Vežba br.

15 - Hromatografija (GLC) 1

GASNI HROMATOGRAF VARIAN 1400

Uređaj koji opisujemo je proizvod poznate firme VARIAN AEROGRAPH (Kalifornija, SAD)
koja se, između ostalog, bavi proizvodnjom uređaja i instrumenata za naučno-istraživačke, rutinske
laboratorijske i kliničke svrhe.

Sam hromatograf (slika 1) je model 1400, a uz njega idu i generator vodonika (model 9225),
kao i pisač (model A-25). Osnovni model se isporučuje s plameno-jonizacionim detektorom (FID)
unutar koga komponente uvedene iz hromatografske kolone sagorevaju u vodonično-vazdušnom
plamenu (desno gore na prednjoj strani hromatografa) . Zbog toga uređaj sadrži i pomenuti generator
vodonika, kao i čeličnu bocu s vazduhom. Druga čelična boca sadrži noseći gas (u ovom slučaju tzv.
ekstra-čisti azot) koji se uvodi u kolonu kao mobilna faza i u koji se u injektoru (levo gore na prednjoj
strani) ubrizgava rastvor uzorka. Kućište hromatografa na svojoj desnoj stranici (nije vidljiva) sadrži
ventile za podešavanje protoka vodonika, vazduha i nosećeg gasa, kao i jednostavan uređaj za
prethodno merenje njihovih protoka. Postoji i mogućnost deljenja toka efluenta iz kolone, pri čemu
jedan (manji) deo ide u detektor, a drugi (veći) u odgovarajući kolektor frakcija. Čelične boce s
gasovima i generator vodonika su snabdeveni odgovarajućim ventilima pomoću kojih se može
regulisati izlazni pritisak, a gasni tokovi (između boca, generatora vodonika i hromatografa) se vode
bakarnim cevima uskog prečnika (ca. 2 mm). Hromatograf, pisač i generator vodonika su uključeni u
izvor naizmenične struje i propisno uzemljeni. Tokom rada hromatograf povlači iz električne mreže
snagu oko 2 kW, pa o tome treba voditi računa kada se bira prostorija za njegov smeštaj. Ta
prostorija, s obzirom da se radi o mikrokoličinama uzoraka, treba da je bez drugih hemijskih isparenja i
sličnih zagađivača, u njoj ne sme biti otvorenog plamena, niti se u njoj sme pušiti (vodonik!). Za dobar
rad gasnog hromatografa je neobično važno da se hromatograf, pisač i generator vodonika
međusobno električno povežu (zajednička masa) i dobro uzemlje jer je slab električni signal koji dolazi
iz detektora veoma podložan električnim smetnjama što može onemogućiti stabilizovanje igle na
pisaču.

Slika 1. Opšti izgled komponenata gasnog hromatografa Varian 1400

 Vežba br. 15 - Hromatografija (GLC) 2

Slika 2. Gasni hromatograf sa otvorenim poklopcem (levo). Čelična kolona (desno).

Na slici 2 (levo) je prikazano kućište hromatografa sa otvorenim poklopcem peći koja zauzima
najveći njegov deo. To je izolovani vazdušni prostor, koji pri dnu ima horizontalnu mrežicu, ispod koje
se nalaze snažan ventilator i grejna spirala. Iznad mrežice je hromatografska čelična kolona (odvojeno
prikazana na desnoj slici) koja je jednim svojim (ulaznim) krajem uvučena u injektor, a drugim
(izlaznim) u detektor. Kada se zatvori poklopac i peć zagreje, ventilator unutar peći omogućuje da svi
delovi kolone budu termostatirani na istu (zadatu) temperaturu.

Na slici 2 su delimično vidljivi i injektor i detektor. Injektor je čelični cilindar u koji se bočno
(kroz omotač) uvodi noseći gas koji struji ka osnovi cilindra u koju je uvučen ulaz kolone. Suprotna
osnova cilindra je zatvorena čepom od sintetičke gume pričvršćenim pomoću zavrtnja koji ima otvor u
centru (vidi se na slici). Kroz centralni otvor zavrtnja i gumeni čep (septum) se ubada igla šrica i u
injektor ubrizgava rastvor uzorka koji odmah isparava i odlazi u kolonu nošen tokom nosećeg gasa.
Plameno-jonizacioni detektor (slika 2) je takođe vertikalni čelični cilindar u koji se efluent iz kolone
uvodi direktno u vodonično-vazdušni plamen koji gori između dve elektrode pod jednosmernim
naponom od oko 300 V. Kada s tokom nosećeg gasa naiđe i neka komponenta uzorka koja može
sagoreti u višku vazduha, tokom sagorevanja se trenutno stvori velika količina jona i između elektroda
poteče struja koja se dalje pojačava i vodi ka pisaču. Posle prolaska kroz plamen efluent iz kolone se
ispušta u atmosferu. (Na slici je vidljiv gornji deo detektora, "dimnjak", kroz koji gasovi izlaze.)

