POLMERAZ ZNCR REAKSYONU (PZR) VE BTK

BYOTEKNOLOJSNDE YAYGIN UYGULAMALARI

Suat YILMAZ Zbeyir DEVRAN

Narenciye ve Seraclk Aratrma Enstits, Antalya

ZET
Polimeraz zincir reaksiyonu bitki biyoteknoloji almalarnda yaygn olarak kullanlan bir metottur.
Teknik, in vitro koullarnda oligonkleotid primerler kullanlarak DNA polimeraz enzimi tarafndan
DNAnn oaltlmasdr. Ksa sre ierisinde ok kk bir miktar DNA baz dizisinden milyonlarca defa
DNA parac oaltmak mmkndr. Tekniin en nemli zellii; hzl, gvenli ve spesifik olmasdr.
Bu zelliinden dolay, bitki biyoteknolojisinde ok farkl alanlarda kullanlmaktadr. Bunlardan bazlar;
gen klonlamas, patojenlerin tehis ve tespiti, gen aktarlm bitkilerin ve DNA baz dizilerinin
belirlenmesidir.
Anahtar Kelimeler: PCR, PCR metotlar, PCR optimizasyonu, bitki biyoteknolojisi

POLYMERASE CHAIN REACTION AND COMMON APLICATIONS IN

PLANT BIOTECHNOLOGY"

ABSTRACT
Polymerase chain reaction (PCR) is one of the most widespread used method in plant biotechnology.
Technique is an in vitro enzymatic reaction in which small DNA fragments can be amplified by DNA
polymerase enzyme using oligonucleotide primers. In a very short time, millions of DNA fragments can
be amplified from a very small amount of DNA sequences. The most important advantages of PCR is to
be fast, reliable, and specific. Therefore; PCR is used in very different areas of plant biotechnology. Some
of them are gene clonning, detection and identification of plant pathogens, screening of transgenic plants
and sequencing of DNA fragments.
Keywords: PCR, PCR methods, PCR optimization, plant biotecnology

1. GR hzl bir gelime gstermi ve

Hzla artan dnya nfusuna paralel
olarak insanolu, birim alandan daha
kaliteli, yksek verimli, hastalk ve
zararllara kar dayankl rn elde
etmeyi amalamaktadr. Bunun iin
dayankllktan sorumlu genlerin, klasik
slah almalaryla veya gen aktarma
yntemleriyle istenilen bitkilere
aktarlmas ve aktarlan bireylerinde hzl
ekilde belirlenmesi gerekmektedir.
Bununla birlikte kltr bitkilerinde
dayankllk genlerini kimi durumlarda
kran patojenlerin ve zararllarn da hzl
ve gvenli ekilde tehisi ok nemlidir.
Bunlar yeni tekniklerin gelitirilmesi ve
uygulamaya aktarlmasyla
baarlabilmektedir. Bu tekniklerin en
nemlilerinden biriside PCRdr. Teknik
ilk bulunduu 1985 ylndan itibaren
gnmzde bitki biyoteknolojisinin her
alannda yaygn ekilde kullanlmaktadr
(Innis ve Gelfand 1990; Mullis 1990;
Henson ve French, 1993).
Bu makalede; PCRn temel
prensipleri, optimizasyonu, farkl PCR
metodlar ve bitki biyoteknolojisinde
uygulama alanlar hakknda bilgi
verilmitir.
2. PCRIN TEMEL PRENSPLER
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR),
in vitro koullarnda DNA dizilerinin
oaltlmas esasna dayanmaktadr.
PCR; basit, spesifik ve hassas bir
tekniktir (Saiki ve ark, 1985; Mullis,
1990). PCR teknii, temelde
aamadan olumaktadr.
2.1. DNA Zincirinin Almas 3. PCR OPTMZASYONU
(Denaturation):
Kalp DNA (template DNA), 92-95 PCR teknolojisinin gelimesiyle ok
o
Cde 1-2 dakika tutularak ift sarmal farkl PCR uygulamalar da ortaya
yapdaki DNA iplikikleri birbirlerinden kmtr. Bu nedenle, yeni PCR
ayrlmaktadr. DNA zincirini ayrmak uygulamasnn dzenli ve optimum bir
iin, baz durumlarda 5-10 dakika n ekilde almas iin her laboratuarda
stma yapmak gerekebilir (Watson ve yeniden ayarlanmas gerekmektedir
ark., 1992; Hadidi ve ark., 1995). (Hadidi ve ark., 1995). Eer PCR artlar
yeni PCR uygulamas iin uygun bir
2.2. Primerlerin Alan DNA ekilde yeniden ayarlanmazsa baz
Zincirlerine Yapmas (Annealing): problemlerle karlalabilmektedir
Reaksiyon scaklnn, 37-65 oCye (Innis ve Gelfand 1990; Erlich ve ark.,
drlerek oligonkleotid primerlerinin 1991; Hadidi ve ark., 1995). Bu
alan DNA zincirlerinin kendi baz problemler;
dizilerine karlk gelen blgeye
yapmas ilemidir. Bu ilem, 1. PCRdan beklenen rn ya az alnr
retilecek baz uzunluuna bal olarak yada hi alnmaz
30-60 saniyede gereklemektedir (Innis 2. Primerlerin yanl balanmasndan
ve Gelfand 1990). dolay spesifik olmayan bantlar
oluabilir.
2.3. Primer Uzamas (Primer Extesion): 3. Primerler yanl ekilde uzayabilir
DNA zincirleri zerine yapan 4. Primer-dimer oluumu ortaya
primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq kabilir ve bu oluumlar oaltma
DNA polymerase) vastasyla ilemini yavalatr.
uzatlmasdr. Taq DNA polymerase 72 5. Yeni sentezlenen DNA dizilerinde
o
C scaklkta daha iyi alt iin genel mutasyon veya istenilenden farkl diziler
olarak tm oaltma ilemleri bu ortaya kabilir.
scaklkta yaplmaktadr (Erlich ve ark.
