VENTAJAS

ADVANTAGE
Fluorescence spectroscopy is a method widely used in analytical
measurements and in scientific research, especially in biochemistry and
biomedicine. The two main reasons why the use of this spectroscopic
technique became widespread are: 1) its great
sensitivity and 2) the high level of evolution achieved by both the
required instruments and the fluorophores designed for specific
applications. Although one of the most widely used applications of
fluorescence is the labeling of macromolecules (as an alternative to
radioactive isotope labeling), it can be used, for example, to perform
studies of molecular dynamics, structural analysis of proteins,
quantification of ions in cellular compartments , microscopy, membrane
potential analysis, interactions between macromolecules, etc.
Compared with absorption methods, the sensitivity of the methods
based on
Fluorescence is 10 to 10,000 times higher, this means that nanograms
can be analyzed to picograms of various analytes with very good results.
Another advantage of fluorescence is its specificity, which allows the
identification of specific molecules in complex matrices. As a
disadvantage, it can be distinguished that it has fewer applications than
absorption spectroscopy, since the amount of chemical systems that
fluoresce is relatively limited. However, even when the analyte does not
exhibit natural fluorescence, fluorescent probes that bind to specific
functional groups can be used in the molecule under study.
METODO
Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La
espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y
electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado
electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico
excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay
diferentes estados vibracionales.

En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la

absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los
distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con
otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta
que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado.

La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los
fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues,
mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría
de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la
estructura de los diferentes niveles de vibración.

En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente

emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda
constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se
mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de
diferentes longitudes de onda.
METHOD
Molecules have different states called energy levels. Fluorescence
spectrometry refers mainly to vibrational and electronic states. In
general, the species under examination will have a basal electronic state
(a low energy state) of interest, and an excited electronic state of higher
energy. Within each of these electronic states there are different
vibrational states.

In fluorescence spectroscopy, the sample is first excited by the

absorption of a photon of light, from its basal electronic state to one of
the different vibrational states of the excited electronic state. Collisions
with other molecules cause the excited molecule to lose vibrational
energy until it reaches the lowest vibrational state of the excited
electronic state.

The molecule then descends to one of the different vibration levels of

the basal electronic state, emitting a photon in the process. Since
molecules can fall at any of the different levels of vibration in the basal
state, the emitted photons will have different energies and, therefore,
frequencies. Thus, by analyzing the different frequencies of light emitted
by fluorescence spectrometry, together with their relative intensities, the
structure of the different levels of vibration can be determined.

In a typical experiment, the different frequencies of fluorescent light

emitted by a sample are measured, keeping the excitation light at a
constant wavelength. This is called the emission spectrum. An excitation
spectrum is measured by recording a series of emission spectra using
light of different wavelengths

.
FUNDAMENTO DE LOS FLUOROFOROS
Cuando el fluoróforo absorbe la luz, uno de sus electrones pasa a un estado
excitado (mayor energía) que es inestable y cuando vuelve a su estado basal, el
exceso de energía se libera en forma de luz pero de una longitud de onda más larga
(menor energía) que la de excitación. Este proceso está representado por el
diagrama Perrin-Jablonski.

En fluorescencia el estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-

9 a 10-8 segundos. En este tiempo el fluoroforo sufre cambios conformacionales
y esta sujeto a multiples interacciones con el medio
ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes
(Figura 1): 1) debido a la energia que se disipa durante el tiempo de vida del
estado excitado, el foton de energia emitido hem, es de menor energia que el
foton que el fluoroforo absorbio previamente, por lo tanto la
longitud de onda de emision es mayor que la de excitacion; 2) no todas las
moleculas que se
excitaron inicialmente por absorcion retornan al estado basal de energia por
emision de fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: “quenching”
colisional, transferencia de energia de fluorescencia por resonancia (RET),
conversion interna o desactivacion no radiativa y formacion de un fotoproducto
pueden disminuir la cantidad de moleculas en el estado excitado y por lo tanto
disminuyen el rendimiento cuantico de fluorescencia (Figura 2).
FUNDAMENTALS OF FLUOROPHORES
When the fluorophore absorbs light, one of its electrons goes
into an excited state (higher energy) that is unstable and when
it returns to its basal state, the excess energy is released in the
form of light but of a longer wavelength ( lower energy) than
excitation. This process is represented by the Perrin-Jablonski
diagram.
A fluorophore absorbs electromagnetic energy from a "basal"
electronic state (S0) to an "excited" electronic state (S1) after
absorbing a photon (ie light) of energy:
where E is the energy, h is the Planck constant and νex is the
excitation frequency. This energy is supplied by an external
light source. The absorption of light produces a transition
electron in the fluorophore: an electron is promoted from the
occupied molecular orbital most external to the unoccupied
molecular orbital closest to it (Figure 1). This process is
governed by different selection rules and the probability that the
transition occurs is reflected by the molar absorptivity
coefficient, ε (M-1, cm-1) which is determined by the law of
Lambert and Beer for each length cool:
where A is the absorbance, l is the optical path and c the
concentration of the fluorophore.

