A fehérjeszerkezet-vizsgálat korszerű módszerei

VI. Előadás

Atomi felbontású kísérleti módszerek és technikák I:

Röntgenkrisztallográfia
 A röntgensugárzás felfedezésének hatása a
tudományos életre
NOBEL DÍJ:
1901 Physics - W. C. Röntgen
Discovery of X-rays
1914 Physics - M. Von Laue
Diffraction of X-rays by crystals
1915 Physics - W. H. Bragg and W. L. Bragg
Use of X-rays to determine crystal structure
1917 Physics - C. G. Barkla
Discovery of the characteristic Röntgen radiation of the elements
1929 Physics - L.-V. de Broglie
The wave nature of the electron
1936 Chemistry - P. J. W. Debye
For his contributions to our knowledge of molecular structure through his investigations on
dipole moments and on the diffraction of X-rays and electrons in gases
1937 Physics - C. J. Davisson and G. Thompson
Diffraction of electrons by crystals
1946 Chemistry - J. B. Sumner
For his discovery that enzymes can be crystallised
1954 Chemistry - L. C. Pauling
For his research into the nature of the chemical bond and its application to the elucidation
of the structure of complex substances
1962 Chemistry - J. C. Kendrew and M. Perutz
For their studies of the structures of globular proteins
 A röntgensugárzás felfedezésének hatása a
tudományos életre
1962 Physiology or Medicine - F. Crick, J. Watson and M. Wilkins
The helical structure of DNA
1964 Chemistry - D. Hodgkin
Structure of many biochemical substances including Vitamin B12
1972 Chemistry - C. B. Anfinsen
Folding of protein chains
1976 Chemistry - W. N. Lipscomb
Structure of boranes
1982 Chemistry - A. Klug
Development of crystallographic electron microscopy and discovery of the structure of
biologically important nucleic acid-protein complexes
1985 Chemistry - H. Hauptman and J. Karle
Development of direct methods for the determination of crystal structures
1988 Chemistry - J. Deisenhofer, R. Huber and H. Michel
For the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction
centre
1991 Physics - P.-G. de Gennes
Methods of discovering order in simple systems can be applied to polymers and liquid
crystals
1992 Physics - G. Charpak
Discovery of the multi wire proportional chamber
1994 Physics - C. Shull and N. Brockhouse
Neutron diffraction
 A röntgensugárzás felfedezésének hatása a
tudományos életre
1996 Chemistry - R.Curl, H. Kroto and R. Smalley
Discovery of the fullerene form of carbon
1997 Chemistry - P. D. Boyer, J. E. Walker and J. C. Skou
Elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine
triphosphate (ATP) and discovery of an ion-transporting enzyme
2003 Chemistry - R. MacKinnon
Potassium channels
2006 Chemistry - R. D. Kornberg
Studies of the molecular basis of eukaryotic transcription
2009 Chemistry - V. Ramakrishnan, T. A. Steitz and A. E. Yonath
Studies of the structure and function of the ribosome
2010 Physics - A. Geim and K. Novoselov
For groundbreaking experiments regarding the two-dimensional material graphene
2011 Chemistry - D. Shechtman
For the discovery of quasicrystals
2012 Chemistry - R. J. Lefkowitz and B. K. Kobilka
For studies of G-protein-coupled receptors
2013 Chemistry - M. Karplus, M. Levitt and A. Warshel
For the development of multiscale models for complex chemical systems
RCSB Protein Data Bank
 RCSB Protein Data Bank

● http://www.rcsb.org/pdb
● atomi felbontású fehérjeszerkezetek adatbázisa
● röntgendiffrakció, NMR spektroszkópia, (krio-elektronmikroszkópia)
● 2006 óta nem fogad el elméleti modelleket
 Diffrakció
● A nagy energiájú fotonsugárzás a fehérjekristály rácspontjaiban elhelyezkedő nehéz
atomokon hullámelhajlást (diffrakció) szenved.
● Ha a beeső sugárzás hullámhossza és az útjába eső rés, vagy akadály mérete
összemérhető akkor diffrakció lép fel.
 Diffrakció
● A nagy energiájú fotonsugárzás a fehérjekristály rácspontjaiban elhelyezkedő
atomokon hullámelhajlást szenved.
● Ha a beeső sugárzás hullámhossza és az útjába eső rés, vagy akadály mérete
összemérhető akkor diffrakció lép fel.
 Röntgenkrisztallográfia
● A fehérjekristályon áthaladó és röntgensugárzás által létrehozott két dimenziós
diffrakciós mintázat alapján (az elhajlás szöge és a sugárzás intenzitása)
következtetni lehet a kristály egyes pontjaiban lévő elektronsűrűségre.
● Az elektronsűrűség és a vizsgált anyag kémiai szerkezete ismeretében
meghatározható az egyes atomok, atomcsoportok relatív térbeli pozíciója és ezáltal a
molekula háromdimenziós térbeli szerkezete.
 Mintaelőkészítés