Injektor i detektor imaju sopstvene "peći", što znači da im se temperatura može podešavati
nezavisno od temperature kolone. Važi iskustveno pravilo da detektor i injektor treba držati pri
0
temperaturama koje su barem 25–50 C više od (najviše) temperature kolone, bez obzira na to da li se
radi pri konstantnoj ili programirano rastućoj temperaturi kolone. Visoka temperatura injektora je
neophodna za brzo isparavanje uzorka kako bi njegov koncentracioni profil na ulazu u kolonu bio što
uži, jer se on tokom prolaska kroz kolonu zbog podužne difuzije ionako širi. Visoka temperatura
detektora smanjuje mogućnost zadržavanja i taloženja u njemu teških komponenata (onečišćenja)
koja bi kasnije lagano dogorevala i deformisala signale narednih komponenata. Za dobijanje dobrih
rezultata uvek treba poći od čiste kolone, čistog injektora i čistog detektora

Na slici 2 (desno) je prikazana i kolona od nerđajućeg čelika, dužine 3 m i unutarnjeg prečnika

2 mm. Kada se puni ručno stacionarnom fazom, ona se najpre razmota i ispravi, i u jedan njen kraj se
tesno uvuče čep od staklene vune. Kolona se uspravi i kroz drugi (gornji) kraj se lagano usipa
praškasta stacionarna faza uz stalno protresanje, kako bi se dovoljno sabila. Zatim se i drugi kraj
zatvori čepom od staklene vune, kolona opet savije u spiralu i unese u hromatograf. Najpre se spoji
samo sa injektorom i stabilizuje pri radnoj temperaturi 24 sata uz smanjen tok nosećeg gasa kako bi
se očistila. Potom se njen drugi kraj spoji s detektorom i ona je spremna za rad.
 Vežba br. 15 - Hromatografija (GLC) 3

Slika 3. Prednja strana gasnog hromatografa predstavlja kontrolnu tablu uređaja s glavnim delovima
za kontrolu temperature (gore), za programiranje temperature (dole levo) i za kontrolu pojačanja
signala iz detektora (dole desno).

Na slici 3 je prikazana prednja strana gasnog hromatografa na kojoj su smeštene sve glavne
kontrole za njegov rad.

Na gornjem delu sleva u desno su: glavni prekidač za uključivanje uređaja, dugme za
podešavanje temperature injektora, dugme za podešavanje temperature detektora, prekidač za
uključivanje samo ventilatora (za hlađenje peći) ili ventilatora i grejanja peći, i preklopnik čijim
pomeranjem se na instrumentu iznad njega mogu očitati temperature injektora, detektora i kolone.

Programator (dole levo) sadrži najpre u gornjem levom uglu preklopnik za biranje radnog
režima (mode): on omogućava isključivanje programiranja (off), rad pri konstantnoj temperaturi kolone
(iso), održavanje najviše temperature koju je kolona programirano dostigla (hold) i programirano
hlađenje (cool). Dugmetom u gornjem desnom uglu se može izabrati brzina zagrevanja/hlađenja
0
kolone (rate) u C/min. U donjem delu su dva veća dugmeta za biranje početne i krajnje temperature
kolone pri njenom programiranom zagrevanju/hlađenju, a u sredini je dugme za pokretanje programa.

U donjem desnom uglu prednje strane hromatografa je smešten elektrometar s kontrolama za

biranje pojačanja električnog signala. Levim preklopnikom u gornjem redu se bira opseg pojačanja
(range, amps/mV) za odgovarajući detektor (FID ili EC), a desnim (attenuator) se stepenasto može
slabiti signal unutar izabranog opsega. U sredini između njih je dugme (ignition) čijim se pritiskanjem
izaziva usijanje pomoćne grejne spirale u detektoru koja pali vodonično-vazdušni plamen.

Srednjim preklopnikom u donjem redu elektrometra (cell voltage) se napon između elektroda
detektora isključuje ili bira za odgovarajući detektor (FID ili EC). Levo i desno od njega su dva
dugmeta (balance i bucking) pomoću kojih se izlazni električni signal iz detektora uravnotežuje sa
električnim ulazom pisača: kada je kolona termostatirana i kroz detektor prolazi čist noseći gas (bez
uzorka), upali se plamen u detektoru i pomoću ova dva dugmeta podesi da pero iscrtava ravnu
osnovnu liniju na hromatogramu.