1991). PCR sonucunda elde edilen rn, 3.1. PCR alma artlarn Etkileyen
oaltlmas hedeflenen DNA paras ile Faktrler
iki primerin toplam uzunluu kadardr
(Hadidi ve ark., 1995). basamaktan 3.1.1. Enzim Konsantrasyonu:
(denaturation, annealing, primer Dier PCR artlar optimum
extension) oluan ilem, bir PCR devrini seviyede olduu zaman 100 l reaksiyon
temsil eder. Bu ilem, genel olarak 25 ile iin nerilen Taq DNA polimeraz enzim
40 defa tekrar edilerek balangtaki konsantrasyonu 1-2.5 nitedir. Fakat
DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA enzim gereksinimi kullanlan kalp DNA
parac oaltlr. PCR sonucunda elde veya primere gre deiebilir. Enzim
edilen DNA paracklar agaroz veya konsantrasyonu dk olursa elde
poliakrilamit jellerde yrtldkten edilecek rn (DNA) az olur. Enzim
sonra, ethidium bromide (EtBr) veya konsantrasyonu yksek olursa spesifik
gm nitrat (GN) ile boyanarak olmayan bantlar ortaya kabilir (Innis
gzlemlenir (Hadidi ve ark., 1995). ve Gelfand, 1990; Erlich ve ark. 1991;
Yang ve ark., 1992).
3.1.2. Magnezyum Konsantrasyonu: tampon zeltinin 20 oC de pHs 6.8 ile
PCR uygulamalarnda magnezyum 7.8 arasnda deiir. PCR karm
(Mg) iyon konsantrasyonunu ayarlamak ierisine 50 mM KCl ilave edilirse
ok nemlidir. nk Mg primer balanmasn kolaylatrr. Fakat
konsantrasyonu primerlerin alan DNA 50 mMn zerindeki KCl veya 50 mM
zincirlerine yapmasn, kalp DNAnn NaCl Taq DNA polimeraz aktivitesini
alma scakln, PCR sonucunda elde engeller. Ayrca, PCR solsyonuna
edilen DNA kalitesini, primer-dimer ba Jelatin (gelatin), bovine serum albumin
oluumlarn, enzim aktivitesi ve veya Tween 20 deterjan eklenirse
gvenilirliini etkilemektedir. Ayrca, enzimin daha iyi almasna yardmc
Taq DNA polimeraz enziminin iyi bir olurlar. Fakat bu maddeler eklenmeden
ekilde alabilmesi iin; kalp DNA, de PCR protokolleri ok iyi bir ekilde
primerler ve nkleotid bazlar zerinde alabilmektedir (Innis ve Gelfand,
serbest Mg iyonlarnn bulunmas 1990; Demeke ve Adams 1992; Henson
gerekir. Bu yzden 0.5-2.5 mM arasnda ve French 1993).
Mg iyonlarnn dNTP konsantrasyonu
ierisinde bulunmas gerekmektedir 3.1.5. DNA Zincirinin Almas in
(Innis ve Gelfand, 1990; Hadidi ve ark., Gerekli Zaman ve Scaklk:
1995). PCR uygulamalarnda sistemin
almamasnn en nemli sebeplerinden
3.1.3. Deoksinkleotid Trifosfatlar birisi kalp DNA zincirinin veya retilen
(Deoxynucleotide DNA paracnn yeterince
Triphosphates=dNTPs) almamasdr. Genel olarak DNA
Her bir deoksinkleotid (A, G, C, T) molekllerinin 95 oC de 2 dakika
konsantrasyonu 20- 200 M arasnda tutulmas zincirin almas iin yeterli
olduunda genellikle PCR olmaktadr. Fakat GC bazlarnca zengin
uygulamalarndan iyi sonu kalp DNA zincirlerinde bu sre ve
alnabilmektedir. Bu drt bazn scakln fazla olmas istenmektedir
konsantrasyon ierisindeki oran eit (Innis ve Gelfand, 1990; Erlich ve ark.,
olmaldr. Balang stok solsyonu 10 1991).
mM kadar seyreltildikten sonra, kk
hacimlere ayrlarak 20 oC de 3.1.6. Primerlerin Alan DNA
saklanmaldr. dNTP konsantrasyonunun Zincirlerine Yapmas:
yksek olmas yeni sentezlenen DNA Primerlerin alan DNA zincirlerine
dizilerinde istenilenden farkl dizilerin yapmas iin gerekli scaklk derecesi
(misincorporation) hatal olarak ortaya ve zaman aral primerlerin
kmasna sebep olabilir. Bu yzden konsantrasyonu, elde edilecek DNAnn
mmkn olduu kadar dk uzunluu ve kullanlan bazlarn
konsantrasyonda dNTPleri kullanmak kompozisyonuna gre deiir.
PCR spesifikliini ve gvenilirliini Primerlerin kalp DNAya balanmas
artrmaktadr (Innis ve Gelfand, 1990; 37- 65 oC scaklklarda gerekleir.
Hadidi ve ark., 1995; Weising ve ark., Primerler alan DNAya balanmas
1995). srasnda scakln artrlmas DNA
seiciliini artrmaktadr. Dolaysyla
3.1.4. Dier Reaksiyon Unsurlar: primerlerin yanl yerlere balanmas ve
PCR uygulamalarnda genel olarak hatal DNA dizilerinin elde edilmesi
10-50 mM arasnda Tris-HCl tampon nlenmi olmaktadr. zellikle PCR
zeltisi (pH 8.3-8.8) kullanlr. Bu ileminin ilk birka devrinde scakln
artrlmas PCR uygulamasnn gerekmektedir. Primerlerin yapma
hassasiyetini ok ykseltmekte ve scakln hesaplamak iin bir forml
spesifik olarak beklenen DNA gelitirilmitir. Bu forml Tm= 4 (G+C)
paracklar sentezlenmektedir. + 2 (A+T) eklinde ifade edilmitir.
