JSV 31 (2), Desember 2013 .

JURNAL
SAINVETERINER
ISSN : 0126 - 0421

Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan

Injeksi Obat Hewan Enrofloksasin

Validation of the Spectrophotometry method on the concentration assessment of

Enrofloxacine as the animal drug

Ambarwati" Novida AriyaDil daD Maria Fatima Palupi'

I Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan, Gunungsindur Bogor 16340
Email: ambarthiwa@gmail.com

Abstract

Validation for analysis of enrofloxacin injection method using spectrophotometry has been conducted.
Enrofloksasin in a solution ofNaOH (sodium hydroxide) 0.1 N, measured at the maximum wavelength (A) 271
nm. The parameters of validation that were carried out are precision, accuracy, linearity, limit of detection and
limit of quantitation. Precision showed good results with coefficien variation (CV) results smaller than that of
CV Horwitz. Accuracy parameters calculated by the method of analysis to determine levels of analyte in a known
active ingredient purity and yielded 0.449%. Linearity parameters showed good results with r = 0.9996. Limit of
detection value was obtained for 0.757 flg / mL and limit of quantification of 2.522 flg / mL. The results of
validation test of enrofloxacin injection analysis using spectrophotometric method can be used as a good method
to provide a valid test of quality assurance veterinary drugs.

Key words: validation, enrofloxacin, spectrophotometry, precision, accuracy

Abstrak

Telah dilakukan validasi terhadap metode uji kadar obat hewan enrofloksasin dalam bentuk sediaan injeksi,
digunakan metode spektrofotometri. Enrofloksasin dalam larutan NaOH (natrium hidroksida) 0, 1 N, diukur
pada panjang gelombang maksimum (A)271 nm. Parameter validasi yang digunakan antara lain: presisi, akurasi,
linearitas, batas deteksi dan batas kuantitasi. Parameter presisi menunjukkan hasil yang baik, dengan nilai
koefisien variasi (CV) hasil uji lebih kecil daripada CV Horwitz. Parameter akurasi dihitung dengan metode
analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan aktifyang diketahui kemumiannya dan memberikan hasil
0,449 %. Parameter linearitas menunjukkanhasil yang baik dengan nilai r = 0,9996.Nilai batas deteksi diperoleh
sebesar 0,757 flg/mL dan nilai batas kuantitasi sebesar 2,522 flg/mL. Hasil validasi uji kadar enrofloksasin
bentuk sediaan injeksi dengan metode spektrofotometri memberikan hasi1 yang dapat diterima dan dapat
digunakan sebagai metode yang valid untuk menjamin mutu hasil uji obat hewan.

