Professional Documents
Culture Documents
Nur YASIN 1)
1)
Jurusan Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung,Jl. Prof. Dr. Sumantri
Brojonegoro 1, Bandar Lampung 35145
ABSTRACT. This research seeks to obtain transgenic crops resistant to Peanut Stripe Virus (PStV)
using Agrobacterium tumefaciens harboring CP (coat protein) gene. The research aim to to evaluate
(1) regeneration process of transgenic crops in tissue culture and (2) transgenic model crop resistance
of Nicotiana benthamiana of T0 generation carrying CP gene and GUS/NPTII against PStV infection.
The results point out that critical stage to regenerate transgenic crops in tissue culture is during
acclimatization period. Transgenic crops of N. benthamiana that performrobust stem growth, have
many roots and leaves in tissue culture in vitro usually indicate better growth in the acclimatization
period. Transgenic N. benthamiana containing the various types of CP-1 gene, CP-2, CP-3, CP-4,
and NPTII/GUS were sucessfuly produced. Moreover, transgenic crop resistance against PStV
occurs due to integration of CP gene, but not because of integration of marker gene or other
processes passed during the activities of Agrobacterium-mediated crop transformation.
31
Yasin. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana......................
tanaman oleh strain virus yang lemah dapat yang mengakibatkan terbentuknya puru pada
menekan dan menunda gejala yang disebabkan tanaman sehingga mengganggu pertumbuhan
oleh infeksi virus kedua yang lebih ganas normal pada tanaman yang terinfeksi. Karena
(virulen). Strategi ini telah digunakan dalam kemampuannya untuk melakukan rekayasa sel
praktek untuk mengurangi kerusakan oleh virus, tanaman secara genetik melalui T-DNA maka
misalnya tomato mosaic virus pada tanaman setiap strain A. tumefaciens secara alami mampu
tomat, citrus tristeza virus pada tanaman jeruk, melakukan rekayasa genetika tanaman.
spindle tuber viroid pada tanaman kentang, dan Patogenisitas bakteri ini setelah direkayasa dapat
papaya ringspot virus pada tanaman pepaya. dihilangkan bahkan dapat diganti gen lain yang
Tetapi, aplikasi dalam skala besar telah bermanfaat bagi tanaman, termasuk gen-gen
mengalami rintangan karena virus yang yang berfungsi bagi ketahanan terhadap infeksi
digunakan untuk proteksi silang ini masih virus (Glick dan Pasternak, 2003).
menyebabkan gejala ringan. Di samping itu,
Virus utuh (virion) terdiri atas asam nukleat dan
virus yang menunjukkan gejala ringan pada satu
coat protein (protein selubung). Gen coat protein
tanaman dapat menimbulkan penyakit yang lebih
(CP) kini telah dapat dimanfaatkan dalam
parah pada spesies lainnya, virus dapat
rekayasa genetika tanaman. Bila tanaman
mengalami mutasi sehingga menjadi lebih ganas,
transgenik mengekspresikan coat protein
atau virus bekerja secara sinergistik dengan virus
kemampuan virus untuk menginfeksi tanaman
yang bukan kerabat sehingga menimbulkan
tersebut dan untuk menyebar secara sistemik
pengaruh yang lebih merusak. Beberapa
sangat berkurang, meskipun mekanisme
kelemahan ini dapat diatasi bila digunakan gen
penghambatan gen CP terhadap replikasi virus
virus tunggal yang ditransfer ke tanaman, bukan
secara tepat belum diketahui (Glick dan
virus utuh, misalnya gen protein selubung
Pasternak, 2003). Gen CP telah digunakan
(Stiekema dan Visser, 1991). Dengan cara ini
dalam penelitian untuk mendapatkan tanaman
dapat dibuat varietas tanaman yang tahan
kedelai transgenik yang tahan terhadap Soybean
terhadap virus.
dwarf virus (Tougou et al., 2007). Penelitian
Penggunaan varietas tahan mempunyai yang menggunakan gen CP dari PAMV (potato
beberapa keuntungan yaitu biaya penanaman aucuba mosaic vi-rus) yang telah mengalami
menjadi lebih ekonomis bagi petani, mengurangi delesi (dihilangkannya sebagian nukleotida dari
masalah lingkungan yang disebabkan oleh gen CP) telah dilakukan oleh Leclerc dan
pestisida, dan dianggap sebagai cara AbouHaidar (1995).
pengendalian yang paling efektif dalam jangka
Dalam penelitian ini digunakan 4 tipe konstruksi
panjang (Hull, 1990). Varietas yang tahan
gen CP yang ditransformasi ke tanaman model
terhadap virus dewasa ini bisa diusahakan
Nicotiana benthamiana dengan bantuan A.