Scakln drlmesi primerlerin hatal Burada Tm yapma scakln, G,C,A
ekilde uzamasna ve yeni sentezlenen ve T ise nkleotid bazlarn ifade
DNA dizilerinde hatal baz etmektedir (Innis ve Gelfand, 1990;
balanmalarna sebep olmaktadr (Innis Dieffenbach ve ark., 1993).
ve Gelfand, 1990; Dieffenbach ve ark., Primerlerin 3 ularndaki baz
1993; Kwok ve ark., 1994). dizilii, primerin yanl veya doru yere
balanmasn belirlemektedir. Eer aa
3.1.7. Primer Uzunluu, ve yukar ynl (upstream ve
Konsantrasyonu ve Yaps: downstream) pirmerlerin karlkl olarak
Primer konsantrasyonunun 0.1-0.5 3 ularnda birbirlerine balanabilecek
M arasnda olmas sistemin iyi baz dizilii (complementarity) mevcut
almasn salamaktadr. Yksek olur ise bu durum istenmeyen primer-
primer konsantrasyonu primerlerin dimer oluumlarna sebep olmaktadr
yanl balanmasna ve spesifik olmayan (Innis ve Gelfand, 1990).
DNA bantlarnn retilmesine sebep
olur. Ayrca primer-dimer oluumunu 3.1.8. Primer uzamas:
tevik ederek elde edilecek rnn Primerlerin DNA polimeraz
(DNA) az olmasna sebep olmaktadr. tarafndan uzatlmas iin gerekli zaman,
Tipik primer uzunluu 16-30 baz oaltlmas hedeflenen kalp DNA
arasnda deimekte fakat genel olarak parasnn uzunluu, kalp DNAnn
18-24 baza (nkleotid) sahip primerler konsantrasyonu ve ortam scaklna
eer primer yapma scakl (Tm) da bal olarak deimektedir. Genel olarak
iyi ayarlanm olursa ok spesifik rn primer uzatlma ilemi 72 oC de
elde edilebilmektedir. Ancak daha ksa yaplmaktadr. nk bu scaklk Taq
(14 bazdan aa) primerlerde baz zel DNA polimeraz enziminin iyi almas
amalar iin kullanlmaktadr (Innis ve iin uygun bir ortam oluturmaktadr.
Gelfand, 1990; Dieffenbach ve ark., Primerlerin uzatlmas iin gerekli sre
1993; Kwok ve ark., 1994). ise baz uzunluuna bal olarak
Primerlerin baz diziliinde Guanin, deimektedir (Innis ve Gelfand, 1990;
Citosin (GC) miktar ve primerlerin Dieffenbach ve ark., 1993).
yapmas iin gerekli scaklk miktar
(Tm) arasnda ok iyi bir iliki kurmak 3.1.9. Devir says:
gerekir. Bu denge salanamad taktirde PCRn alma artlar iyi
PCR uygulamalarndan iyi sonu almak ayarland taktirde 25-40 devir says
mmkn olmamaktadr. Bu bakmdan yeterli olmaktadr. Devir says
primer dizilerinde GC bazlarnn toplam oaltlacak kalp DNA miktar ile
oran % 50 veya daha yukar olmas yakndan ilikilidir. Devir saysnn fazla
istenmektedir. rnein bir primerin baz olmas spesifik olmayan bantlarn ortaya
dizisinde GC oran % 50 ve Tm deeri kmasna, devir saysnn az olmas
56-62 oC arasnda olursa bu primerin retilen DNA miktarnn az olmasna
sorunsuz bir ekilde almas beklenir. sebep olmaktadr (Innis ve Gelfand,
Primerlerin alan DNA kalplarna 1990; Watson ve ark., 1992).
hatasz bir ekilde balanabilmesi iin
yapma scaklnn iyi hesaplanmas 4. PCR METOTLARI

PCR tekniinin bulunmasndan bu
yana teknolojide ok hzl gelimeler
olmu ve buna bal olarak da ok farkl
PCR metotlar gelitirilmitir.
4.1. oaltlmas stenen DNA
Dizisinin Bilindii Durumlarda
Kullanlan PCR Metotlar:
Bu tip PCR metotlarnda
oaltlmas hedeflenen DNA dizisinin
sekans yaps bilimektedir.
Oligonucleotide primer ifti kullanlarak
ift sarmal DNA dizileri Taq DNA
polimeraz enzimi tarafndan 53
ynnde okunmaktadr (Innis ve
Gelfand, 1990; Dieffenbach ve ark.,
1993).
4.1.1. Standart PCR (Standart PCR):
Temel PCR iermektedir. Bir PCR
reaksiyonu iin, 0.5 mllik PCR tp
ierisinde 100 llik bir reaksiyon
oluturmak iin genel olarak aada
belirtilen kimyasallar tpe ilave
edilmektedir:
Kalp DNA (105, 106 hedef molekl)
20 pmol yukar ynl (upstream) primer
20 pmol aa ynl (downstream)
primer
20 mM Tris-HCl (pH 8.3) (20 C)
1.5 mM MgCl2
25 mM KCl*
0.05 % Tween 20*
50 M dNTPs
2 unite Taq DNA polimeraz enzimi
Kalan miktar steril suyla 100 l ye
tamamlanr (Innis ve Gelfand, 1990).
* Bunlar reaksiyona eklenmese de PCR
reaksiyonu alr.
4.1.2. Ters Transkriptaz PCR (Reverse
Transcriptase PCR, RT-PCR):
oaltlmas hedeflenen RNA
(mRNA, tRNA, viral RNA veya viroid
RNAs) nce ters transkriptaz enzimi ile
tamamlayc DNAya (complementary
DNA: cDNA) evrilir ve daha sonra
standart PCR kullanlarak oaltma
ilemi yaplr (Rowhani ve ark., 1995;
MacKenzie ve ark., 1996; Chandler ve
ark., 1998).
4.1.3. Katl PCR (Multiplex PCR):
Bu PCR metodunun aslnda standart
PCR ve RT-PCRdan ok farkl bir yan
yoktur. Farkl olarak ayn kalp DNA
dizisini oaltmak amacyla ayn
reaksiyon ierisine birden fazla primer
ifti ilave edilerek oaltma ilemi
yaplmaktadr. Bu metot arlkl olarak
virs ve viroidlerin genlerinin
oaltlmasnda kullanlmaktadr (Levy
ve ark., 1992; Colined ve ark., 1993;
Minafra ve ark., 1993).