Kata kUDCi:validasi, enrofloksasin, spektrofotometri, presisi, akurasi

266

-- - ---- -- -- -
Ambarwati et al.
Pendahuluan
Salah satu misi, tugas dan fungsi Balai Besar
Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan
(BBPMSOH) dalam SK Menteri Pertanian No.
628/Kpts/OT.140/12/2003 adalah melaksanakan
pengembangan tehnik dan metoda pengujian mutu
obat hewan. Balai Besar Pengujian Mutu dan
Sertifikasi Obat Hewan, selaku laboratorium penguji
harus melakukan validasi terhadap metode baku
yang dimodifikasi, dengan berpedoman pada ISO
SNI/IEC 17025:2008.
Menurut ISO IEC 17025:2008, validasi adalah
konfirmasi melalui pengujian dan penyediaan bukti
obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud terpenuhi (Hadi, 2007). Salah satu jenis
validasi adalah validasi metode analisis/pengujian
(Aswad dkk., 2011). Metode pengujian ialah
prosedur tertentu untuk melaksanakan pengujian.
Validasi metode pengujian adalah suatu tindakan
penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan
percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter unjuk
kerja pengujian antara lain adalah presisi
(keseksamaanlrepitabilitas), akurasi (kecermatan)
(Shelke dkk., 2009), spesifisitas (selektifitas), batas
deteksi, batas kuantitasi, rentang linearitas, kekuatan
(robustness) dan ketangguhan (rudgedness) (Hadi,
2007; Harmita, 2004). Pemilihan parameter yang
akan diuji tergantung dari jenis dan metode
pengujian yang akan divalidasi.
Penggunaan metode yang valid memegang
peranan yang penting guna mendapatkan data yang
valid dari suatu laboratorium, di samping pengujian
dilakukan oleh personel yang kompeten, dengan
267
instrumentasi yang telah terkalibrasi serta sumber
daya laboratorium yang mendukung. Tujuan
memvalidasi metode adalah untuk mengetahui
sejauh mana penyimpangan metode tidak dapat
dihindari pada kondisi normal, dengan seluruh
elemen terkait telah terlaksana dengan baik dan
benar (Hadi, 2007).
Validasi metode sangat diperlukan oleh
laboratorium, karena dapat mengetahui tingkat
kepercayaan yang dihasilkan dari suatu metode
pengujian (Hadi, 2007). Hasil validasi metode
analisis dapat digunakan sebagai bahan acuan untuk
menentukan apakah metode terse but dapat
digunakan untuk pengujian mutu secara rutin atau
tidak. Validasi ulang perlu dilakukan meskipun
validasi sebelumnya menghasilkan data yang sesuai
dengan kriteria penerimaan, karena metode yang
dinyatakan valid pada kondisi tertentu belum pasti
valid pada kondisi lain dikarenakan perbedaan
peralatan dan pereaksi yang digunakan, analis yang
mengerjakan, waktu dan sebagainya (Oktavia,
2006). Selain itu, validasi metode merupakan salah
satu bentuk jaminan mutu hasil kepada pelanggan,
dengan metode yang digunakan telah terbukti baik,
maka hasil yang dikeluarkan oleh BBPMSOH
adalah valid.
Enrofloksasin merupakan fluorokuinolon
pertama yang diperkenalkan dan digunakan sebagai
obat hewan (Zahid dan Isnindar, 2013).
Kemoterapeutika ini adalah senyawa quinolon
pertama yang digunakan dalam veteriner, yang
mempunyai aktivitas antibakterisidal dan
berspektrum antimikrobial luas terhadap
mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif
(Dimitrova dkk., 2006) serta aktif baik pada fase
diam maupun fase pertumbuhan dari replikasi
 Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat

bakteri dengan absorbsi yang lebih baik dan dapat 2012). Peningkatan jumlah sampel yang cukup
mencapai jaringan lebih cepat (Zahid dan Isnindar, signifikan dan pentingnya memberikan jaminan
2013). mutu hasil pengujian obat hewan dengan hasil uji
Enrofloksasin secara kimia dikenal sebagai 3- yang valid maka perlu dilakukan validasi terhadap
kuinolin asam karboksilat, l-siklopropil- 7-(4-etil-l- metode pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk
piperazinil)-6- fluoro-1 ,4-dihidro-4-okso, dengan memvalidasi metode analisis kadar enrofloksasin
rumus empiris C9H22FN303
dan berat molekul dari sediaan injeksi menggunakan spektrofotometer
359,4 g/mol (Gambar I). Serbuk kristal berbentuk dengan cara melakukan dan menguraikan tehnik
jarum berwama putih atau agak kuning, tidak berbau validasi metode analisis.
dan berasa dan tersedia dalam garam hidroklorida,
laktat dan sodium. Enrofloksasin sangat larut dalam Materi dan Metode
as am at au bas a media, larut dalam
dimetilformamida, sedikit larut dalam kloroform,
Bahan yang disiapkan yaitu sampel obat hewan
metanol dan tidak larut dalam air (Zahid dan
injeksi yang mengandung enrofloksasin, natrium
Isnindar,2013).
hidroksida/N aOH (Merck) dan standar
o 0
enrofloksasin (Sigma-Fluka). Alat yang dipakai
F
...0 dalam pengujian adalah sebagai berikut: neraca
digital (Libror), magnetic stirrer, vortex mixer
Nl (Iuchi), labu ukur 50 mL, 100 mL, 1000 mL (Scott-
~N1 Duran), pipet volumetrik (Pyrex-Iwaki-A), kuvet
CH]
Gambar 1. Struktur kimia enrofloksasin
dan spektrofotometer UV-Vis double beam
(Shimadzu).

