Romanian Biological Sciences, Vol. IV, No.3-4, p.

75-83, 2006

PRELIMINARY DATA OF A TEST REGARDING THE POSSIBLE

GENETIC EFFECTS OF WASTE WATERS FROM DYE WORKS ON
THE TRITICUM AESTIVUM L. SPECIES

DATE PRELIMINARE ALE UNUI TEST PRIVIND EVENTUALUL

EFECT GENETIC AL APELOR REZIDUALE DIN VOPSITORII,
ASUPRA SPECIEI Triticum aestivum L.

FL. FLORIN, MARIA BUCURESTEANU

National Institute for Research and Development of Biological Sciences, Bucharest -

„Stejarul” Biological Research Centre Piatra Neamt

Abstract. The results of the cytotoxicity tests of the waste waters from dye works on Triticum
aestivum shows that in case of the growth test there exists a positive correlation between the
size of the negative effect on the roots and the concentration of the effluent compared to that
on the stems, probably because of the permanent contact with the waste waters. The effects
obtained in case of the control and the variants with waste waters were those inhibiting plant
growth along with the dry weight accumulation in case of the variants grown in waste waters.
The physiological-biochemical perturbations may manifest themselves by the acceleration of
some steps of the cell membrane evolution which is of lipo-proteic nature doubled by a pecto-
cellulose wall, protecting against chemical damages as in every living organism. It is possible
that the rhythm and cell dividing mechanism be altered under the influence of the noxes from
the waste waters with effects on the process of tissue formation, the growth and development
of the plants in the test.

Key words: cytotoxicity tests, noxes, waste waters, physiological-biochemical perturbations

INTRODUCERE

Efluentii reziduali din vopsitorii, incarcati cu nitrozamine, pigmenti, metale grele

si diversi aditivi, sunt foarte greu de epurat si s-a impus testarea mai multor tehnici de
tratare printre care si metoda cu macrofite (1,2,3). Randamentul metodei a fost bun
dar a rezultat o cantitate de biomasa si pentru folosirea ei ca ingrasamant verde s-a
efectuat un test de citotoxicitate pe specia Triticum aestivum L.
Testele de citotoxicitate, alaturi de cele histoanatomice, dau intreaga masura a
efectelor nocive a substantelor poluante deversate in mediu, asupra celulei vii (4). In
cazul de fata s-a evaluat impactul asupra plantelor prin urmarirea efectelor genetice,
asupra germinarii,cresterii asupra acumularii de substanta proaspata si uscata in
populatiile crescute in mediu poluat. De asemenea s-a constatat ca noxele sunt
consumate de catre plante, care au o anumita toleranta la poluanti, motiv pentru care
pot fi utilizate in epurarea efluentilor reziduali.
Rom.Biol.Sci. 76

MATERIAL SI METODE
Materialul biologic supus testului de citotoxicitate consta in seminte de grau
(Triticum aestivum L.) In vederea efectuarii experimentului, in cultura hidroponica, s-
a procedat dupa cum urmeaza:
Semintele de grau s-au imbibat timp de 24 ore in 6 variante, dintre care doi
martori constand in apa de retea si apa din canalul UHE Bistrita – aval de barajul
Batca Doamnei si patru dilutii realizate din apa uzata cu apa din reteaua de apa
potabila, in concentratii de 10%, 25%, 50% si 100%.
Dupa expirarea celor 24 ore, semintele s-au asezat pe plase din plastic, montate
la randul lor pe cutii din plastic, umplute cu apa din cele 6 variante (fig. 1).

Fig 1 –Seminte de grau puse la germinat pe cuve cu ape martor si ape reziduale

Experimentul a fost montat intr-o camera semi-climatizata, la 23-24°C si

iluminare continua (doua becuri neon DAY-LIGHT), din momentul punerii
semintelor la imbibat si pana la efectuarea masuratorilor biometrice (lungimea
radacinilor imersate in solutie si a tulpinilor) s-au scurs 9 zile, in fiecare zi
verificandu-se nivelul lichidului din cutii (fig. 1).
La trei zile de la debutul experimentului, cand radacinile semintelor germinate
aveau dimensiunile de 1,0 - 1,5 mm, s-a efectuat prelevarea probelor pentru analiza
microscopica a eventualelor efecte genetice al apei reziduale supuse testarii.

Test citotoxicitate ape reziduale cu nitrozamine asupra sp. Triticum aestivum L.