Pisač (slika 1) sadrži kontinualnu rolnu papira širine oko 25 cm, s podeocima. Rolna se
odmotava kontrolisanom brzinom (vremenska osa), dok se pero pod dejstvom električnog signala
kreće po njegovoj poprečnoj dimenziji. Otklon pera je proporcionalan masi komponente koja prolazi
kroz detektor i pojačanju signala, pa pisač zato treba u električnom smislu uravnotežiti s
hromatografom. Brzina papira se može podešavati u opsegu od 2 cm/h do 20 cm/min, a otklon pera
pisača u opsegu od 1 mV do 1 V (za punu širinu papira).
 Vežba br. 15 - Hromatografija (GLC) 4

Slika 4. Prednja strana – kontrolna tabla generatora vodonika.

Na slici 4 je prikazana prednja strana generatora vodonika – uređaja koji snabdeva plameno-
jonizacioni detektor vodonikom. To je u stvari elektrolitička ćelija sa čvrstim poroznim elektrolitom –
jonoizmenjivačkom smolom koja se za rad puni demineralizovanom vodom. Elektrolizom dobijeni
kiseonik odlazi slobodno u atmosferu, dok se vodonik skuplja u posebnom rezervoaru, suši
silikagelom i šalje ka detektoru. Na levoj gornjoj strani prednje ploče generatora se iza providnog
poklopca na zavrtanj vidi dno cilindrične patrone sa silikagelom koji sadrži indikator (kada silikagel
promeni boju iz plave u ružičastu, kao na slici, treba ga zameniti suvim). Ispod njega su manometar i
ventil pomoću kojih se prati, odnosno reguliše izlazni pritisak vodonika u opsegu 0–100 psi (0–6 bara).
U sredini su prekidač za uključivanje generatora i signalne lampice (generiše/ne generiše, i
preopterećenje), a desno je vodokazna cev na kojoj se prati nivo vode u ćeliji. U uređaju uvek mora
biti vode – ako se elektrolit u ćeliji osuši, nepovratno se oštećuje.

Slika 5. Špric za ubrizgavanje rastvora uzorka u kolonu, zapremine 5 mikrolitara.

Za ubrizgavanje rastvora uzorka kroz septum injektora se koriste specijalni špricevi

kalibrisane, veoma male zapremine – 1 do 10 mikrolitara, čiji klip zapravo predstavlja savitljivu žicu.
Pošto iglom treba probiti gumeni čep septuma i kontrolisano, ali odlučno ubrizgati uzorak, za rad sa
špricem je potrebno određeno iskustvo. Početnik često nehotice savije iglu tako da se špric više ne
može koristiti ili mu pritisak iz injektora izbaci klip. Na slici 5 je prikazan špric zapremine 5 mikrolitara.
Rastvor uzorka treba praviti u što isparljivijem rastvaraču kako bi se komponente uzorka istovremeno i
u što kraćem roku nanele na stacionarnu fazu kolone.

Na slici 6 je prikazan primer hromatograma smeše masnih kiselina. Pošto su masne kiseline
veoma polarna jedinjenja, srazmerno neisparljive i nestabilne pri višim temperaturama, prethodno su
prevedene u svoje estre s metilalkoholom. Metilestri su daleko isparljiviji i termostabilniji od
 Vežba br. 15 - Hromatografija (GLC) 5

odgovarajućih masnih kiselina, ali je za njihovo razdvajanje, s obzirom da se pojavljuju u velikom

rasponu molekulskih masa, potrebno primeniti linearno rastuću temperaturu eluiranja. Na taj način se
hromatogram ne "razvlači", a svi pikovi imaju jednolik oblik.

Slika 6. Hromatogram metilestara masnih kiselina. Vremenska osa je usmerena sleva u desno. Na
samom početku (levo) se vidi pik rastvarača. Maksimumi na hromatogramu (pikovi) odgovaraju (sleva
u desno) masnim kiselinama sa 8, 10, 12, 14, 16 i 18 C-atoma, pri čemu, s obzirom da je razdvajanje
vršeno na polarnoj koloni, iza svakog glavnog pika (zasićena kiselina) sledi više (uglavnom manjih)
pikova koji redom predstavljaju mono-nezasićenu, bi-nezasićenu itd. masnu kiselinu sa istim brojem
C-atoma. Izuzetak se primećuje kod kiselina sa 18 C-atoma, gde je prvi pik (zasićena – stearinska
kiselina) manji od sledećeg (mono-nezasićena – oleinska kiselina). Površina ispod pika (do bazne
linije) odgovara masenom učešću odgovarajuće masne kiseline u smeši, tako da se deljenjem
površine ispod nekog pika sa ukupnom površinom ispod svih pikova može dobiti maseni udeo
odgovarajuće komponente u smeši.