Enrofloksasin memiliki aktivitas antibakteri

Uji Presisi
berspektrum luas terhadap bakteri Gram negatif dan
Sejumlah sampel setara dengan 50-100 mg
Gram positif dan aktif baik pada fase diam maupun
enrofloksasin dipipet dan dimasukkan ke dalam labu
pertumbuhan dari replikasi bakteri. Enrofloksasin
ukur 50 mL dan diencerkan dengan pelarut NaOH
tidak membentuk ikatan komplek dengan protein
0,1 N. Pengenceran bertingkat dibuat menggunakan
plasma, sehingga memungkinkan metabolit secara
pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh konsentrasi
bebas melewati membran plasma (Mitchell, 2006).
akhir 10 ~g/mL (Anonim, 2009).
Enrofloksasin merupakan antimikrobia yang
Standar enrofloksasin ditimbang dengan tepat
cukup luas dikenal di dunia veteriner. Jumlah obat
10 mg, kemudian dibuat pengenceran bertingkat
hewan yang mengandung enrofloksasin dan telah
digunakan pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh
terdaftar di Indonesia terus meningkat dari 62
konsentrasi akhir 10 ~g!mL. Absorbansi sampel
produk enrofloksasin pada tahun 2009 menjadi 73
diukur dengan spektrofotometer UV/Vis pada
produk enrofloksasin pada tahun 2012 (Anonim,

268

- -- -- - - -
 -- --- ----

Ambarwati et at.

panjang gelombang maksimum 271 nm (Anonim, CV Horwitz (%) = t-O.510gC

2009).
Kadar yang didapat dari sampel dihitung dan
CV hitung (%) < ; xCV Horwitz
C = konsentasi analit saat diukur
pengujian sampel di atas diulang sebanyak 7 kali,
kemudian dihitung koefisien variasi (CV) (BPOM,
2009; Harmita, 2004). Rumus untuk menghitung UjiAkurasi

persentase kadar enrofloksasin adalah sebagai Penghitungan untuk kerja akurasi

berikut (Rumus 1): digunakan metode analisis dalam menetapkan kadar
analit dalam bahan aktif yang diketahui
Aspl Cs XXd kemumiannya (BPOM, 2009). Sejumlah 10 mg
-x x 100%
Astd Cspl standar enrofloksasin ditimbang dan dilakukan
pengenceran hingga diperoleh konsentrasi akhir 10
Aspl =absorbansi sampel )lg/mL. Absorbansi larutan terse but diukur
Astd = absorbansi standar
Cstd = konsentrasi standar menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada
Cspl = konsentrasi sampel panjang gelombang maksimum 271 nm. Penetapan
kadar seperti di atas diulang sebanyak 7 kali (Hadi,
Nilai CV diperoleh dengan menghitung standar
2007). Nilai perolehan kembali dihitung dengan
deviasi (SD) dan relatif standar deviasi (RSD)
rumus (Rumus 4) (Kantasubrata, 2011):
dengan rumus sebagai berikut (Rumus 2)
(Kantasubrata, 2011): 1 nilai benar - n nilai hitung 1
Akurasi (%)= x 100%
nilai benar

Uji Linearitas
SD =
Sejumlah 10 mg standar enrofIoksasin
ditimbang dan dibuat pengenceran bertingkat pada 5
SD
RSD = konsentrasi (BPOM, 2009) digunakan NaOH 0,1 N
x
sehingga didapatkan konsentrasi 1,25; 2,5; 5,0; 10
CV = RSD x 100 % dan 20 )lg/mL. Absorbansi tiap konsentrasi tersebut
diukur menggunakan spektrofotometer UVNis
pada panjang gelombang 271 nm dan nilai koefisien
n =jumlah pengulangan
x = kadar enrofloksasin pengujian ke-x korelasi (r) dihitung. Nilai r didapat dari analisis
x' = rerata kadar enrofloksasin
regresl linier dengan (Rumus 5) (Kantasubrata,
2011):
Nilai CV hitung ini, kemudian dibandingkan
y = bx + a
dengan CV Horwitz (Rumus 3) (Kantasubrata,
a = intersep
2011): b = slope
x = absprbansi