n fluorescence the excited state lasts a finite time, usually

between 10-9 to 10-8 seconds. At this time the fluorophore
undergoes conformational changes and is subject to multiple
interactions with the environment
molecular environment. These processes have two important
consequences (Figure 1): 1) due to the energy that dissipates
during the lifetime of the excited state, the photon of emitted
energy h em, is of lower energy than the photon that the
fluorophore previously absorbs , Therefore, the
emission wavelength is greater than the excitation wavelength;
2) Not all the molecules that are
initially excited by absorption return to the basal state of energy
by fluorescence emission. Other processes such as: collisional
"quenching", resonance fluorescence energy transfer (RET),
internal conversion or non-radiative deactivation and
photoproduct formation can decrease the number of molecules
in the excited state and therefore decrease the yield
fluorescence quantum (Figure 2).
En espectroscopia de fluorescencia se registran espectros de excitacion y de
emision. El espectro de excitacion se corresponde con el espectro de
absorbancia. Ambos espectros son una representacion de la intensidad de
fluorescencia en unidades arbitrarias en funcion de la longitud de onda en nm.
Para registrar el espectro de emision se fija una longitud de onda de excitacion
y para el de excitacion se fija una longitud de onda de emision. Una caracteristica
llamativa de los espectros de excitacion y emision de fluorescencia es que para
algunas moleculas estos son imagenes especulares uno del otro, a esto se llama
“regla del espejo”
FLUORESCENCIA DE PROTEÍNAS
Existen tres aminoácidos aromáticos que absorben luz en el rango de espectro UV,
fenilalanina, tirosina y triptófano. Debido a su absortividad molar la tirosina
(ε276=1405 M-1 cm-1) y triptófano ((ε280=5579 M-1 cm-1) han sido muy usados
para el estudio de proteínas.
La espectrofluorimetría es una herramienta importante en estudios de plegamiento
de proteína. Jones et al. demostraron que durante el replegamiento de la hidrofolato
48 reductasa de E. coli, la fluorescencia decaía. La medición del tiempo de
decaimiento de la anistropía así como los tiempos de vida de la emisión,
proporcionaron más información sobre los intermediarios en el plegamiento, de la
que se había obtenido. De manera similar al uso de análogos de triptófano también
se puede usar para obtener información sobre la dinámica de proteínas.
En la figura 27 se esquematiza una proteína que tiene unida una molécula
fluorescente en el residuo de ácido glutámico y en el de lisina un apagador, que
debido a la corta distancia entre ambos absorbe la energía del fluoróforo. Cuando
la enzima en cuestión corta entre ambos residuos, la distancia entre el fluoróforo y
el apagador aumenta, permitiendo la fluorescencia.

PROTEIN FLUORESCENCE
There are three aromatic amino acids that absorb light in the range of UV
spectrum, phenylalanine, tyrosine and tryptophan. Due to its molar
absorptivity, tyrosine (ε276 = 1405 M-1 cm-1) and tryptophan ((ε280 = 5579 M-
1 cm-1) have been widely used for the study of proteins.
Spectrofluorimetry is an important tool in protein folding studies. Jones et al.
showed that during the refolding of the E. coli hydrofolate 48 reductase, the
fluorescence decayed. The measurement of the decay time of the anistropía
as well as the life times of the emission, provided more information about the
intermediaries in the folding, from which it had been obtained. Similarly, the
use of tryptophan analogues can also be used to obtain information on protein
dynamics.
Figure 27 schematically shows a protein that has a fluorescent molecule
attached to the glutamic acid residue and a lysine residue, which due to the
short distance between them absorbs the energy of the fluorophore. When the
enzyme in question cuts between both residues, the distance between the
fluorophore and the quencher increases, allowing fluorescence.
SECUENCIACIÓN DE DNA
Durante mucho tiempo la secuenciación de AND estuvo asociada a nucleótidos marcados
radioactivamente. Se utilizaban isótopos como fósforo-32, fósforo-33 o azufre-35
incorporados a nucleótidos específicos. Actualmente se utilizan nucleótidos marcados
fluorescentemente. El procedimiento se basa en copiar la cadena templado introduciendo
en el medio nucleótidos marcados fluorescentemente y que además estén modificados
(2´,3´-dideoxinucleótidos) de tal manera que bloqueen la extensión de la cadena
De esta manera la polimerasa tomará aleatoriamente un nucleótido marcado que
incorporará a la cadena creciente terminando su elongación, así se obtendrán productos de
diferentes tamaños con un nucleótido fluorescente en el extremo 3´. Cada base se marca
con un fuoróforo diferente (Figura 30).
Los secuenciadores, detectan la fluorescencia de los cuatro marcadores distintos que
identifica a cada base. Cada fluoróforo emite a diferente longitud de onda cuando es
excitado con un LASER.

DNA SEQUENCING
For a long time, DNA sequencing was associated with radioactively labeled nucleotides.
Isotopes were used such as phosphorus-32, phosphorus-33 or sulfur-35 incorporated into
specific nucleotides. Currently, fluorescently labeled nucleotides are used. The procedure is
based on copying the tempered chain introducing in the middle fluorescently labeled
nucleotides and which are also modified (2', 3'-dideoxynucleotides) in such a way as to block
the extension of the chain
In this way the polymerase will randomly take a labeled nucleotide that will incorporate the
growing chain ending its elongation, thus obtaining products of different sizes with a
fluorescent nucleotide at the 3'-end. Each base is marked with a different fuorophore (Figure
30).
The sequencers detect the fluorescence of the four different markers that identify each base.
Each fluorophore emits at a different wavelength when excited by a LASER.