4.1.4. Antiserumla Sabitleme PCR
(Immunocapture PCR):
PCR veya RT-PCR yaplmadan
nce, geni oaltlacak virs steril kat
bir yzey zerinde o virse spesifik
antiserum kullanlarak sabitlenir. Bu
ilemden sonra PCR veya RT-PCR
metotlarna devam edilir ve hedef
virsn geni oaltlr. Bu metot
zellikle bitki virslerinin hastalkl
dokulardan veya vektr bceklerden
izolasyonu ve tanlanmas ilemlerinde
kullanlmaktadr (Nolasco ve ark., 1993;
Rowhani ve ark., 1995; Munford ve
Seal, 1997).
4.1.5. ie PCR (Nested PCR):
PCR tekniinin spesifikliini
artrmak maksadyla Nested PCR, ve
Heminested PCR metotlar
gelitirilmitir. Nested PCR metodunda
iki farkl set primer ifti (P1,P2 ve P3,
P4) kullanlr. lk oaltma ileminde
birinci set primerler (P1, P2) kullanlr.
Bu PCR oaltma ilemi sonucunda elde
edilen DNA dizisi zerinde ikinci set
primerler (P3, P4) kullanlarak yeniden
oaltma ilemi yaplr. kinci set
primerlerin oaltt DNA paras
birinci set primerlerin oaltt DNA 4.1.8. Kademeli Scaklk Drme PCR
parasndan daha ksa ve birinci set (Touchdown PCR):
primerlerin oaltt DNA parasnn Bu teknik, standart PCR
ierisinde yer alr. Heminested PCR almalarna ok benzemektedir. Bu
metodu ise aslnda Nested PCR PCRda farkl olarak primer scaklklar
metodunun aynsdr. Fakat Heminested ilk nce ok yksek tutularak primerlerin
PCR metodunda ikinci PCR oaltma spesifik ekilde hedef diziye balanmas
ilemi iki yeni primer ile deil de sadece amalanmaktadr. Primerin balanma
bir yeni primer (P3) ve bir birinci setten scakl ilk nce 65 oC tutulmakta ve
alnan primer (P1 veya P2) ile her dngde 1oC azaltlarak (10 dng)
yaplmaktadr (Spiegel ve ark., 1996; 56 oCye kadar drlmektedir. 56
o
Rosner ve ark., 1997; Olmos ve ark Cden sonra ise 20-25 dng yaplarak
1997). PCR tamamlanmaktadr. PCR teknii,
DNA dizileri zerindeki belirli bir
4.1.6. Renkli PCR (Colorimetric PCR): blgenin spesifik olarak tespit
Son zamanlarda RT-PCR metodunun edilmesinde kullanlmaktadr (Don ve
spesifikliini ve ELISA serolojik ark., 1991).
ynteminin kullanma kolayln
birletiren bir metotdur. oaltlan DNA 4.1.9. Canl Hcre Belirleyen PCR (Bio
paracklar yeni bir tp ierisine ilave PCR):
edilir. Bu tp nceden biotin ile Bu teknik, arlkl olarak bitki
iaretlenmi, oaltlan DNA patojeni bakterilerin canl olarak tespit
paracklarnn belirli bir blgesine edilmesinde kullanlmaktadr. Tekniin
spesifik problarla kaplanr. Bu problar temeli, hastalkl dokulardan izole edilen
zerindeki biotin, streptavidin ilavesiyle bakterilerin spesifik yada yar spesifik
tespit edilir. Daha sonra da digoxigenin ortamlarda gelitirildikten sonra DNA
veya psoralin iaretleme sitemi izolasyonu yaplmas ve bu DNAdan
kullanlarak oaltlan DNA paracklar PCR reaksiyonu kurulmasna
tespit edilir. Eer sistem hatasz alp dayanmaktadr (Schaad ve ark., 1997).
hedef gen parasn oaltt ise tp
ierisinde renk deiimi ortaya 4.2. oaltlmas stenen DNA
kmaktadr (Kemp ve ark., 1989; Walter Dizilerinin Bilinmedii Durumlarda
ve ark., 1996; Rowhani ve ark.,1998). Kullanlan PCR Metotlar

4.1.7. Damlatma PCR (Spot PCR): Bu tip PCR metodlarnda

Virs veya viroid ieren hastalkl
bitki z suyu ya naylon membran
zerine bir damla damlatlr yada yeni
kesilmi dal veya yaprak paras
membran zerine bastrlarak z
suyunun membrana gemesi salanr. Bu
ilemden sonra bu membran parac
bir mikrofj tp ierisine konularak RT-
PCR ilemi yaplr. Bu teknik zellikle
arazi uygulamalarnda ok yararl
olmaktadr (La Notte ve ark., 1997).
oaltlmas amalanan DNA dizisinin
baz dizilimi ya ok az bilinir veya hi
bilinmez. Bu tip baz dizilerini oaltmak
iin farkl PCR metotlar gelitirilmitir.
4.2.1. Deiken DNA Dizilerinin
Tesadfen oaltlmas (Random
Amplified Polymorphic DNA; RAPD-
PCR):
Bu teknik, DNA dizilii bilinmeyen
veya az bilinen DNA fragmentlerinin
analizlerinin yaplmasnda
kullanlmaktadr. Rastgele hazrlanm
6-10 baz uzunluundaki oligonkleotid ve retilen DNA fragmentlerinden
primerleri ile PCR yaplr ve PCR birinin miktar (balangta fazla olan)
rnleri agaroz jelde yrtlp ethidium ok artar. Ayn zamanda ok miktarda
bromide ile boyanr. Karlatrlan tek iplikikli DNA dizileri retilmi olur.
rnekler arasnda grnen ayn Bu tip tek iplikikli DNA dizileri
(monomorphic) ve farkl (polymorphic) klonlama ilemleri ve farkl
DNA bantlar saylarak sonular uygulamalarda kullanlabilir (Scott ve
deerlendirilmektedir. RAPD-PCR, Deahl 1998).
genetik eitliliin aratrlmasnda,
genom haritalamalarnda youn ekilde 4.3. PCRn Dier Tekniklerle Birlikte
kullanlmaktadr (Williams, 1991; Cenis, Kullanld Metotlar
1993).