269
 Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat

HasH dan Pembahasan lebih kecil daripada CV Horwitz. Menurut Harmita

Uji Presisi (2004), suatu rnetode pengujian dikatakan seksarna
Keseksarnaan (presisi) rnerupakan ukuran jika rnetode rnernberikan simpangan baku relatif
yang rnenunjukkan derajat kesesuaian antara hasil (RSD) atau CV 2 % atau kurang. Sedangkan rnenurut
uji individual, diukur rnelalui sebaran hasil Kantasubrata (2011), persyaratan repitabilitas
individual dari reratajika prosedur diterapkan secara adalah baikjika nilai CVhitung lebih kecil atau sarna
berulang-ulang pada sarnpel yang diarnbil dari dengan CV Horwitz, sehingga dapat dikatakan
carnpuran yang hornogen (Harrnita, 2004). bahwa rnetode uji enrofloksasin rnenggunakan
Pengujian presisi dilakukan dengan cara spektrofotornetri ini rnernpunyai presisi yang baik
keterulangan yang dilaksanakan oleh penguji yang (Tabell dan 2).
sarna. Hasil pengujian kadar enrofloksasin
rnenggunakan spektrofotorneter UVNis adalah UjiAkurasi
sebagai berikut: Nilai CV pengujian ini adalah 0,934 Nilai akurasi dihitung rnelalui penetapan

%, sedangkan CV Horwitz yang terhitung adalah kadar standar untuk rnenernukan perolehan kernbali
11,314 %. CV hasil pengujian dengan rnetode ini terhadap nilai kadar standar sebenamya.

Tabel 1. Hasil Uji Kadar Enrofloksasin dengan Spektrofotorneter

Pengulanganke: Kadar Enrofloksasin(%)

1 102,64
2 102,50
3 102,24
4 103,96
5 104,75
6 103,96
7 102,64
Rerata 103,24
SD 0,965
RSD 9,345 x 10-3

Tabel 2. Nilai Perolehan Kembali Standar Enrofloksasin

Pengulanganke: Kadar Enrofloksasin (%)
1 100,77
2 98,69
3 98,99
4 100,68
5 98,099
6 100,08
7 98,79
Rerata 99,44
SD 1,057
CV (%) 1,063

270

- -- - -- - ----- - - - - --
 --------

Ambarwati et al.

Akurasi penghitungan kadar enrofloksasin
atas adalah 0,449 %. Semakin kecil nilai akurasi,
maka semakin mendekati nilai kebenaran suatu zat
(semakin akurat) (Kantasubrata, 2011). Sedangkan,
menurut Harmita (2004), selisih kadar pada berbagai
penentuan harus 5 % atau kurang pada setiap
konsentrasi anal it dengan prosedur yang dilakukan.
Oleh sebab itu, metode ini memiliki akurasi yang
baik.
Uji Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan metode
di untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung
sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu
rentang kerja yang diberikan (Harmita, 2004). HasH
absorbansi pada uji linearitas terdapat dalam Tabel3,
Gambar 2.
Dari data Tabel 3. Nilai r yang didapatkan
adalah 0,9996, sedangkan syarat suatu metode uji
mempunyai linearitas yang baik jika nilai r lebih
besar 0,98 (BPOM, 2009). Hal ini membuktikan
bahwa metode uji enrofloksasin dengan metode
spektrofotometrimempunyai linearitas yang baik.

Tabel 3. HasH Absorbansi untuk Uji Linearitas

Std Enrofloksasin(~g/mL) Absorbansi

0,00 0,000
1,25 0,118
2,50 0,235
5,00 0,491
10,00 0,989
20,00 1,872
Intersep 0,009 86
Slope 0,09408
R 0,9996

