88OR8ANCIA
ClKT
c
-- A88OR8ANCIA
ClKT
...
0
'"

CEPA

UFC/m1 A

Sexto dia*

pH

X 106

UFC/ml

pH

X 106

CIKT 108

< 0.4

... CIAT
.,.

~
~
~ 02.

CIAT
CR
CR
CIAT

i
8

166
436
477
899
876

22,0
16,0
44,0
31,0
0,4

0,360
0,401
0,368
0,380
0,127

7;2
7,2
7;2
7,3
6,0

30,0
65,0
36,0
7,3
7,8

0,426
0,525
0,504
0,494
0,398

7,5
7,3
7,6
7,7
6,6

--

<
0
0

.
8

*
despuesde inoculado
UFC unidades
fonnadoras
decolooias
A
absorbanciaa 420 nm
MV
medio pr~ueslo FOrMunns y Keyser (1981), modifi-

=
=
=

TIEMPO
(diu)

carlo con la adici6n de vitaminas.

b. aubcultlw

10

E
~ 0.8 ---

A88OR8ANCIA
ClKT
-

...

e'

Y CR 477 Cue de aproximadamente

107 bacterias/ml al cuarto dia de inoculado el ensayo, mien-

A8.0".ANCIA
CIKT
...
CIAT

'88

... CIAT 8'8

50.4

.
1

78

TIEMPO (dl..)

Fig.2.

A partir de este punta,

se observounadisminucionen el crecimientade
--

00

tragquela cepaCIAT876present6
unaconcentraci6n de 105 bacterias/ml.

~0.2
~

Como se observa en el Cuadra 6, la densi-

dad de poblacion de lag cepas CIAT 899, CR 436

Efectodel crecimiento
de<!oscepasdeRhizobium
leguminisar.um
by p'.Jafe~/isobre1&turbiedady el
pH delmedlocm baJos
rnveles(5~) defosfato.

166, CIAT 899, CR 436 y CR 477 (Cuadro 6), par

10 que unicamente se graficaron log datos de la
cepa CIAT 166 Y la cepa CIAT 876 (Figura 2).

las cepas CIAT 166 Y CR 436 y en la densidad de

poblacion de lag cepas CR 477 Y CIAT 899, debi'do
probablemente
al agotamiento de nutrientes,
alcalinidad y acumulo de sustancias tOxicas. En el

caso de la cepa CIAT 876 la poblaci6n aument6 a

7,8x 106 bacterias/ml (Cuadro 6). Los datos de

densidad de poblaci6n obtenidos en este experimenta estan de acuerdo con 10 indicado par
Keyser y Munns (1979) quienes senalaron que log
niveles bajos de Pi en media de cultivo limitan la
poblaci6n maxima a 107 bacterias/ml.

108

AGRONOMIA COSTARRICENSE

Cuadro 7. Crecimienlo de la cepa loleranle CIAT 1(Xi y de la

cepa lOleranle Kim 5 en medio de cullivo de MY a

miento
en bajos
CIAT 876

una coocenlraci6nde bajo (5f!M) fosfalo.

CIAT 1(Xi
KIM 5

de Pi antes

I
remocu

CEPA

niveles

que

la cepa

Al . .

b
ar,

se

6
serv

d
una

..
IsmmuCI

.
6

Primer
dia*
UFC/m1
x 104

Tercer
dfa*
UFC/m1
x 104

SexlO
dia*
UFC/ml
x 104

en el tiempo de aparicion de turbiedadde la cepa

CIAT 876, debido probablementea la presencia
de las enzimas necesariaspara crecer en dicho

980
0:08

12000
0.76

3(XX)
00
170.00

media. Tanto en el cultivo inicial (Figura 2a,

Cuadra 6) como despues del subcultivo (Figura

2b),
de crecimiento
logarftmico
de
esta
cepala
ruerase
similar
al de las otras
bacterias.
Asf
la
duraci6n de la rase de adaptaci6nestuvo, como