Radacinile s-au detasat de samanta mama si s-au trecut in fixator 3:1 (alcool
77 Cytotoxicity tests of the waste waters on Triticum aestivum

etilic + acid acetic glacial) pentru 24 ore. Pana la analiza microscopica a aspectelor
citogenetice, radacinile tratate s-au mentinut in frigider in alcoole etilic 70%.
Analiza citogenetica propriuzisa a constat in operatiile:
− hidrolizarea timp de 25 minute in acid clorhidric 50%;
− colorarea radacinilor cu reactiv Schiff (fuxina bazica);
− obtinerea de preparate de tip squash prin detasarea virfului
− meristemului radicular, de la cate 20 radacini din fiecare varianta, intr-o
picatura
de acid acetic 45%, pe lama microscopica si zdrobirea preparatului cu un bat de
chibrit, dupa aplicarea lamelei, in scopul raspandirii materialului celular intr-un
singur strat;
− analiza microscopica cu oculare 15X, obiectiv 20X, prin care s-au numarat
anafazele si telofazele normale si cele cu aberatii cromozomiale(fragmente - punti
cromozomiale, cromozomi retardatari, anafaze dezorganizate, micronuclei (4).
Frecventa ana-telofazelor cu aberatii cromozomiale s-a exprimat procentual din
numarul total de ana-telofaze analizate. La sfarsitul perioadei de experimentare, s-au
extras plantele de grau din plase(fig 2), cu atentie pentru a se evita ruperea
radacinilor.

Fig. 2 –Variantele populatiilor de grau al sfarsitul perioade de experimentare

S-a determinat capacitatea de germinare a semintelor de grau prin numararea

celor ramase negerminate, s-au masurat radacinile si tulpinile (hipocotilul) si s-a
determinat masa proaspata, respectiv uscata dupa ce materialul a stat 3 zile la etuva
fixata la 55-60°C.
Rom.Biol.Sci. 78

REZULTATE

1. Efectul genetic al apelor reziduale asupra speciei Triticum aestivum L

Datele obtinute asupra anomaliilor cromozomiale ale meristemului radicular a

plantelor de grau din experiment, s-au prelucrat statistic si sunt redate in tabelul 1.

Tabel 1. Frecventa ana-telofazelor(A,T) meristemului radicular de Triticum aestivum L. tratat

cu apa reziduala industriala

Nr. Varianta Total celule A+T A+T

crt. analizate aberante aberante (%)

1 Control* 992 29 2,92

2 Control** 852 24 2,81
3 10% apa uzata 769 19 2,47
4 25% apa uzata 744 22 2,95
5 50% apa uzata 893 24 2,68
6 100% apa uzata 792 22 2,77

* - apa retea; ** - apa raul Bistrita

Prin analiza datelor din tabelul 1 putem spune ca nu se constata un efect genetic
asupra speciei Triticum aestivum L., germinate si crescute in diferite concentratii de
ape uzate din vopsitorii nici chiar la varianta 6 cu 100% apa reziduala, la care se
produc 2,77% anafaze+telofaze ale meristemului radicular cu anomalii
cromozomiale.
Valorile obtinute prin analiza microscopica a tuturor variantelor experimentale
situate intre 2,47 si 2,95% ana-telofaze aberante difera nesemnificativ de variantele de
control 1 si 2 cu 2,92%, respectiv 2,81%.
O usoara crestere a frecventei aberatiilor cromozomiale pe masura cresterii
concentratiei de apa uzata, nu arata neaparat o relatie liniara doza-efect, fiind in
consecinta nesemnificativa.
Prin urmare, concentratia in care se gasesc diversele substante chimice, rezultate
din procesul tehnologic de vopsire a firelor si fibrelor textile, nu reprezinta un risc
pentru plantele ecosistemelor acvatice si terestre din zona de impact.
Interesant ar fi de testat, componentii preponderenti ai apelor reziduale, in stare
pura sau in diverse dilutii, pentru a se face aprecieri sigure cu privire la un eventual
efect
citogenetic al acestora.

2. Capacitatea de germinare a semintelor de Triticum aestivum L. din experiment

In primele faze ale ontogenezei de crestere si dezvoltare (la 2-3 zile de la

 79 Cytotoxicity tests of the waste waters on Triticum aestivum

debutul experimentului), se pare ca nu se manifesta efecte citotoxice ale apei

reziduale, cel putin in cazul semintelor de grau.

Tabel 2 – Capacitatea de germinare a semintelor de Triticum aestivum L.

