RHEOLOGICAL BEHAVIOR OF CONCENTRATED SKIM MILK DISPERSIONS AS

AFFECTED BY PHYSICOCHEMICAL CONDITIONS: CHANGE IN PH AND CACL2

ADDITION

COMPORTAMIENTO REOLGICO DE DISPERSIONES CONCENTRADAS DE

LECHE DESNATADA AFECTADAS POR CONDICIONES FISICOQUMICAS: CAMBIO
EN EL PH Y ADICIN DE CACL2

Mara Laura Olivares, Natalia Patricia Achkar & Susana Elizabeth Zorrilla

Mara Laura Olivares, Natalia Patricia Achkar & Susana Elizabeth Zorrilla

ABSTRACT

Understanding the behavior of casein micelles (CM) in concentrated regimes is critical for the
design of dairy unit operations such as drying or evaporation but also it is still scarce. In this
work, the effect of the decrease in pH and the addition of a calcium salt on concentrated skim
milk dispersions was examined by rheometric measurements at 25 C. Control samples (S1),
samples with a pH of 5.8 (S2), and samples with 0.04 M CaCl2 addition (S3) at different
concentrations (40, 45, 48, 50, and 52% w/w) were analyzed through flow curves and
oscillatory dynamic data by frequency sweep tests. All samples showed a clear shear thinning
non-Newtonian behavior and a large dependence on concentration, dispersions being more
fluid for samples S2 and S3. A viscosity model for microgels was used to obtain parameters
related to the characteristic structure of systems. It was demonstrated that CM had a similar
structure for the different physicochemical systems studied and that the decrease of pH and
the addition of salt reduced the dispersion stability due to electrostatic and steric potential
energy is depleted. Dynamic data showed that dispersions at the highest concentration had
dominant and similar elastic behavior and weak gel character. A transition regime from fluid to
gel was observed in samples S2 at 45% w/w. No samples obeyed the Cox-Merz rule. This
study allowed gaining more understanding related to the structure of CM systems studied.

KEYWORDS: Casein micelle, Viscosity model, Skim milk dispersions, pH effect, Salt
addition.
 RESUMEN

Comprender el comportamiento de las micelas de casena (MC) en regmenes concentrados

es fundamental para el diseo de operaciones unitarias de productos lcteos, como el secado
o la evaporacin, pero tambin es escaso. En este trabajo, el efecto de la disminucin en el
pH y la adicin de una sal de calcio en dispersiones de leche desnatada concentrada fue
examinanda mediante mediciones reomtricas a 25 C. Se analizaron muestras de control
(S1), muestras con un pH de 5.8 (S2) y muestras con adicin de CaCl2 0.04 M (S3) a diferentes
concentraciones (40, 45, 48, 50 y 52% p/p) a travs de curvas de flujo y datos dinmicos
oscilatorios por pruebas de barrido de frecuencia. Todas las muestras mostraron un claro
adelgazamiento de la cizalla de comportamiento no newtoniano y una gran dependencia de
la concentracin, siendo las dispersiones ms fluidas las muestras S2 y S3. Se us un modelo
de viscosidad para microgeles para obtener parmetros relacionados con la estructura
caracterstica de los sistemas. Se demostr que MC tena una estructura similar para los
diferentes sistemas fisicoqumicos estudiados y que la disminucin del pH y la adicin de sal
reducan la estabilidad de la dispersin debido a la energa potencial estrica y electrosttica
agotada. Los datos dinmicos mostraron que las dispersiones con mayor concentracin tenan
un comportamiento elstico dominante y similar, y naturaleza de gel dbil. Se observ un
rgimen de transicin del fluido para el gel en las muestras S2 al 45% p/p. Ninguna muestra
obedeci la regla de Cox-Merz. Este estudio permiti obtener una mayor comprensin
relacionada con la estructura de los sistemas de MC estudiadas.

PALABRAS CLAVE: Micela de casena, Modelo de viscosidad, Dispersiones de leche

desnatada, Efecto del pH, Adicin de sal.