*
de~pues
deinoculado.
UFC= unl~ades
formadoras
decolomas

MY = medlOpr~ueSlOporMunnsy Keyser(1981).modifica-

docoola adicioo
devilaminas

AI parecerel aumentoen absorbanciaestuvo relacionadoal crecimientocelular hastaque las

bacteriasentraronen la raseestacionaria,con una
poblacion de aproximadamente107 bacterias/ml,
en ese momenta la tecnicade absorbanciaperdi6
sensibilidadpar no discemir entre bacteriasvivas
y muertas.
EI pH de los mediassealcalinizo con el crecimiento bacteriano (Figura 2, Cuadra 6). Estos
resultadosconcuerdancon 10observadoen trabajos anteriores, donde el aumento en el pH del
media coincidi6 con la aparicion de turbiedad.
Los autoressellalanque los cambiosen pH en alta
densidadcelular se debenal aumentode la cantidad total de alcali productodel mctabolismocelular, a la utilizacion del glutarnatode sodio como
fuente de N y posiblementecomo fuente de C y
energfa, 10 que reduce la capacidad buffer del
media (Keyser y Munns, 1979; Beck y Munns,
1985; Howieson, 1985; Wood y Cooper, 1988).
En estudios previos se observo que el pH del
media estuvo relacionadocon la cantidadde crecimiento de las cepas.
Las cepasCIAT 166, CIAT 899, CR 436 Y
CR 477 presentaronturbiedad un dfa despuesde
inoculado el media con baja concentracionde Pi
(Figura 2a), estetiempode adaptaci6nal media de
cultivo se mantuvo despuesde la transferenciaa
un media de cultivo nuevo(Figura 2b).
Como se observa en la Figura 2a, la cepa
CIAT 876 presentocrecimientodetectablepar turbidimetrfa 2 dfas despuesque las otras cepas;este
resultadoconcuerdacon 10observadopar Keyser
y Munns (1979) quienessellalaronque los niveles
bajos de Pi aumentaronla rase de adaptaci6nde
las bacteriasal media de cultivo. AI parecer,las
cepas CIAT 166, CR 436, CR 477 y CIAT 899
sintetizan lag enzimas necesariaspara el creci-

..

Indican Cassmanet a/. (198Ia), pobrementerelacionada con la capacidadde crecer sin Pi externo. Sin embargo, las cepas que presenten una
rase de adaptacionmenor a los niveles bajos de
Pi probablementetengan ventaja en la colonizacion de la rizosfera; par 10tanto debenrealizarse
estudiospara determinar la significancia de esta
caracterfstica.
Cuando se comparo el crecimiento de la
cepaKim 5 que result6 no tolerantea bajos niveles de Pi, con la cepa tolerante CIAT 166, se
observocrecimientovisible 6 dfasdespuesde inoculada.El crecimientode estaceparue mcnorque
el observadopara la cepa CIAT 166 (Cuadro 7)
debido probablementea una rase de adaptaci6n
maslarga.Estaccpa rue catalogadacomo no tolerante al utilizar el criteria de aparicion de turbicdad a los 5 dfas de inoculado. Si bien presento
crecimiento como 10 dcmuestran los datos de
poblaci6n,podrfaser desplazadapar la cepaCIAT
166 si se inocula en cultivo mixto. Es importante
determinar si estc comportamiento tiene alguna
implicaci6necologica.
En sfntesis,los resultadosobtenidosindican
que parafines de tarnizaje,el media propuestopar
Munns y Keyser (1981) y modificado con la adicion de vitaminas,es el masadecuadoporquepermite el crecimientode un numeromayor de cepas
de R. /eguminosarumbv phaseoli. En estecnsayo
existi6 relacion entre la aparicion de turbicdad y
la poblacionde bacteriaspar 10que sepuedeutilizar el metoda de turbidimetrfa para la deteccion
de crecimientobacteriano.
Debido a que los cambiosimportantesen el
pH del media ocurrieron despuesde que el crecimiento rue detectablepar turbiedady que no hubo
variacion entrecepasen la produccionde alcalinidad, se puedeUsafeste media en la seleccionde
cepastolerantesa condicionesde bajo Pi.
Faltarfadeterminarsi la toleranciaobtenida
in vitro correspondecon la capacidadde las cepas

URIBE: Evaluaci6nde mediospara Ia seleccionde cepas

de R. leguminosarum bv phaseoli de crecer en

ambienlescon nivelesbajosde Pi en el campo.
RESUMEN

109

LITERATURACITADA
BECK, D.P.;MUNNS, D.N. 1984.Phosphate
nutrition of
Rhizobiwnsw. Appi.Environ.Microbiol.47:278-282.