Nr. Varianta Nr. seminte Nr. seminte Germinatia (%)
crt. puse la germinat germinate
% C=100
1 Control* 150 126 84 100
2 Control** 150 129 86 102
3 10% apa uzata 150 128 85 101
4 25% apa uzata 150 129 86 102
5 50% apa uzata 150 130 87 103
6 100% apa uzata 150 129 86 102

* - apa retea ** - apa raul Bistrita

Se constata ca procentul de germinare la variantele de imbibare cu apa reziduala

a oscilat intre 85 si 87%, fata de 84-86% la cei doi martori, respectiv la semintele
imbibate cu apa de robinet si apa din raul Bistrita. In aceste conditii nu se poate face
vreo corelatie intre procentele de germinare a semintelor de grau si concentratiile
apelor reziduale din experiment.

3. Influenta tratamentului cu apa reziduala asupra cresterii plantutelor de grau

(test efectuat la 9 zile)

Dupa cum se constata din tabelul 3 si foto 2, influenta nefasta a apei uzate
asupra proceselor de crestere la grau este deosebit de evidenta. Prin urmare, daca la
debutul experimentului, nu se manifesta vre-un efect citotoxic al apelor reziduale
asupra semintelor, dovada fiind germinarea normala a semintelor, pe masura scurgerii
timpului, pana la cele 9 zile de experiment, efectul fiziologic citototxic s-a manifestat
tot mai pregnant asupra proceselor de crestere.
Asupra acestor efecte credem ca este cazul sa precizam un lucru deosebit de
important. Dupa cum se prezinta situatia, se pare ca avem de-a face cu inhibarea
proceselor fiziologice implicate in cresterea plantelor (posibil perturbarea alungirii
celulelor, a ritmului de multiplicare a celulelor, etc)., efecte ce ar putea fi clarificate
prin efectuarea unor teste histo-anatomice asupra plantelor din experiment.
Viabilitatea plantelor de grau tratate cu apa reziduala, cel putin pe perioada de
desfasurare a experimentului, deci in stadiul de plantuta, nu pare a fi serios afectata.
Nu putem insa anticipa ce s-ar fi intamplat daca experimentul ar fi fost extins pe
intreaga perioada de dezvoltare ontogenetica a plantei, pana in fenofazele de inflorire,
de fructificare, de maturare a semintelor si implicit de recoltare a acestora. Este
posibil ca in unele cazuri sa apara stoparea proceselor de crestere si de dezvoltare,
implicit sa se instaleze moartea celulara, mai ales la concentratiile mari de apa uzata.
Rom.Biol.Sci. 80

Revenind asupra ideii de mai sus, supravietuirea – viabilitatea plantutelor de

grau de 9 zile, tratate cu apa reziduala, este in mare, comparabila cu cea a plantelor
martor.
Astfel, din 150 seminte puse la germinat in fiecare varianta, au rezultat 118 –
125 plantute la variantele tratate si 112 – 127 la martori, ale caror masuratori
biometrice sunt redate in tab. nr. 3

Tabel 3 – Dimensiunile radacinilor si tulpinilor plantelor de grau, in varsta de 9 zile, cultivate

in sistem hidroponic in prezenta unor ape reziduale industriale

lungime radacini(mm) lungime tulpini (mm)

Varianta
x sx S% C=100 x sx S% C=100
Control* 91,3 1,5 17 100 132,5 3,2 26 100
Control** 94,7 1,4 17 104 127,6 2,4 27 96
10% apa uzata 16,2 0,5 33 18 72,6 1,7 28 55
25% apa uzata 14,9 1,0 74 16 73,9 1,1 28 56
50% apa uzata 13,2 0,7 65 14 64,9 1,0 49
100% apa uzata 5,3 0,2 39 6 42,4 1,0 32

* - apa de robinet Piatra Neamt

** - apa din raul Bistrita (baraj Batca Doamnei Piatra Neamt)

Lungimea radacinilor plantelor din variantele cu apa reziduala, a realizat

urmatoarele procente din lungime radacinilor plantelor crescute in variantele martor:
18% la concentratia de 10% apa uzata
16% la concentratia de 25% apa uzata
14% la concentratia de 50% apa uzata
6% la concentratia de 100% apa uzata
Se remarca asadar existenta unei relatii directe cauza-efect, respectiv evolutia
descrescatoare a lungimii radacinilor, odata cu cresterea concentratiei de apa uzata
din mediul de cultura. Aceeasi relatie poate fi constatata si in cazul tulpinilor, care isi
reduc lungimea cu 45-51% in cazul concentratiilor de 10 - 50% apa reziduala,
respectiv cu 68% la varianta cu apa reziduala 100%.
Valorile absolute inregistrate la inaltimea tulpinilor au fost de 42 – 74 mm, la
plantele tratate si de 128 – 132 mm la plantele crescute in variantele martor, respectiv
in apa curata. Se observa ca la categoria de apa reziduala utilizata, cel putin in cazul
graului, radacinile sunt mult mai sensibile la stresul poluarii,
Efectele citotoxice asupra cresterii si dezvoltarii acestora, fiind mult mai
evidente decat in cazul tulpinilor. Ne sprijinim afirmatia pe faptul ca la plantele de
grau tratate, radacinile s-au redus drastic cu 82-96%, in timp ce tulpinile si-au redus
dimensiunile cu 44 – 68%, fata de control.
Un alt indice statistic care apare pe langa x (media aritmetica) si Sx (abaterea
 81 Cytotoxicity tests of the waste waters on Triticum aestivum

