Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.

18

Protokol č. 1: Stanovení osmotického a vodního potenciálu rostlinných pletiv

Teoretický úvod

 Vodní potenciál používáme k popisu transportu vody v rostlinách

 Jeho složkami jsou tlak a osmotický potenciál
 Ke stanovení vodního a osmotického tlaku se ve cvičení používají následující 3 metody:
o 1. metoda hraniční plazmolýzy
 Přímé mikroskopické stanovení procenta plazmolyzovaných buněk po
inkubaci v roztoku se stoupající koncentrací osmotika
 Stanovujeme osmotický potenciál
o 2.Refraktometricky
 Měření změn koncentrace sacharózy jakožto osmotika po inkubaci s
rostlinným pletivem
 Na základě indexu lomu
 Stanovujeme osmotický potenciál
o 3. Tlaková metoda
 Stanovujeme vodní potenciál rostlinných pletiv
 Další metodou je např. kryoskopie…
 K výpočtu osmotického potenciálu se používá van’t Hoffův vzorec π = -R T c i, kde
o R je molární plynová konstanta 8,31447 JK−1 mol−1
o T je teplota v jednotkách K (při t = 25 °C je T = 298,15 K)
o i je koeficient zohledňující disociaci osmotika, pro sacharózu i = 1
o c je koncentrace sacharózy, při níž nastává hraniční plazmolýza
 Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

Praktická část

 Stanovení osmotického potenciálu metodou hraniční plazmolýzy

o Materiál: Allium cepa, Elodea canadensis
o Princip:
 Vytvoříme koncentrační řadu obsahující 20 ml 0–0,8M roztoky sacharózy
odstupňované po 0,1M
 Máme k dispozici 1M roztok, provedeme ředění destilovanou vodou,
promícháme
 Necháme 30 minut inkubovat asi 0,5cm obdélníčky epidermis cibule a celé
lístky vodního moru, mícháme
 Namontujeme jako mikroskopický preparát a se zvětšením 20x10
pozorujeme pod mikroskopem
 Stanovíme podíl buněk plazmolyzovaných vlivem hypertonického prostředí
o Naměřené hodnoty:
 (poznámka: prázdné políčko = hodnota nebyla měřena)

Tabulka č.1: naměřené hodnoty % plazmolyzovaných buněk v závislosti na koncentraci osmotika

vzorek\c (mol l-1) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
% plazmolyzovaných buněk
cibule 1 0 0 0 0 0 60 90 100 100
cibule 2 0 0 0 0 0 50 90 100 100
cibule 3 5 50 90 100 100
cibule 4 41,7 7 90 100 100
cibule 5 28,6 16 70,1 100 100
cibule 6 4,9 65,6 83 100
cibule 7 3,8
mor 1 0 0 19 47 80 100 100 100 100
mor 2 0 0 29 63 85 100 100 100 100
mor 3 0 0 10 65 100 100 100 100
Průměr cibule 0 0 0 0 12 36,6 82,62 97,17 100
Průměr mor 0 0 19,33 58,33 82,5 100 100 100 100
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

Závislost % plazmolyzovaných buněk na koncentraci osmotika -

sacharózy: Allium cepa
120

100
% plazmolyzovaných buněk

80

60

40

20

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

-20
Koncentrace sacharózy (mol l-1)

Závislost % plazmolyzovaných buněk na koncentraci osmotika -

sacharózy (vybrána data kolem 50% hodnoty
plazmolyzovaných buněk): Allium cepa
90
80
y = 353.1x - 132.81
% plazmolyzovaných buněk

70
60
50
40
30
20
10
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Koncentrace sacharózy (mol l-1): vybraná data kolem 50% hodnoty

plazmolyzovaných buněk
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

Závislost % plazmolyzovaných buněk na koncentraci

osmotika - sacharózy: Elodea canadensis
120

100
% plazmolyzovaných buněk

80

60

40

20

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
-20
Koncentrace sacharózy (mol l-1)