.
.
Con el fin de selecClonar un medlo en el que

CASSMAN, K.G.; MUNNS, D.N.; BECK, D.P. 1981a.

Phosphorusnutrition of Rizobiwn japolliclUft: strain

creciera la mayor cantidad de cepas de

Rhizobium leguminosarum bv phaseoli, se deter-

differencesin phosphate
storageandutilization.Soil
Sci.Am.J.45:517-520.

~ino el crecimiento de 19 cepas en el medio definldo propuesto por Cassman et al. (1981a), el

medioDaley Halliday(1979),el mediodeMunns

y Keyser (1981) y los mismos medios modificados con la adicion de vitaminas (4 mg/L de
,.
1 g/L d
T. . 4 g/L d ' .d
lamIna, m
e aci 0 pantoternco y 1.1. e
Biotina) (CIAT, 1988) a una concentracion alia de
fosfato (2870~.
Se observo
variac
ion entre cepas
en EIla
capacidad
de crecer
en log distintos
medios.
.

..

CASSMAN,K.G.;MUNNS,D.N;BECK,D.P.1981b.Growth
of Rhizobiwnstrainsat low concentrations
of phosphate.SoilSci.Am.J.45:520-523.

OAT. 1988.Simbiosis
leglUftillosa-RhizobilUft.
Manualde
Metodos. Cali, ColOOlbia. OAT. 178p.

DATE,R.A.; HALLIDAY,J. 1979.SelectingRhizobilUft

for
acid,infertilesoilsof thetropics.Nature277:62-64.
.
HOWIESON.,
J.G. 19.85. Use of an. org;anlc bu~fe~ for .t/1e

selection

CreClmlento
bactenanofue mayorenel medlode
Munns y Keyser con vitaminas por 10que este se
eligio como ~edio p~ra la seleccion de cepas

of acid tolerant

Rhlzoblwn

meliJoll

strams.

PlantandSoil88:367-376.

KEYSER,
H. H.;MUNNS,
D.N.1979.
Tolerance
of Rhizobia

tolerantesa mvelesbaJosde fosfato(5 I.J.M).Se

to acidity,aluminumandphosphate.
Soil Sci.Soc.Am

determino la tolerancia de 10 cepasde R. leguminosarum bv phaseoli y se encontraron5 cepas

J.43:519-523.

tolerantesy 5 no toleranles.EI pH inicial de los

MORALES,
~. 1987.S~lecciony evaluacio~de cepasde

.
t
. .
.
medlos aumen 0 con el creclmlento bactenano y
esta alcalinizacion coincidio con la aparicion de

RhlSob,um
legumlllosarlUft
bv phaseoutolerantesal
suministrorestringidode fosforo.TesisMSc. Catie.
Turrialba,C.R.97p.

turbiedad. Los resultadosobtenidos indican que

para los fines de tamizaje de cepastolerantes a
bajos niveles de fosfato en medio de cultivo, el
ed. d M
K
(1981) od' fi d
m 10 e unns y eyser
m 1 Ica 0 con
la adicion de vitaminas fue el mas adecuadoy
que se puedeemplear la turbiedad como crilerio
de seleccion.

La autora agradece a la Ora. Judy Kipe-

al Dr.
,

Carlos

Ramirez

y a Vivian

Bioi. Blochem. 13.115-118.

SOMASEGARAN,
P.;HOBEN,
J.H.1985.Methods
in /egumillosa-Rhizobium
technology.
Ninal proyectand
Mircen,Paia,Hawaii
367p.
VINCENT, J.M. 1970.A manualfor the practical study of the
root nodule bacteria.Blackwell Scientific Publicatioos,
Oxford.

AGRADECIMIENTOS
Nolt

MUNNS,.D.~.; KE.YSER,.
H.H. 198.1..
Response~f
R?lzob~wn
stram.toacidandaluminium
stress.
Soli

Sanchez

la

coiaboraCl6n prestada en el desarrollo de esta

investigacion

WOOD,

. .

. .

M..; c::O<?PER, J.E: 19.88. A~ldl.t.y, alummlum

.a~d
mulupllcatlon
of Rhlzob,1Uft Irifoul:
effects of mltlal

inoculum density and growth phase.Soil Bioi.

Biochem.20:83-87.