Baz molekler almalar, farkl
4.2.2. Ters PCR (Inverse-PCR): yntemlerin birlikte kullanlmas ile
Bilinen DNA dizileri kullanlarak, yaplmaktadr. Bu tekniklerin belli
bilinmeyen DNA dizilerinin basamaklarnda PCR kullanlmaktadr.
oaltlmasnda kullanlmaktadr
(Ochman ve ark., 1988). Tekniin 4.3.1. oaltlan Fragmentlerin
temeli, bilinen sekanslara bitiik olarak Uzunluk Polimorfizmi (Amplified
bulunan fakat bilinmeyen bazlara sahip Fragment Length Polymorphism;
olan DNA bazlarnn oaltlmasnda AFLP):
kullanlmaktadr. Bilinen diziler ters Bu teknikte, genomik DNA iki kesim
evrilerek ie alnd iin bu ekilde (restriksiyon) enzimi ile kesilmekte,
adlandrlmaktadr (Triglia ve ark., kesilen paracklar bu enzimlere uygun
1988). balayclarla (adaptor) balanr
(ligation). Balanlan DNA paracklar,
4.2.4. Kanca PCR (Anchored PCR): AFLP primerlerine birer baz ilave
Bu metot, DNA fragmentinin sadece edilerek n PCR yaplr. Daha sonra bu
bir ucunun baz dizilii bilinip dier primerlerin her birine 2 baz ilave
ucunun bilinmedii durumlarda edildikten sonra (primerlerin biri biotin
kullanlmaktadr. Baz dizilii bilinmeyen veya 33P ile iaretlenir) seici (selektif)
tarafa universal primerler kullanlrken PCR yaplr. Bu PCR rnleri
baz dizilii bilinen tarafa bir primer poliakrilamid jelde yrtldkten sonra
sentezlenerek PCR ilemi yaplr. Bu X-ray filmi zerine grnt aktarlr).
teknik daha ok virs ve viroidlerin gen Metot, genom haritalarnn
dizililerinin tespit edilmesinde yaplmasnda, genom varyebilitesinin
kullanlmaktadr (Loh ve ark., 1989). belirlenmesinde youn ekilde
kullanlmaktadr (Vost ve ark., 1995;
4.2.5. Asymetric PCR: Semblat ve ark., 1998; Tzortzakakis ve
Bu PCR metodu, tek iplikikli DNA ark., 1999).
dizilerinin retilmesinde kullanlr. Bu
amala PCR reaksiyonunda kullanlan 4.3.2. PCR rnnn Enzimle
primerlerin konsantrasyonlar farkl Kesilmesi (PCR-RFLP):
oranlarda (50:1, 100:1 gibi) Baz almalarda PCR rnleri
tutulmaktadr. PCR reaksiyonunda arasnda farkllk grlmez bu durumda
balangtaki primerlerin oranlarnn PCR rnleri bir veya birka kesim
farkl olmas elde edilecek rnnde (restriksiyon) enzimi kullanlarak
farkl oranda oaltlmasna sebep olur kesilmektedir. Bylece allan DNA
rnekleri zerinde varsa farkllklar genomlar ierisindeki aktarlm gen
belirlenebilmektedir (Wetzel ve ark., paras hzl, hassas ve spesifik bir
1991; Devran ve ark., 2002). ekilde PCR teknii ile tespit
edilebilmektedir (McGarvey ve Kaper,
4.3.3. oaltlm DNA Dizilerinin 1991; Scorza ve ark., 1993).
Enzimle Kesilmesi (Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence; CAPS): 5.2. Bitki Patojenlerinin Tespiti ve
zerinde allan organizmann Tehisi:
genomuna zg belli DNA
fragmentlerinin (19-24 merlik Gnmzde bir ok bitki patojeninin
oligonkleotid primerler) sekans genom dizilileri tespit edilmi olup bu
yaplarak bunlara zg primerler patojenler iin spesifik DNA primerleri
oluturulmakta ve bu primerlerle PCR yaplmtr. Bu primerleri kullanarak bir
yaplmaktadr. PCR rnlerinden ok bitki hastalk etmenini ok ksa sre
genelde tek bir DNA band elde ierisinde hassas bir ekilde tehis ve
edilmektedir ve bunlar arasnda herhangi tespit etmek mmkndr (Hadidi ve
bir farkllk yoktur. Bu nedenle kesim Yang, 1990, Bereswill ve ark., 1992,
enzimleri ile PCR rnleri kesilmekte Olmos ve ark., 1998, Ylmaz, 1999).
ve agaroz jelde elektroforez yardm ile Virus ve viroidler, bitkilerin
ayrmlar salanarak farkllk tespit yapraklarndan (Hadidi ve ark., 1992,
edilmektedir (Jarvis ve ark., 1994). Korschineck ve ark., 1991),
ieklerinden (Kohnen ve ark., 1992)
4.3.6. RAPD Bantlarnn Spesifik meyvelerinden (Hadidi ve Yang, 1990),
Primere Dntrlmesi (Sequence kklerinden (Hadidi ve ark., 1993)
Characterized Amplified Region; kabuklarndan (Korschineck ve ark.,
SCAR: 1991), tohumlarndan (Kohnen ve ark.,
Bu teknikte, RAPD sonucu elde 1992, Hadidi ve ark., 1993) ve virus
edilen DNA bandlar klonlanmakta ve tayan bceklerden (Lopez-Moya ve
DNA baz dizilileri belirlenmektedir. Bu ark., 1992), genomdaki eitli blgeler
farkllk gsteren DNA paracnn bir (ITS, rDNA, mtDNA) kullanlarak
blmne 18-24 baz uzunluunda fungus (Mills ve ark., 1992; Ward ve
spesifik primerler dizayn edilmekte ve ark., 1992; Elliott ve ark., 1993)
PCR almasnda kullanlmaktadr. Bu nematod (Harris ve ark., 1990; Devran
teknik haritalama almalarnda, genom ve ark., 2002) ve bakteriler ( Hartung ve
ktphanelerinin taranmasnda ark., 1993) hassas ve hzl bir ekilde
kullanlmaktadr (Michelmore ve ark. tehis ve tespit edilmektedirler.