dengan memanfaatkan kemajuan ilmu
tumefaciens AGL0. Inokulasi virus untuk
pengetahuan di bidang biologi molekuler
pengujian ketahanan tanaman transgenik model
tanaman dan rekayasa genetika.
terhadap PStV (Peanut Stripe Virus)
Perkembangan teknologi DNA rekombinan telah menggunakan cara mekanik.
memberikan harapan dan ca-krawala baru dalam
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi (1)
mengatasi penyakit yang disebabkan oleh virus
transformasi genetik (proses rekayasa genetika)
tanaman. Transfer gen pada tanaman telah
tanaman dan (2) ketahanan tanaman transgenik
dapat menghasilkan tanaman transgenik yang
model (Nicotiana benthamiana) generasi T0 yang
mengandung gen asing yang berfungsi dan
membawa beberapa tipe gen CP (Tabel 1) dan
terintegrasi ke dalam genom tanaman tersebut.
gen GUS terhadap infeksi PStV. Beberapa
Dalam hal ini contohnya adalah dihasilkannya
tanaman yang diuji adalah (a) tanaman
tanaman transgenik dengan kualitas dan
transgenik yang membawa tipe gen CP PStV
kuantitas produksi yang lebih baik atau yang
sebagaimana yang dipunyai oleh cistron CP dari
lebih tahan penyakit (Uchimiya, Handa, dan Brar,
genom PStV (gen CP-1), (b) tanaman transgenik
1989).
dengan gen CP PStV yang telah mengalami
Beberapa metode telah dikembangkan untuk mutasi titik alias kehilangan DAG-box motif-nya
membuat tanaman transgenik. Salah satu (gen CP-2) , (c) tanaman transgenik dengan gen
metodenya adalah penggunaan Agrobacterium CP PStV yang mengekspresikan mRNA dan
tumefaciens. Bakteri ini se-sungguhnya mRNA-nya yang tidak dapat ditranslasi menjadi
merupakan patogen bagi tumbuhan, yang dapat protein (gen CP-3), dan (d) tanaman transgenik
mentransformasi sel-sel tanaman secara genetik dengan gen CP PStV yang mengekspresikan
32
Biospecies, Volume 2 No. 2, Juni 2009, hlm 31 - 37
bagian tengah CP (gen CP-4). dengan antibiotik (Draper, Scott, dan Hamil,
1988). Transformasi dalam penelitian ini selain
BAHAN DAN METODE menggunakan konstruksi 4 tipe gen CP PStV
(Tabel 1) juga menggunakan gen marker (GUS)
Pada dasarnya transformasi tanaman dilakukan yang ditransfer ke tanaman tembakau Nicotiana
melalui tiga tahapan penting yaitu inokulasi benthamiana dengan bantuan Agrobacterium
eksplan dengan kultur Agrobacterium, kokultivasi tumefaciens.
dalam periode pendek, dan eliminasi bakteri
33
Yasin. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana......................
parafilm kemudian dikocok pelan-pelan pada tersebut diinkubasikan pada suhu 25—28oC dan
shaker selama 5—10 menit. Selanjutnya, dijaga dalam kondisi kelembaban tinggi dan
potongan daun yang telah diinokulasi secara bertahap dikurangi sampai kondisi
dipindahkan ke kertas tissu steril pada cawan kelembaban normal. Pada minggu kedua
petri untuk menyerap kelebihan cairan dan plantlet dipindahkan ke rumah plastik yang
suspensi bakteri. dinaungi dan pada minggu ketiga sungkup
dibuka. Pada minggu keempat plantlet
Kokultivasi. Kokultivasi potongan daun dengan
dipindahkan ke polibag yang berisi media tanam
Agrobacterium dilakukan dengan menanam
campuran kompos:pasir = 1:1 (v/v) dan tanaman
potongan daun tersebut dalam botol yang berisi
transgenik T0 yang didapat dipelihara dalam
media regenerasi (media agar) tanpa antibiotik.
rumah plastik kedap serangga sampai berbuah.
Pada tahap ini daun-daun ditata/disusun agak
Tanaman tembakau yang telah berbuah dijaga
padat dalam media regenerasi. Botol disegel
agar buahnya tidak sampai pecah sehingga biji-
dan diinkubasi dalam almari es pada suhu 15oC
biji tembakau tidak sampai jatuh berguguran.
selama satu hari. Setelah melewati masa
Buah tembakau yang kulitnya telah berwarna
kokultivasi, eksplan dicuci dengan aquades steril
hijau tua diamati biji-biji yang ada di dalamnya.
beberapa kali sampai aquades tampak bening
Jika biji-biji di dalam buah tersebut telah
dan akhirnya dicuci dengan 50 ml media
berwarna hitam semua maka buah segera dipetik
regenerasi cair yang mengandung cefotaksim
dan diberi label untuk dijemur atau dikering-
(300 mg/l).
anginkan. Bila buah tembakau telah kering kulit
Regenerasi tanaman transgenik. buah dibuang dan bijinya disimpan. Biji yang
pertama dihasilkan ini merupakan biji atau benih
Eksplan yang telah dibersihkan dipindahkan ke T0:1. Biji-biji T0:1 dari tanaman transgenik CP-1,
media regenerasi padat yang mengandung CP-2, CP-3, dan transgenik CP-4 setelah
antibiotik cefotaksim 300 mg/l selama 3—5 hari.
ditanam kemudian diuji dengan PStV.