1. INTRODUCTION

Milk is a rather dilute suspension of highly hydrated colloidal particles, the casein micelles (CM)
and fat. These particles are dispersed in a continuous phase mainly made up of water with
salts, lactose, and whey proteins (Walstra et al. 2006). CM are colloidal assemblies with a
supramolecular association of individual casein molecules: S1, S2, , and -casein. These
fractions are organized within the micelle according to their hydrophobic and hydrophilic
character. The -casein fraction is known to be mainly present on the surface of the micelle,
providing a steric and electrostatic stabilizing outer layer (Dalgleish 2011; Dalgleish and
Corredig 2012; Horne 2006; Horne 2009). Stability of CM can be modified by different
physicochemical changes: variation of pH, alteration of the mineral balance of milk, enzymatic
cleavage of the -casein brush, concentration, heating, etc. (Huppertz and Fox 2006).
1. INTRODUCCIN

La leche es una suspensin bastante diluida de partculas coloidales altamente hidratadas,

las micelas de casena (CM) y la grasa. Estas partculas se dispersan en una fase continua
compuesta principalmente de agua con sales, lactosa y protenas de suero de leche (Walstra
et al., 2006). CM son conjuntos coloidales con una asociacin supramolecular de molculas
de casena individuales: S1, S2, y -casena. Estas fracciones estn organizadas dentro
de la micela de acuerdo con su carcter hidrofbico e hidroflico. Se sabe que la fraccin de
kappa-casena se encuentra principalmente en la superficie de la micela, proporcionando una
capa externa estabilizadora estrica y electrosttica (Dalgleish 2011; Dalgleish y Corredig
2012; Horne 2006; Horne 2009). La estabilidad de CM puede modificarse mediante diferentes
cambios fisicoqumicos: variacin del pH, alteracin del balance mineral de la leche, escisin
enzimtica del cepillo de -casena, concentracin, calentamiento, etc. (Huppertz y Fox 2006).

When milk is concentrated, the presence of CM has a crucial impact on the macroscopic and
functional properties of the obtained products (Liu et al. 2012). Indeed, CM are the main
contributors to the skim milk rheology (Bienvenue et al. 2003; Karlsson et al. 2005; Liu et al.
2012). However, information about how the CM behave and interact in such concentrated
regimes is still scarce (Bouchoux et al. 2009; Dahbi et al. 2010; Dalgleish and Corredig 2012;
Qu et al. 2015). Concentration of skimmed milk is an important unit operation in a number of
dairy processes. In particular, the manufacture of spray dried products such as skimmed milk
powder requires the concentration of milk up to approximately 4050% total solids prior to
spray drying. Concentration alters the physicochemical state of the milk, affecting relevant
process properties such as viscosity, and influencing the functional properties of the final
products (Liu et al. 2012).

Cuando la leche se concentra, la presencia de CM tiene un impacto crucial en las propiedades

macroscpicas y funcionales de los productos obtenidos (Liu et al., 2012). De hecho, CM son
los principales contribuyentes a la reologa de la leche desnatada (Bienvenue et al., 2003,
Karlsson et al., 2005, Liu et al., 2012). Sin embargo, la informacin sobre cmo se comporta
e interacta el CM en tales regmenes concentrados sigue siendo escasa (Bouchoux et al.,
2009, Dahbi et al., 2010, Dalgleish y Corredig, 2012; Qu et al., 2015). La concentracin de
leche desnatada es una operacin unitaria importante en varios procesos lcteos. En
particular, la fabricacin de productos secados por pulverizacin tales como leche en polvo
desnatada requiere la concentracin de leche hasta aproximadamente 40-50% de slidos
totales antes del secado por pulverizacin. La concentracin altera el estado fisicoqumico de
la leche, afectando propiedades relevantes del proceso, como la viscosidad, e influyendo en
las propiedades funcionales de los productos finales (Liu et al., 2012).
In a previous study, we showed that the parameters obtained from a viscosity model for CM
dispersions applied to sets of experimental data from the literature indicate that CM, at high
concentrations, behave as soft spheres or microgels (Olivares et al. 2013), as also suggested
by Mezzenga et al. (2005) and Dahbi et al. (2010). Also, we showed that the pair interaction
energy between CM can be directly obtained from a rheological parameter and it agrees
satisfactorily with the values obtained with a previously proposed DLVO-like theory (Tuinier
and de Kruif 2002). Microgels can be compressed and deformed to a degree that is determined
by their internal cross-link network. Therefore, they can reach effective volume fractions much
greater than the random close packing limit for hard spheres. At such packing, colloidal-state
particles become trapped in cages formed by their neighbors in a jammed state (Menut et al.
2012). In this sense, the precise nature of CM rearrangements in jammed microgel packing
remains elusive, making difficult to disentangle effects of internal and surface properties of the
particle. Therefore, in the present work, we explore the rheology of concentrated skim milk
dispersions affected by pH and calcium salt addition.