Závislost % plazmolyzovaných buněk na koncentraci osmotika -

sacharózy (vybrána data kolem hodnoty 50 %
plazmolyzovaných buněk): Elodea canadensis
90

80
y = 315.85x - 41.368
70
% plazmolyzovaných buněk

60

50

40

30

20

10

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

Koncentrace sacharózy (mol l-1): vybraná data kolem 50% hodnoty

plazmolyzovaných buněk
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

o Vyhodnocení:
 Hodnota koncentrace osmotika v bodě 50 % plazmolyzovaných buněk (podle
vzorce):
 Allium cepa: 0,5177 mol l-1
 Elodea canadensis: 0,2893 mol l-1
 Výpočet osmotického potenciálu
 Použijeme van’t Hoffův vzorec π = -R T c i
o R je molární plynová konstanta 8,31447 JK−1 mol−1
o T je teplota v jednotkách K (při t = 25 °C je T = 298,15 K)
o i je koeficient zohledňující disociaci osmotika, pro sacharózu i
=1
o c je koncentrace sacharózy, při níž nastává hraniční
plazmolýza
 Allium cepa:
o π = -8,31447 x 298,15 x 0,5177 = -1,2834 MPa
o π = -1,2834 MPa
 Elodea canadensis: π = 0,2893 mol l-1
o π = -8,31447 x 298,15 x 0,2893 = -0,7172 MPa
o π = -0,7172 MPa
 Stanovení osmotického potenciálu refraktometricky
o Materiál: Solanum tuberosum – zásobní hlízy
o Princip:
 Do zkumavek připravíme 2 sady inkubačních roztoků jako v předešlé metodě
– opět se vzrůstající koncentrací osmotika od 0 do 0,8 mol l-1
 Z bramborové hlízy vykrojíme korkovrtem vzorky parenchymu, nakrájíme na
menší kousky po 1 cm
 1 sada zkumavek je kalibrační, do druhé sady vložíme vzorek brambory a
uzavřeme zkumavky
 Inkubujeme 30 minut
 Po uplynutí inkubační doby změříme refraktometrem koncentraci sacharózy
v obou sadách zkumavek, vyneseme graficky, hodnotu průniku obou přímek
dosadíme do van’t Hoffovy rovnice
o Naměřené hodnoty:

Tabulka č.2: naměřené hodnoty indexu lomu v závislosti na koncentraci osmotika

koncentrace vzorek vzorek
osmotika kalibrace 1 2 průměr vzorků
0 1,2 1,8 1,8 1,8
0,1 4,8 5,4 5,3 5,35
0,2 7,8 8,2 8,3 8,25
0,3 11,1 11 11 11
0,4 13,8 13 13,5 13,25
0,5 16,8 15,2 15,3 15,25
0,6 18,8 16 15,7 15,85
0,7 22,6 18,2 18,1 18,15
0,8 25,6 20,4 20,3 20,35
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

Závislost indexu lomu na koncentraci osmotika

30

y = 29.783x + 1.6978
25

20
Index lomu

15
y = 22.008x + 3.3356

10

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Koncentrace sacharózy (mol l-1)

Kalibrace Průměr vzorků Linear (Kalibrace) Linear (Průměr vzorků)

o
Výpočet
 29,783x + 1,6978 = 22,008x + 3,3356
 7,775x = 1,6378
 x = 0,2106
 Izotonická koncentrace osmotika je 0,2106 mol l-1
 Použijeme van’t Hoffův vzorec π = -R T c i
 π = -8,31447 x 298,15 x 0,2106 = -0,5221
 π = -0,5221 MPa
 Stanovení vodního potenciálu tlakovou metodou
o Materiál: Pelargonium zonale – list
o Princip:
 List odřízneme pod úhlem 45 stupňů, upevníme do gumové zátky a vsuneme
do tlakové komory
 Na list působíme stlačeným plynem
 Vodní potenciál pletiva je roven záporné hodnotě tlaku, při jehož působení
se začne voda pohybovat z pletiva ven
 Tento tlak zjistíme vytečením xylémové šťávy, objeví se jako kapka na řezné
ploše řapíku (nutno pozorovat lupou)
 V momentě vytečení šťávy odečteme z pozice ukazatele dosažený tlak
v komoře – tato hodnota je číselně rovna vodnímu potenciálu, ten je však
záporný
 Porovnáváme potenciál rostlin plně zalitých oproti rostlinám rostoucím
v suchém substrátu a také listů po určitou dobu odstřižených od rostliny
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