Setelah itu, eksplan dicuci kembali sebagaimana
sebelumnya dan ditanam pada media regenerasi Uji Ketahanan N. benthamiana Transgenik
yang mengandung cefotaksim (300 mg/l) dan terhadap PStV
kanamisin (100 mg/l) hingga membentuk tunas
Untuk menentukan keefektifan gen CP
(1—2 bulan). Setelah tunas yang terbentuk
PStV yang diuji, populasi tanaman transgenik
memanjang, tunas dipotong menjadi 3 bagian
yang masing-masing membawa satu tipe gen CP
untuk perbanyakan dan ditanam bersama dalam
diinokulasi dengan PStV dan respon tanaman
botol media yang mengandung cefotaksim dan
terhadap inokulasi virusnya ditentukan
kanamisin. Jika 3 eksplan ini telah tumbuh
berdasarkan ada tidaknya replikasi dan
dengan baik maka 1 eksplan disubkultur di
penyebaran PStV di dalam tanaman transgenik.
media regenerasi yang mengandung cefotaksim
Sebagai pembanding, tanaman transgenik yang
dan kanamisin untuk konservasi (disimpan)
membawa gen marker NPTII/GUS dan tanaman
dalam bentuk kultur. Dua eksplan lainnya
normal yang tidak membawa gen marker atau
ditanam di media perakaran (MS0). Jika plantlet
gen CP PStV juga diinokulasikan virus yang
dari 2 eksplan ini telah berakar dengan baik
sama.
maka 1 plantlet dibersihkan dari agar kemudian
dipindahkan ke media tanah untuk aklimatisasi Sumber inokulum. Perbanyakan sumber
dan 1 plantlet lagi untuk disubkultur lagi ke media inokulum dilakukan pada tanaman kacang tanah
perakaran untuk cadangan jika planlet yang cv kelinci yang diinokulasi secara mekanik
diaklimatisasi mati. dengan PStV isolat Bogor yang tergolong
sebagai isolat "severe bloth-stripe" (Akin, 1998).
Aklimatisasi dan Produksi Benih T0:1
Inang kacang tanah umur 10 hari sesudah tanam
Untuk memindahkan plantlet dari media invitro yang ditumbuhkan dalam kantong plastik (20—25
(media steril) ke media ex vitro (media tanah) tanaman tiap kantong) diinokulasi dengan cara
memerlukan tahapan aklimatisasi. Plantlet yang mengoleskan cairan inokulum yang mengandung
telah berakar dengan baik dibersihkan agarnya isolat PStV tersebut pada dua daunnya. Ketika
dari perakaran kemudian dicelupkan ke dalam gejala infeksi PStV telah muncul (kurang lebih 10
larutan fungisida Dithane (1g/l) dan dipindahkan hari), daun kacang tanah yang menunjukkan
ke pot plastik yang berisi media tanah steril yang gejala siap digunakan sebagai sumber inokulum
telah disiram pupuk N-P-K cair (0,5 gr/l) dan untuk pengujian tanaman transgenik. Setelah
disungkup dengan botol untuk mengurangi inang kacang tanah berumur 35 hari, penyegaran
penguapan. Pada minggu pertama planlet kembali sumber inokulum PStV dilakukan
34
Biospecies, Volume 2 No. 2, Juni 2009, hlm 31 - 37
∑ tanaman yang
Gen yang ∑ tunas yang ∑ tanaman
∑ transforman ∑ plantlet hidup di rumah
diintroduksikan didapatkan berbiji*)
kaca
CP-1 26 18 16 9 2
CP-2 17 25 24 14 6
CP-3 10 54 50 24 17
CP-4 18 43 38 17 6
GUS 21 40 37 24 12
92 180 165 88 43
Persentase 100% 100% 92% 49% 24%
)
* Sebagian tunas/tanaman merupakan hasil perbanyakan vegetatif dari transforman
yang sama
Jumlah tunas yang dihasilkan dari proses menyebabkan terjadinya perubahan suhu,
transformasi dan perkembangannya dapat dilihat kelembaban, dan faktor lingkungan lainnya. Dari
pada Tabel 2. Dari data tersebut dapat dilihat 180 pucuk calon tanaman transgenik yang
bahwa masa kritis untuk regenerasi tanaman didapat dari proses transformasi yang berhasil
transgenik hasil kultur jaringan adalah tahapan menjadi tanaman di rumah kaca setelah
aklimatisasi. Tanaman transgenik N. diaklimatisasi hanya 88 tanaman (49%).