En un estudio previo, mostramos que los parmetros obtenidos a partir de un modelo de

viscosidad para dispersiones de CM aplicados a conjuntos de datos experimentales de la
literatura indican que CM, en altas concentraciones, se comportan como esferas blandas o
microgeles (Olivares et al., 2013), como tambin sugerido por Mezzenga et al. (2005) y Dahbi
et al. (2010). Adems, demostramos que la energa de interaccin entre CM se puede obtener
directamente a partir de un parmetro reolgico y concuerda satisfactoriamente con los
valores obtenidos con una teora de tipo DLVO propuesta anteriormente (Tuinier y de Kruif
2002). Los microgeles se pueden comprimir y deformar en un grado determinado por su red
interna de enlaces cruzados. Por lo tanto, pueden alcanzar fracciones de volumen efectivas
mucho mayores que el lmite de empaquetado al azar para esferas duras. En dicho
empaquetamiento, las partculas del estado coloidal quedan atrapadas en jaulas formadas por
sus vecinos en un estado atascado (Menut et al., 2012). En este sentido, la naturaleza precisa
de los reordenamientos de CM en el empaque de microgel atascado sigue siendo difcil de
alcanzar, lo que dificulta el desenmaraamiento de los efectos de las propiedades internas y
superficiales de la partcula. Por lo tanto, en el presente trabajo, exploramos la reologa de las
dispersiones concentradas de leche descremada afectadas por el pH y la adicin de sal de
calcio.
2. MATERIALS AND METHODS

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1 Preparation of milk dispersions

2.1 Preparacin de dispersiones de leche

Skim milk powder (SanCor Cooperativas Unidas Ltda., Sunchales, Argentina) obtained with a
low heat treatment that reduces the level of denatured whey proteins was used to prepare the
concentrates. It is worth mentioning that CM can be subjected to processing and drying, but it
is generally assumed that they have similar structure and properties to native micelles
(Dalgleish and Corredig 2012). To prepare the first group of samples, the desired amount of
powder was gradually added to purified water at 25 C while stirring at moderate speed.
Samples were sealed and maintained at 30 C during 30 min (samples S1). To analyze the
effect of pH, glucono--lactone (GDL, Sigma-Aldrich, USA) was added to the concentrates to
a final concentration of 0.8% w/w (kept at 25 C for 2 h) to obtain a desired pH of 5.8 (samples
S2). This condition was chosen as a pH lower than the physiological one but to avoid micellar
flocculation (Koutina et al. 2015). Also, although at pH 5.8 colloidal calcium phosphate is
partially solubilized and the net charge decreases, CM maintain their global organization
(Karlsson et al. 2007; Rollema and Brinkhuis 1989; Uricanu et al. 2004). Therefore, CM can
be considered as rheological units in the analysis proposed in this study. To analyze the effect
of added salt, the procedure for obtaining samples S1 was used but replacing water by a 0.04
mol.L1 CaCl2 solution as dispersing medium (samples S3). It is worth mentioning that this
calcium concentration is commonly found in commercial supplemented milks. All samples were
prepared at the levels of 40, 45, 48, 50, and 52% w/w. Each dispersion preparation was carried
out in duplicate. Ultrafiltration (UF) permeate was obtained from each preparation by
centrifugation at 3000g for 20 min at 20 C using Vivaspin 15 ultrafiltration units with 50
kg.mol1 molecular weight cutoff (Sartorius, Goettingen, Germany). Sodium azide (0.02% w/v)
was added to reconstituted milk and UF permeate to prevent microbial growth. All samples
were stored overnight at 4 C.