medie standard), este si S%. Aceasta valoare, da masura variabilitatii plantutelor de

grau intr-o varianta (populatie).
In experimentul de fata, variabilitatea radacinilor si tulpinilor in populatiile
martor, este medie, cu valori cuprinse intre 10 si 20% sau foarte apropiate de acestea.
La variantele tratate, diversitatea dimensiunilor radacinilor si tulpinilor e mai
mare, valorile S% fiind peste cifra 20 si anume:
33 – 74% la radacini si 26 – 28% la tulpini.
Acest lucru reflecta o norma de reactie individuala a plantelor de grau, crescuta
la impactul cu un factor de mediu stresant, ca in cazul mediului de crestere cu diferite
concentratii de apa reziduala industriala, utilizat in experimentul de fata.
Prin determinarea acumularii masei proaspete si uscate a plantelor de grau, se
vor putea decela unele efecte ale impactului compozitiei apelor uzate, asupra cresterii
si dezvoltarii acestora..

4. Influenta tratamentului cu apa reziduala asupra acumularii de masa

proaspata si uscata in populatiile de Triticum aestivum L. din experiment

Valorile absolute inregistrate la determinarea greutatii biomasei proaspete si a

substantei uscate (determinari efectuate la finalizarea experimentului, imediat dupa ce
plantele s-au masurat), nu ne spun mare lucru, intrucat numarul de indivizi din fiecare
varianta experimentala, supus masuratorilor a fost diferit: 112 indivizi la varianta 1
(control apa robinet), 127 la varianta 2 (apa canal Batca Doamnei), 119 la varianta 3
(apa
uzata dilutia 10%), 121 la varianta 4 (apa uzata dilutia 25%), 125 fire la varianta 5
(apa uzata dilutia 50%) si 118 la varianta 6 (apa uzata 100%). Din acest motiv s-a
apelat la alti parametri, edificatori in privinta acumularii de biomasa, cum ar fi
raportul masa uscata/masa proaspata si a cantitatii de masa uscata in masa proaspata
(tabel 4).
Valorile parametrului fiziologic masa uscata/ masa proaspata: Mu/Mp variaza
astfel: - la radacini: 0,097 – la plantele martor 1 (crescute in apa de robinet); 0,142 –la
plantele martor 2 (crescute in apa canal UHE Batca Doamnei) si intre 0,133 – 0,172,
la plantele tratate cu apa reziduala.
Prin urmare putem aprecia o tendinta de crestere a valorilor raportului Mu/Mp,
odata cu cresterea concentratiilor apelor reziduale. la tulpini raportul Mu/Mp are
tendinta de crestere cu valori intre 0,191 – 0,222 si in cazul plantelor de grau crescute
in solutii de apa reziduala, fata de 0,152 – 0,153 la plantele crescute in probele de
control.

Tabel 4 – Masa plantelor din experiment si valorile rapoartelor lor fiziologice

Varianta Masa vegetala (g) Rapoarte fiziologice

radacini tulpini radacini tulpini
Rom.Biol.Sci. 82

p u p u mu/mp %SU C% mu/mp %SU C%

Control* 6,07 0,59 9,69 1,48 0,097 9,72 100 0,153 15,27 100
Control** 8,92 1,27 5,57 0,85 0,142 14,23 146 0,152 15,26 100
10% apa uz. 2,55 0,35 5,22 1,00 0,137 13,72 141 0,191 19,15 125
25% apa uz. 1,43 0,19 5,52 1,08 0,133 13,28 137 0,196 19,56 128
50% apa uz. 2,41 0,37 5,07 1,00 0,154 15,35 158 0,197 19,72 129
100% apa uz. 1,63 0,28 3,82 0,85 0,172 17,17 177 0,212 22,25 146