● Alapfeltétel: megfelelő méretű (néhány tized mm mind a 3 dimenzióban) és

rendezettségű, azaz rácshibákat csak elenyésző mértékben tartalmazó kristály.
● A kristályosítást befolyásoló tényezők: ionerősség, pH, hőmérséklet, koncentráció
és anyagi minőség.
● Alapvető követelmények:
- min. 95%-os tisztaságú fehérje
- min. 10 mg/ml koncentráció (fehérjére nézve)
● Kristályosító oldat:
- kicsapószer: a fehérje oldhatóságát csökkentő ionos, vagy poláris anyag (pl.
polietilén-glikolok)
- pH beállító pufferek
- az oldat viszkozitását növelő anyagok (pl. glicerin)
- detergensek
 Mintaelőkészítés
● A legelterjedtebb kristályosítási módszer: függőcsepp-módszer

● Alapja a cseppben és a kristályosító oldatban lévő kicsapószer-koncentráció

gőzdiffúzió útján való kiegyenlítődése.
● Kiinduláskor a cseppben a kicsapószer koncentrációja kisebb, mint a kristályosító
oldatban, igy a cseppből vízgőz távozik és a benne oldott anyagok (fehérje,
kicsapószer) koncentrációja megnő, majd ennek következtében megindul a
kristályképződés.
 Adatgyűjtés

● Elemi cella: a kristály azon legnagyobb szimmetriával rendelkező, de ugyanakkor a

legkisebb paralelepipedon egysége amely élei mentén való transzlációval a kristály
előállítható.
● A kristály minden elemi cellájának ugyanazon pozíciójában elhelyezett pontok
alkotta rácsra fektetett rácssíkok segítségével leírható a röntgen sugarak szóródása,
mint az ezen síkokról való tükröződés.
● Laue index (hkl): Megadja, hogy egy síksereg tagjai egy adott elemi cella éleit hány
egyenlő részre osztják
● A kristályt a szimmetriája által megszabott
szögtartományban forgatjuk és felvesszük az
összes síksereghez tartozó diffrakciós képet.
● Minél nagyobb felbontás és minél rövidebb
mérési idő érdekében célszerű szinkrotron-
sugárzást alkalmazni.
● A kristály roncsolódásának csökkentése
érdekében érdemes azt 100 K körüli
hőmérsékletre hűteni.
● Detektálás: image plate, CCD
 Adatelemzés

● A diffrakciós képből meghatározhatók a reflexiós síkok Laue-indexei, azaz az elemi

cella dimenziói és a labor koordinátarendszerhez viszonyított orientációja.
● A reflexiók intenzitásának meghatározásával és az adatok egyesítésével számíthatók
az egy elemi cella által okozott szórásra jellemző és a cellabeli elektronsűrűségtől
függő ún. szerkezeti tényezők (F(h)).
● A szerkezeti tényezők inverz Fourier-transzformációja útján kapjuk az
elektronsűrűségi térképet.
● Fázisprobléma: szerkezeti tényezők inverz Fourier-transzformációjához ismerni kell
a röntgenhullámok fáziskülönbséggel történő interferenciáját leíró fázisszöget, amely
a diffrakciós mintázatból közvetlenül nem számítható.
● A fázisprobléma megoldási lehetőségei: izomorf helyettesítés, anomális szórás,
molekuláris helyettesítés
● A fehérjék krisztallográfiája esetében a leginkább elterjedt a molekuláris helyettesítés
módszere, mely akkor kivitelezhető, ha rendelkezésre áll egy olyan fehérje
térszerkezete, melynek szekvenciája legalább 25-30 %-ban megegyezik a
meghatározni kívánt molekuláéval.
● Az ismert szerkezetből számolt fázisok = kiindulási fáziskészlet, mely segítségével
az első elektronsűrűségi térkép számolható
 Modellépítés, finomítás

● a nagy elektronsűrűségű régiók kitöltése a

nehézatomok helyzetét jelző pontokkal
● az így létrejövő modellmolekula
hozzáigazítása az elektrontérképhez
● a hozzáigazított modellből új fázisok,
majd azokból új térkép számítása
● modellépítési - finomítási ciklusok
sorozata
● megkötések és kényszerfeltételek
beépítése (kötéshosszak, kötésszögek,
torziós szögek, sztereokémiai korlátok,
stb.)
● számításos kémiai módszerek
alkalmazása
● A modell és a mért adatok közötti eltérés
jellemzése: R-faktor, melynek értéke 25%
alatt kell, hogy legyen
 Az eredmény

● Hőmérsékletfaktor (B-faktor, Debye-Waller faktor): Bi = 8π2Ui2

● Ui = i atom diszpozíciójának középértéke
● Az adott atom adott pontban való elhelyezkedésének valószínűségét, azaz az
adott atom termális mozgását, illetve a felépülő szerkezet rendezettségének
mértékét adja meg.
● Bi ≤ 30 Å2 = rendezett, Bi ≥ 60 Å2 = rendezetlen
 Hátrányok

● Csak olyan fehérjék vizsgálhatók melyek kristályosíthatók

● A hidrogénatomok helyzete nem meghatározható
● Statikus szerkezet, egy db konformációs állapotról ad képet
● A fehérje dinamikai tulajdonságai, domain-mozgásai nem vizsgálhatók
● A kristályrács-erők jelentős mértékben torzíthatják a fehérje szerkezetét azok
oldatbeli natív szerkezetéhez képest