Leche desnatada en polvo (SanCor Cooperativas Unidas Ltda., Sunchales, Argentina)

obtenida con un tratamiento trmico bajo que reduce el nivel de protenas de suero
desnaturalizadas se utiliz para preparar los concentrados. Vale la pena mencionar que CM
puede ser sometido a procesamiento y secado, pero en general se supone que tienen una
estructura y propiedades similares a las micelas nativas (Dalgleish y Corredig 2012). Para
preparar el primer grupo de muestras, la cantidad deseada de polvo se aadi gradualmente
agua purificada a 25 C mientras se agitaba a velocidad moderada. Las muestras se sellaron
y se mantuvieron a 30 C durante 30 min (muestras S1). Para analizar el efecto del pH, se
aadi glucono--lactona (GDL, Sigma-Aldrich, EE. UU.) A los concentrados hasta una
concentracin final de 0,8% p/p (mantenida a 25 C durante 2 h) para obtener un deseado pH
de 5.8 (muestras S2). Esta condicin se eligi como un pH ms bajo que el fisiolgico, pero
para evitar la floculacin micelar (Koutina et al., 2015). Adems, aunque a pH 5.8, el fosfato
clcico coloidal se solubiliza parcialmente y la carga neta disminuye, CM mantiene su
organizacin global (Karlsson et al., 2007; Rollema y Brinkhuis 1989; Uricanu et al., 2004).
Por lo tanto, CM puede considerarse como unidades reolgicas en el anlisis propuesto en
este estudio. Para analizar el efecto de la sal aadida, se us el procedimiento para obtener
muestras S1 pero reemplazando el agua por una solucin de CaCl2 0,04 mol.L-1 como medio
de dispersin (muestras S3). Vale la pena mencionar que esta concentracin de calcio se
encuentra comnmente en leches comerciales suplementadas. Todas las muestras se
prepararon a los niveles de 40, 45, 48, 50 y 52% p/p. Cada preparacin de dispersin se llev
a cabo por duplicado. Se obtuvo permeato de ultrafiltracin (UF) de cada preparacin
mediante centrifugacin a 3000 xg durante 20 minutos a 20C usando unidades de
ultrafiltracin Vivaspin 15 con corte de peso molecular de 50 kg.mol-1 (Sartorius, Goettingen,
Alemania). Se aadi azida sdica (0,02% p/v) a leche reconstituida y permeado UF para
evitar el crecimiento microbiano. Todas las muestras se almacenaron durante la noche a 4 C.

The volume fraction () of each dispersion was calculated from

La fraccin de volumen () de cada dispersin se calcul a partir de

= 0.783
0.35
(1)

= 0.783 0.35 (1)

where W () is the milk powder mass fraction, (g.mL1 ) is the dispersion density at a defined
temperature that was calculated as suggested by Choi and Okos (1986) taking into account
the composition of the skim milk powder used (35% w/w protein, 50% w/ w carbohydrate, 1.5%
w/w fat, 8.5% w/w ash, and 4% w/w moisture), and v is the CM voluminosity (= 4.4 mL.g1 ;
Bouchoux et al. 2009; Dahbi et al. 2010; de Kruif 1998). The percentage of caseins in the total
protein content of milk of 78.3% was used as suggested by Walstra et al. (2006).

donde W (-) es la fraccin de masa de leche en polvo, (g.mL-1) es la densidad de dispersin

a una temperatura definida que se calcul como sugieren Choi y Okos (1986) teniendo en
cuenta la composicin de la leche desnatada en polvo usado (35% p/p de protena, 50% p/p
de carbohidratos, 1.5% p/p de grasa, 8.5% p/p de ceniza, y 4% p/p de humedad), y v es la
voluminosidad de las MC ( = 4.4 mL.g-1; Bouchoux et al., 2009; Dahbi et al., 2010; de Kruif,
1998). El porcentaje de casenas en el contenido total de protena de la leche de 78.3% se
us segn lo sugerido por Walstra et al. (2006).