1993; Weising ve ark., 1995).
5.3. Virs ve Viroid Genlerinin
5. BTK BYOTEKNOLOJSNDE Klonlanmas:
YAYGIN UYGULAMALARI
PCR tekniini kullanarak virs ve
5.1. Gen Aktarlm Bitkilerin Takibi: viroid genlerinin bir blm veya
tamam klonlanabilmektedir. Virs ve
Viral, bakteriyel, fungal ve dier viroidlerin RNA genleri, ters transkriptaz
organizmalardan veya bir bitkiden alnan (reverse transcriptase:RT) enzimi
bir gen parasnn, hedef bir bitkiye kullanarak DNAya evrilir. Bu ileme
aktarlmas sonucunda ortaya kan ters transkripsiyon (reverse
transgenik (gen aktarlm) bitkilerin transcription), sonucunda elde edilen
DNA parasna tamamlayc DNA
(complementary DNA:cDNA) denir
(Puchta ve Sanger, 1989, Watson ve
ark., 1992). Bu cDNA paralar PCR da
oaltlarak uygun vektrlere
klonlanmaktadrlar (Ylmaz, 1999).
5.4. Bitki Patojenlerinin Gen
Dizililerinin PCR Yardmyla Analizi:
Virs, viroid, bakteri, fungus,
nematod vb. bitki patojenlerinin genleri
PCR yardm ile klonlanp gen dizileri
kartlabilmektedir ( Puchta ve Sanger,
1989; Puchta, 1990; Zijlstra ve ark.,
1995).
5.5. Bitki ve Patojenlerin Akrabalk
likilerinin Belirlenmesi:
Gnmzde bir ok bitki ve patojen
trlerinin gen haritalar karlmakta ve
PCR yardmyla akrabalk ilikileri
belirlenmektedir (Karp 2000).
5.6. PCRn Islah almalarnda
Kullanlmas:
Bata hastalk ve zararllara kar
dayankllk olmak zere eitli
karakterlere zg molekler
iaretleyiciler (markers)
oluturulmaktadr. Bu iaretleyiciler
bitki slahn her aamasnda hzl ve
gvenli ekilde kullanlarak slah
almalar ksaltlmaktadr (Vost ve
ark., 1995; Becker ve ark 1995; Madan
ve ark., 1997).
5.7. Safiyet Testlemelerinde:
Tohum retiminde, karklklarn
belirlenmesi ve tohumlarn saflnn
ortaya konulmasnda PCR tekniinden
yararlanlmaktadr (Dow ve Ashley,
1996; Lexxer ve ark., 1999).
5.8. Snflandrmada:
Organizmalarn tr ii, trler aras ve
cins dzeyindeki snflandrlmalar PCR
teknii kullanlarak yaplmaktadr
(Milligan ve ark., 1994).
6. PCRIN AVANTAJLARI VE
DEZAVANTAJLARI
Bu tekniin en nemli avantaj ok
kk miktarda DNA veya RNAnn,
belirli bir blgesi ksa sre ierisinde,
milyarlarca defa oaltlabilmektedir.
Teknik ayn zamanda ok hassas,
spesifik ve gvenilirdir. Elde edilen
rnlerdeki hata pay dier metotlarla
(rnein serolojik yntemler)
karlatrldnda daha dk
olmaktadr.
PCR teknii iin balangta pahal
laboratuar ekipmanlarna ihtiya olmas,
ok iyi eitilmi eleman gereklilii,
kullanlan sarf malzemelerin pahall
ve zaman, zaman bulamalar veya dier
faktrlerden dolay hatal sonular
alnabilmesi tekniin en nemli
dezavantaj oluturmaktadr.
7. KAYNAKLAR
Becker, J., P. Vos, M. Kuiper, F. Salamini and
M. Heun. 1995. Combined mapping of
AFLP and RFLP markers in barley. Mol
Gen Genet, 249:65-73.
Bereswill, S., A. Pahl, P. Bellemann, W. Zeller,
and K. Geider. 1992. Sensitive and
species-specific detection of Erwini
amylovora by polymerase chain reaction
analysis. Applied and Environmental
Microbiology, 58:3522-3526.
Cenis, J.L. 1993. Identification of four major
Meliodogyne spp. by random amplified
polymophic DNA (RAPD-PCR).
Phytopathology, 83:76-80.
Chandler, D.P., C.A. Wagnon and H. Bolton.
1998. Reverse transcriptase (RT)
inhibition of PCR at low concentrations
of template and its implications for
quantitative RT-PCR. Applied and
Environmental Microbiology, 64
(2):669-677.
Colinet, D., J. Kummert, P. Lepoivre and J.
Semal. 1994. Identification of distinct
potyviruses in mixedly-infected
 sweetpotato by the polymerase chain
reaction with degenerate primers.
Phytopathology, 84:65-69.
Demeke, T. and F.P. Adams 1992. The effects of
plant polysaccharides and buffer
addditives on PCR. BioTechniques, 12:
332-335.
Don, R.H., P.T. Cox., B.J. Wainwright, K. Baker
and J.S. Mattick 1991. Touchdown PCR
to circumvent spurious priming during
gene aplification. Nucleic Acids Res.,
19:4008.
Dieffenbach, C.W., T.M.J. Lowe and G.S.
Dveksler. 1993. General concepts for
PCR primer design. PCR Methods and
Applications, 530-537.
Dow, B.D., and Ashley, M.V. 1996.
Microsatellite analysis of seed dispersal
and parentage of saplings in bur oak.
Quercus macrocarpa. Mol. Ecol. 5:615-
627.
Elliott, M.L., Des Jardin, E. A., Henson, J.M.
1993. Use of a polymerase chain
reaction assay to aid in identification of
Gaeumanomyces graminis var. graminis
from different grass hosts.
Phytopathology. 83:414-418.
Erlich, H A, D. H. Gelfand and J. J. Sninsky.
1991. Recent advences in polymerase
chain reaction. Science, 252:1643-1650.
Hadidi, A., and X. Yang. 1990. Detection of
pome fruit viroids enzymatic cDNA
amplification. Journal of Virological
Methods 30:261-270.