benthamiana yang pertumbuhannya baik dengan Selanjutnya, dari 88 tanaman yang didapat
batang lebih besar, akar dan daun yang banyak tersebut hanya 43 tanaman transgenik generasi
dalam kultur in vitro, biasanya akan lebih berhasil T0 (24%) yang dapat menghasilkan biji T0:1.
diaklimatisasi sehingga menjadi tanaman yang Untuk gen CP PStV tipe CP-1 didapatkan dua
tumbuh di rumah plastik, karena pada tahapan ini genotip tanaman transgenik yang menghasilkan
plantlet yang diregenerasikan dipindahkan dari biji, sedangkan untuk tipe CP-2 — 5 genotipe,
kondisi in vitro ke kondisi ex vitro yang tipe CP-3 — 6 genotipe, CP-4 — 6 genotipe.
35
Yasin. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana......................
Untuk gen marker NPTII/GUS didapat 7 genotipe genetik. Sepuluh tanaman ini kemudian
tanaman transgenik yang menghasilkan biji T0:1. ditransfer ke rumah kaca, empat tanaman mati
Tidak semua tanaman transgenik dapat tumbuh tetapi enam tanaman ternyata fertil dan
dan berkembang sampai menghasilkan biji. menghasilkan biji T1.
Beberapa tanaman telah mati ketika masih dalam Respon tanaman tahan atau rentan
bentuk plantlet, dan beberapa lagi mengalami terhadap PStV ditunjukkan oleh daun tanaman
kematian ketika tanaman berada di rumah kaca. indikator Chenopodium amaranticolor yang telah
Kebanyakan tanaman yang mati ini belum diolesi cairan perasan daun tanaman transgenik.
berbunga, hanya beberapa tanaman saja yang Tanaman transgenik yang tahan PStV tidak
sudah berbunga kemudian mati sebelum dapat menularkan inokulum PStV pada daun
menghasilan biji. Ada juga tanaman yang sudah tanaman indikator. Sedangkan tanaman
menghasilkan biji yang masih muda (biji belum transgenik yang rentan dapat terinfeksi PStV dan
masak) kemudian mati. dapat menularkan inokulum PStV pada daun
Ketahanan Tanaman Transgenik terhadap tanaman indikator sehingga timbul gejala lesio
PStV lokal pada daun tanaman indikator tersebut.
Respon tanaman T0 terhadap PStV telah Gejala lesio lokal ini mulai muncul 3 hari setelah
diuji. Beberapa tanaman transgenik inokulasi berupa bintik kecil, tetapi untuk
menunjukkan respon tahan terhadap PStV, ada memastikan bahwa bintik adalah gejala lesio
juga tanaman yang rentan terhadap PStV. lokal maka pengamatan dan pendataan gejala
Tanaman kontrol yang terdiri dari tanaman dilakukan 10 hari setelah inokulasi. Bintik yang
transgenik NPTII/GUS dan tanaman non benar-benar berupa lesio lokal menjadi lebih
transgenik semuanya rentan terhadap PStV. besar atau luas sedangkan bintik yang bukan
Dengan demikian ketahanan tanaman lesio lokal tetap kecil.
transgenik terhadap PStV terjadi akibat integrasi Respon tanaman T0 terhadap PStV
gen CP dan bukan karena integrasi gen marker dapat dilihat pada Tabel 3. Sebagian tanaman
atau karena proses-proses lain yang dilalui hasil transformasi masing-masing tipe gen CP
dalam kegiatan transformasi tanaman dengan tersebut tahan terhadap PStV dan sebagian
bantuan Agrobacterium. Gen CP juga telah lainnya rentan terhadap PStV. Hull (2003)
berhasil digunakan dalam penelitian lain, pada menyatakan bahwa gejala ketahanan tanaman
tanaman kedelai yang menggunakan gen CP akibat transformasi genetik gen CP dikenal
SbDV (Soybean Dwarf Virus). Dalam penelitian dengan ketahanan yang dimediasi coat protein
yang telah dilakukan oleh Tougou et al., (2007) (CPMR = Coat Protein Mediated Resistance).
diperoleh 10 tanaman kedelai hasil transformasi
Tabel 3. Respon tanaman transgenik generasi T0 terhadap PStV
36
Biospecies, Volume 2 No. 2, Juni 2009, hlm 31 - 37
37