Legenda. p – proaspat, u – uscat, uz.- uzata

* - apa de robinet Piatra Neamt
** - apa din raul Bistrita (baraj Batca Doamnei Piatra Neamt)

Cel de-al doilea parametru fiziologic, exprima cantitatea de masa uscata din 100
g masa proaspata (tabel 4), ne indica o tendinta de acumulare a unei cantitati mai mari
de material uscat (%), la plantele crescute in apele reziduale. In procente, fata de
martori, valorile obtinute arata o crestere cu 41-77% a acumularilor de substanta
uscata in radacini si de 25-46% in tulpini. Si de aceasta data, ca si in cazul testului de
crestere, se evidentiaza existenta unei corelatii pozitive intre marimea efectului
negativ asupra radacinilor si concentratia de poluanti [1,2,3], in raport cu cel asupra
tulpinilor, probabil din cauza contactului permanent cu apa poluata.
O explicatie mai generala asupra efectelor obtinute la plantele de grau cultivate
in cuve cu apa poluata, ne este sugerata de structura si evolutia in timp, de-a lungul
ontogenezei, a celulelor vegetale, a membranei celulare, a capacitatii de diviziune, de
diferentiere si de asamblare a acestora in tesuturi si organe [4, 5, 6, 7].

CONCLUZII
− inhibarea cresterii plantelor de grau, in paralel cu acumularea de
substanta uscata, la variantele de crestere in apa uzata, s-ar putea datora unor
perturbari fiziologico-biochimice care se pot manifesta prin accelerarea unor
etape ce intervin in evolutia membranei celulare, de natura lipo-proteica, ca la
orice organism viu dublata de un perete celular pecto-celulozic, de protectie
impotriva leziunilor chimice.
− structura celulara a plantelor supuse agresiunii chimice, se pare ca
evolueaza mai repede decat la martor, membranei celulare primare
adaugandu-i-se membrana secundara, caracterizata prin aport semnificativ de
substanta (materie), prin fenomene de tipul cutinizarii, subcerificarii,
cerificarii, mineralizarii, lignificarii, etc.
− ritmul si mecanismul diviziunii celulare pot sa fie alterate sub
actiunea noxelor din apa reziduala, cu repercusiuni asupra procesului de
formare a tesuturilor, de crestere si dezvoltare a plantelor din experiment.
83 Cytotoxicity tests of the waste waters on Triticum aestivum

− efectele biologice inregistrate in experimentul de fata, este posibil sa

fie interpretate ca o reactie de aparare a plantutelor de grau la agresiunea
noxelor din
− mediul de dezvoltare, respectiv din variantele de apa poluata in care
au germinat si crescut.
− de asemenea s-a constatat ca noxele sunt consumate de catre plante,
care au o anumita toleranta la poluanti, motiv pentru care pot fi utilizate in
epurarea efluentilor reziduali.

BIBLIOGRAFIE

1. BUCURESTEANU MARIA, FLORIN FLOREA (2004). The differential elimination

of the noxes from the polluted waters by different species of ecological plants
Lucr.Simp.X de Microbiologie si Biotehnologie, Iasi, 15.16 oct.2004 editura
CORSON, Iasi, pg.497-507
2. MARIA BUCURESTEANU, 2004 The Natural Model of Purification Used in the
Bioremediation of the Anthropic Contaminated Waters Romanian Biological
Sciences vol.II (1-2), 13-22 BUCURESTEANU MARIA (2005). The Evolution of
the Process of Autopurification of Some Water Accumulation in the Bistrita Valley -
Romanian Biological Sciences, vol III (1-2), Bucuresti, 2005 pg. 5-12
3. CALLEJA, M.C., G. Persoone et P. Geladi. (1994). Comparative acute toxicity of
the first 50 multicentre evaluation of in vitro cytotoxicity chemicals to aquatic non-
vertebrates. Arch. Environ. Contam.Toxicol. 26: 69-78.7
4. DUTHIE ET E. PIPP. (1998). Monitoring organic pollution and eutrophication in
the Grand River, Ontario, by means of diatoms. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 55: 1443-
1453.
5. KHANGAROT, B.S. ET P.K. Ray. (1989). Investigation of correlation between
physicochemical properties of metals and their toxicity to the water flea Daphnia
magna Straus. Ecotoxicol. Environ. Saf. 18: 109-120.
6. NORDIN, R.N. ET L.W. POMMEN. (1986). Water quality criteria for nitrogen
(nitrate, nitrite, and ammonia): Technical appendix. Water Quality Criteria. Water
Management Branch, British Columbia Ministry of Environment and Parks. Victoria
(C.-B.) 83p.