Hadidi A, Y. Terai, C. A. Powell, S. E. Scott, J.
C. Desvignes, L. M. brahim, and L.
Levy. 1992. Enzymatic cDNA
amplification of hop stunt viroid variats
from naturally infected fruit crops.Acta
Horticulturae 309:339-342.
Hadidi, A. A. J. Hansen and C. L. Parish. 1993.
Apple scar scin and dapple apple viroids
are seed borne. Acta Hortuculturae
309:297-304
Hadidi A, L. Levy, Podleskis E. V. 1995.
Polymerase chain reaction technology in
plant pathology. In: Molecular Methods
in Plant Pathology, pp.167-187. Eds. R.
P. Singh, U. S. Singh. Boca Raton: CRS
Press.
Harris, T.S., Sandall, L. J., Powers, T. O. 1990.
Identification of single Meloidogyne
juveniles by polymerase chain reaction
amplification of mitochodrial DNA. J.
Nematol. 22: 518-524.
Henson J. M. and Frech, R. 1993. The
polymerase chain reaction and plant
disease diagnosis. Annual Review of
Phytopathology 31:81-109.
Innis, M.A. and D.H. Gelfand. 1990.
Optimization of PCRs In Innis, M.A,
Gelfand, D.H., Sninsky, J.J.and White
T.J (eds.). PCR protocols A guide to
methods and applications.Academic
Press.3-12 pp.
Jarvis, P., C. Lister, V. Saabo, and C. Dean 1994.
Integration of CAPS markers into the
RFLP map generated using recombinant
inbred lines of Arabidopsis thaliana.
Plant Moleculer Biology, 24:685-687.
Kemp, D.J., D.B. Smith, S.J. Foote, N. Samaras
and M.G. Peterson. 1989. Clorimetric
detection of specific DNA segments
amplified by polymerase chain
reactions. Prac. Natl. Acad. Sci.,
86:2423-2427.
Kohnen, P. D., W. G. Dougherty and R. O.
Hampton. Detection of pea seedborne
mosaic potyvirus by sequence specific
enzymatic amplification. Journal of
Virological Methods ,36:51-57.
Korschineck, I., G. Himmler, R. Sagl, H.
Steinkellner, and H. W. Katinger. 1991.
A PCR membrane spot assay for the
detection of plum pox virus RNA in
bark of infected trees. Journal of
Virological Methods, 31:139-145.
Karp, A. 2000. Molecular tools for detecting
genetic diversity in Proc. Int. Symp. On
Meth. and Marks. For Qual. Assur. n
Micropropagation. Eds. A. C. Casells,
B.M. Doyle, R.F.Curry. Acta Hort. 530.
Kwok, S., S-Y. Chang, J.J. Sninsky and A.,
Wang.1994. A guide to the design and
use of mismatched and degenerate
primers. PCR Methods and
Applications, 539-547.
La Notte, P., A. Minafra, and P. Sandarelli. 1997.
A spot-PCR technique for the
detectionof phloem-limited grapvine
viruses. Journal of Virological Methods,
66: 103-108.
Levy, L., A. Hadidi and S.M. Garsey. 1992.
Reverse transcription-polymerase chain
reaction asays for the rapid detection of
citrus viroids using multiplex primer
sets. Proc. Int. Soc. Citriculture, 2:800.
Lexer, C., Heinze, B., Steinkellner, H., Kampfer,
S., Ziegenhagen, B., and Glssl, J. 1999.
Microsatellite analysis of maternal half-
sib families of Querus robur,
pedunculate oak: detection of seed
contamination and inference of the seed
parents from the offspring. Theor. Appl.
Genet. 99:185-191.
Loh, E.Y., J.F. Elliot, S. Cwirla, L. Lanier and
M.M. Davis. 1989. Polymerase chain
reaction with single-sided specificity:
Analysis of T cell receptor chain.
Science, 243:217-223.
Lopez-Moya, J. J., J. Gubero, D. Lopez-Abella,
and J. R. Diaz-Ruiz. 1992. Detectiom of
cauloflower mosaic virus (CaMV) in
single aphids by the polymerase chain
reaction (PCR). Journal of Virological
Methods, 37:129
MacKenzie, D.J, M.A. McLean, S. Mukerji and
M. Green. 1996. Improved RNA
Extraction from woody plants for the
detection of viral pathogens by reverse
transcription polymerase chain reaction.
Plant Disease, 81:222-226.
Madan, M., S. Nair., A. Bhagwat, T.G. Krishna,
M. Ano, C.R. Bhatia and T. Sasaki.
1997. Genome mapping, moleculer
markers and marker-assisted selection in
crop plants. Moleculer Breeding, 3: 87-
115.
McGarvey, P. and J. M. Kaper. 1991. A simple
and rapid method for screening
transgenic plants using the PCR.
BioTechniques, 11:428-433.
Milligan, B.G., Leebens-Mack J., and Strand,
A.E., 1994. Conservation genetics:
beyond the maintenance of marker
diversity. Molec. Ecol. 3:423-435.
Mills, P. R., Sreenivasaprasad, S., Brown, A.E.
1992. Detection and differantiation of
Colletotrichum gloeosporiodes isolates
using PCR. FEMS Nicrobial. Lett.
98:137-144.
Minafra, A., A. Hadidi and P. Sandarelli. 1993.
Sensitive immunocapture and multiplex
reverse transcription-polymerase chain
reaction for the detection of grapevine
leafrol associated virus III and
grapevine virus B, 11th Meeting of the
International Council for the Study of
Viruses and Virus Diseases of the
Grapevine (ICVG), (Abstr.), 137.
Mullis K. B. 1990. The unusual origin of th
polymerase chain reaction. Scientific
American, April:56-61.
Munford, R.A and S.E. Seal. 1997. Rapid single-
tube immunocapture RT-PCR for the
detection of two yam potyviruses.
Journal of Virological Methods, 69: 73-
79.
Nolasco, G., C. de Blas, V. Torres and F. Ponz.
1993. A method combining
immunocapture and PCR amplification
in a microtiter plate for the detection of
plant viruses and subviral pathogens.
Journal of Virological Methods, 45:201-
218.