2.0
y = O,094lx + 0.0097
.-41' 1.5 RJ = 0.9991
'i
of 1.0 ~kurvastandar enro
5t
it 0.5
-Linear (kurva
0.0 standar enro)
0 10 20 30

kons8ntrasl

Gambar 2. Kurva kalibrasi larutan standar enrofloksasin

271
 Validasi Metode Spektrofotometri
Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Definisi batas deteksi menurut Rarmita (2004)
adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi dan masih memberikan respon
signifikan dibandingkan dengan blanko.
Berdasarkan perhitungan, diperoleh batas deteksi
pada konsentrasi 0,757 flg/mL untuk pengujian
enrofloksasin dengan metode spektrofotometri. Ini
berarti bahwa enrofloksasin pada konsentrasi
tersebut masih dapat terbaca absorbansinya, namun
tidak dapat digunakan dalam perhitungan, karena
dapat membuat bias perhitungan.
Batas kuantitasi merupakan parameter pada
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama. Nilai batas kuantitasi
pada pengujian ini sebesar 2,522 flg/mL.
Konsentrasi tersebut merupakan konsentrasi terkecil
yang tidak menimbulkan bias perhitungan.
Metode uji kadar obat hewan enrofloksasin
menggunakan spektrofotometer telah divalidasi
dengan presisi, akurasi dan linearitas yang baik.
Nilai batas deteksinya yaitu 0,757 flg/mL dan batas
kuantitasinya yaitu 2,522 flg/mL. Berdasarkan hasil
validasi ini, maka metode uji kadar enrofloksasin
bentuk sediaan injeksi dengan spektrofotometri
dapat digunakan sebagai metode uji yang baik,
karena mampu memberikan jaminan mutu hasil uji
yang valid.
Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada
Emi Rusmiati yang telah membantu selama proses
pembuatan tulisan ini.
---
pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat
Daftar Pustaka
Anonim. (2009) Farmakope Obat Rewan Indonesia.
Jilid II. Edisi IV. Direktorat Jenderal Petemakan
dan Kesehatan Rewan. Jakarta.
Anonim. (2012) Indeks Obat Rewan Indonesia.
Edisi VII. Asosiasi Obat Rewan Indonesia.
Jakarta. 56-58, 81-85, 89-90, 132-135.
Aswad, M., Fatmawaty, A., Nursamsiar,
Rahmawanti. (2011) Validasi Metode
Spektrofotometri Sinar Tampak untuk Analisis
Formalin dalam Tahu. Majalah Farmasi dan
Farmakologi. 15:26-29.
BPOM. (2009) Petunjuk Operasional Penerapan
Cara Pembuatan Obat yang Baik. Badan
Pengawas Obat dan Makanan Republik
Indonesia. 583-609.
Dimitrova, D.J., Lashev, L.D., Yaney, St.G.,
Pandova, V.T. (2006) Pharmacokinetics of
Enrofloxacin and Its Metabolite Ciprofloxacin
in Male and Female turkeys following
Intravenous and Oral Administration. V.
Research Com. 30: 415.
Radi, A. (2007) Pemahaman dan Penerapan
ISO/IEC 17025: Persyaratan Umum
Kompetensi Laboratorium Pengujian dan
Laboratorium Kalibrasi. PT. Gramedia Pustaka
Utama.259-274.
Rarmita. (2004) Petunjuk Pelaksanaan Validasi
Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah
IlmuKefarmasian.I: 117-135.
Kantasubrata, J.K. (2011) Pelatihan Validasi dan
Verifikasi Metode Pengujian. Disampaikan
dalam Pelatihan Validasidan Verifikasi.Badan
StandardisasiNasional.
Mitchell, M. A. (2006) Enrofloxacin: Therapeutic
Review..!.Exotic Pet. Med. 15:66-69.
Oktavia, E. (2006) Tehnik Validasi Metode Analisis
Kadar Ketoprofen secara Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi. Buletin Tehnik Pertanian. 11:
23 - 28.
272
Ambarwati et al.

Shelke, S., Dongre, S., Rathi, A., Dhamecha, D.,
Maria, S., Dehghan, M.H.G. (2009) Research
Article: Development and Validation of UV
Spectrophotometric Method of Cefuroxime
Axetil in Bulk and Phrmaceutical Formulation.
AsianJ. Research Chern.2: 222-224.
Zahid, M. dan Isnindar. (2013) Ulasan Ilmiah:
Penggunaan Antibiotik Fluorokuinolon
Sebagai Obat Hewan. Buletin Pengujian Mutu
ObatHewan 12: 13-22.

273