o Naměřené hodnoty:

 Tabulka č.3: vodní potenciál Pelargonium zonale (v MPa)

Čas od 1. měření
……………………………….(min)

0 15 30 průměr průměr
list 1 -0,8 -0,8 -0,8 0,8
suchá rostlina
list 2 -0,8 -0,8 -0,8 0,8 0,8
list 1 -0,5 -0,6 x – poškozený list 0,55
zalitá rostlina
list 2 -0,5 -0,7 -0,9 0,7 0,625

Prezentace a diskuse získaných dat

 Porovnejte získané hodnoty osmotického, popřípadě vodního potenciálu pletiv

jednotlivých rostlinných druhů.
o Allium cepa: π = -1,2834 MPa
o Elodea canadensis: π = -0,7172 MPa
o Solanum tuberosum: π = -0,5221 MPa
o Nejvyšší hodnotu osmotického tlaku má brambor – je tedy schopen vytlačit vodní
sloupec do nejmenší výšky
o Naopak nejvýš by dokázala sloupec vytlačit cibule
o Se zvyšující se koncentrací osmotika se zvyšuje procento plazmolyzovaných buněk
o Nejvyšší hodnotu vodního potenciálu měly čerstvé pravidelně zalévané listy muškátu,
tato hodnota však s časem klesala, až se dostala na nejnižší hodnotu ze všech měření
v tomto úkolu, protože pravidelně zalévaný list ztrácí vodu rychleji, než vysušený list
(tedy i jeho vodní potenciál bude klesat rychleji, než u vysušeného listu)
o Vysušené listy muškátu měly nižší hodnotu vodního potenciálu, aby mohly přijímat
vodu pod vyšším tlakem
 Diskutujte, zda jste metodou hraniční plazmolýzy a metodou refraktometrickou měřili
vodní potenciál rostlinných pletiv, nebo pouze osmotický potenciál - tedy jednu z
komponent vodního potenciálu.
o Metodami refraktometrie i hraniční plazmolýzy dokážeme spočítat π, což je
osmotický potenciál, tedy pouze složka vodního potenciálu
o Vodní potenciál se ve skutečnosti vypočítá odečtením osmotického tlaku od tlaku
hydrostatického, ten však můžeme zanedbat, neboť jeho hodnota je téměř nulová
o Metoda tlaková pak měří přímo vodní potenciál (po převedení z barů na MPa)
Fyziologie rostlin St 14-16 28.2.18

 Do jaké výšky rostliny (pouze hypotetická situace) by samotný vámi zjištěný osmotický
potenciál rostlinných pletiv byl schopen zabezpečit transport vody; jinými slovy, jakou
výšku vodního sloupce by byl schopen vytlačit tlak rovný záporné hodnotě vámi
stanoveného osmotického potenciálu?
o K výpočtu výšky vodního sloupce využijeme vzorec pro výpočet hydrostatického
tlaku: h = p /(ρ.g)
o V ideálních podmínkách pro zjednodušení odpovídá vodní potenciál -0,1 MPa výšce
vodního sloupce 10 m
o Allium cepa:
 π = -1,2834 MPa
 h = 128,34 m
o Elodea canadensis:
 π = -0,7172 MPa
 h = 71,72 m
o Solanum tuberosum:
 π = -0,5221 MPa
 h = 52,21 m