Ochman, H., A.S. Gerber and D.L. Hartl. 1988.
Genetic application of an inverse
polymerase chain reaction. Genetics,
120:621
Olmos, A., M. Cambra, M. A. Dasi, T.
Candresse, , O. Esteban, M. T. Garris
and M. Asensio 1998. Simultaneous
detection and typing of plum pox
potyvirus (PPV) isolates by heminested
PCR and PCR-ELISA. Journal of
Virological Methods, 68:127-137.
Puchta, H and H. L. Sanger. 1989. Sequence
analysis of minute amounts of viroid
RNA using the polymerase chain
reaction (PCR). Archieves in Virology,
106:335-339
Puchta, H.1990. Nucleotide sequence and
secondary structure of apple scar scin
viroid
(ASSVd) from Chine. Plant Molecular
Biology, 14 (6):1065-1067.
Rosner, A., L. Maslenin and S. Sara. 1997. The
use of short and long PCR products for
improved detection of prunus necrotic
ringspot virus in woody plants. Journal
of Virological Methods, 67: 135-141.
Rowhani, A., M.A. Maningas, L.S. Lile, S.D.
Daubert, and D.A.Golino. 1995.
Development of a detection system for
viruses of woody plants based on PCR
analysis of immobilized virions.
Phytopathology, 85:347-352.
Rowhani, A., L. Biardi, G. Routh, S.D. Daubert
and D.A. Golino.1998. Development of
a sensitive colorimetric-PCR Assay for
detection of viruses in woody plants.
Plant Disease, 82:1-15.
Semblat, J.P., Wajnberg, E., Dalmasso, A.,
Abad, P. Castagnone- Sereno, P. 1998.
High-resolution DNA fingerprinting of
parthenogenetic root-knot nematodes
using AFLP analysis. Molecular
Ecology 7: 119-125.
Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis,
G. T. Horn, H. A. Erlich and N.
Arnheim. 1985. Enzymatic
amplification of B-globulin genomic
sequences and restriction site analysis
for diagnosis of sickle cell anemia.
Science, 230:1350-1354.
Scorza, R., L. Levy, V. Damstegt, M. Yepes, J.
Cordts, A. Hadidi, J. Slighton and D.
Gonsalves. 1993. Plum pox virus
protection in transgenic plum expressing
the papaya rainspot virus coat protein
 gene. 6th International Congress of Plant
Pathology, Canada (Abst.) 192.
Schaad N.W., M Hendson, L.Kumaga,
T.Matsumoto, R.L. Forster and H.
Efstathos 1997. Assessment of the
relablty of a bo-pcr test for routne
detecton of pseudomonas syrngae pv
phaseolcola n commercal seed beans.
http://www.nal.usda.gov/ttic/tektran/dat
a/000008/04/0000080497.html
Scott, D. and K. L Deahl. 1998. The
differentiation of Phytophthora species
that are pathogenic on potatoes by an
asymetric PCR combined with single-
strand conformation polymorphism
analysis. Lett. Appl. Microbiol., 27:39-
44.
Staub, J.E., F.C.Serquen, M. Gupta. 1996.
Genetic markers, map construction, and
their application in plant breeding. Hort
Science, 31 (5):729-741.
Spiegel, S., S.W. Scot, V. Bowman-Vance, Y.
Tam, Galiakparov, N.N. andA. Rosner.
1996. Improved detection of prunus
necrotic ringspot virus by the
polymerase chain reaction. European
Journal of Plant Pathology, 102:681-
685.
Triglia, T., M.G. Peterson and D.J. Kemp. A
procedure for in vitro amplification of
DNA segments that lie outside the
boundaries of known sequences,
Nucleic Acids Res., 16:8186-8190.
Tzortzakakis, E.A. Blok, V.C. Phillips, M.S. and
Trudgill, D.L. 1999. Variation in root-
knot nematode (Meloidogyne spp.) in
Crete in relation to control with resistant
tomato and pepper. Nematology 1 (5):
499-506.
Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, T. Van de Lee,
M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J.
Peleman, M. Kuiper, and M. Zabeau.
1995. AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucleic Acids Research
21: 4407-4414.
Walter, N.G., P. Schwille and E. Manfred. 1996.
Fluorescence correlation analysis of
probe diffusion simplifies quantitative
pathogen detection by PCR. Prac. Natl.
Acad. Sci., 93:1205-12810.
Ward, E., Gray, R. M. 1992. Genaration of a
ribosomal DNA probed by PCR and its
use in identification of fungi within the
Gaeumannomyces-Phialophora
complex. Plant Pathol. 41:730-736.
Watson, J. D., M. Gilman, J. Witkowski and M.
Zoller. 1992. The polymerase chain
reaction In: Recombinant DNA. Second
Edition. New York. 79-98.
Weising, K., H. Nybom., K. Wolff, and W.
Meyer 1995. DNA Fingerprinting in
plants and fungi. CRS Press. Florida.
Wetzel, T., T. Candresse, M. Ravelonandro and
J. Dunez. 1991. A polymerase chain
reaction assay adapted to plum pox
potyvirus detection. Journal of
Virological Methods, 33:355-365.
Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A.
Rafaski and S.V. Tingey 1990. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary
primers are useful as genetic markers.
Nucleic Acids Research, 18:6531-6535.
Yang, X., A. Hadidi and S.M., Garnsey. 1992.
Enzymatic cDNA amplification of citrus
exocortis and cachexia viroids from
infected citrus hosts. Phytopathology,
82: 279.
Zijlstra, C., Lever, A.E.M., Uenk, B.J. and Van
Silfhout, C.H. 1995. Differences
between ITS region of isolates of the
root-knot nematodes Meloidogyne
hapla and M. chitwoodi.
Phytopathology, 85: 1231-1237.
Ylmaz, S. 1999. Developmen of Non-
Radioactive Detection Methods for the
Genomic RNAs of Ilarviruses that
Cause Diseases in Peach and Their Use
in Studying the Molecular Basis of the
Synergistic Interaction Between Prunus
Necrotic Ringspot Virus and Prune
Dwarf Virus. Clemson University,
USA. Dissertation. pp.30-32.