2.2 Rheometry

Concentrated skim milk dispersions and UF permeates (dispersing fluid) were evaluated with
a rheometer Haake RheoStress RS80 (Haake Instruments Inc., Paramus, NJ, USA) with a
cone-plate geometry (60-mm diameter, 1 angle). All measurements were performed in a
steady strain sweep mode at 25 C after temperature equilibration of the samples.

2.2 Reometra
Las dispersiones concentradas de leche desnatada y los permeamentos UF (fluido
dispersante) se evaluaron con un remetro Haake RheoStress RS80 (Haake Instruments Inc.,
Paramus, NJ, EE. UU.) Con una geometra de placa cnica (60 mm de dimetro, 1 de
ngulo). Todas las mediciones se realizaron en un modo de barrido de deformacin constante
a 25 C despus de equilibrar la temperatura de las muestras.

Flow curves were obtained over the range of 0.001 to 1000 s1 of shear rate. Prior to each
viscosity measurement, the samples were pre-sheared at 1000 s1 during 2 min to erase any
shear history. Samples were allowed to equilibrate for 3 min before starting the measurements.
Dynamic rheological data were obtained by frequency sweep tests from 0.01 to 1 Hz at strain
amplitude of 0.005 5 104. To prevent evaporation from the sample, silicone oil (20 cP)
covered the edge of samples. The linear viscoelastic region was determined by performing
strain sweep tests from 0.001 to 0.1 at 1 Hz. All measurements were performed in duplicate.

Se obtuvieron curvas de flujo en el rango de 0.001 a 1000 s-1 de velocidad de cizallamiento.

Antes de cada medicin de viscosidad, las muestras se cortaron previamente a 1000 s-1
durante 2 min para borrar cualquier ciclo de corte. Las muestras se dejaron equilibrar durante
3 minutos antes de comenzar las mediciones. Los datos reolgicos dinmicos se obtuvieron
mediante pruebas de barrido de frecuencia de 0,01 a 1 Hz a una amplitud de deformacin de
0,005 5 10-4. Para evitar la evaporacin de la muestra, el aceite de silicona (20 cP) cubri
el borde de las muestras. La regin viscoelstica lineal se determin realizando pruebas de
barrido de tensin de 0,001 a 0,1 a 1 Hz. Todas las mediciones se realizaron por duplicado.
2.3 Statistical analysis

2.3 Anlisis estadstico

Data were analyzed by ANOVA using Statgraphics (Statgraphics Inc., Rockville, MD, USA).
When differences between treatment effects were significant (P < 0.05), a multiple comparison
of means was performed.

Los datos se analizaron mediante ANOVA utilizando Statgraphics (Statgraphics Inc.,

Rockville, MD, EE. UU.). Cuando las diferencias entre los efectos del tratamiento fueron
significativas (P < 0.05), se realiz una comparacin mltiple de medias.

3. Theory

3. Teora

3.1 Rheological model: casein micelles considered as microgel particles

3.1 Modelo reolgico: micelas de casena consideradas partculas de microgel

A simple structure of CM as colloidal particles composed of a core of radius a with a brush of

-casein of length H was considered. Thus, the particle hydrodynamic radius is aH =a+ H (Fig.
1). The mean surface-to-surface distance

Se consider una estructura simple de CM como partculas coloidales compuestas de un

ncleo de radio a con un cepillo de kappa-casena de longitud H. Por lo tanto, el radio
hidrodinmico de la partcula es aH = a + H (figura 1). La distancia media superficie a superficie
 Fig. 1 Schematic representation of casein micelles considered as microgel particles

Fig. 1 Representacin esquemtica de micelas de casena consideradas como partculas de

microgel

between cores h (Fig. 1) is related to the core volume fraction by (Berli and Quemada
2000).

entre los ncleos h (figura 1) est relacionada con la fraccin de volumen central de (Berli
y Quemada 2000)

= 2( )1/3 2 (2)

= 2( )1/3 2 (2)

donde es la fraccin mxima de embalaje. Adems, la fraccin de volumen CM es (Berln

y Quemada, 2000)

= ( )3 (3)

= ( )3 (3)