Izolacija, nabrajanje, identifikacija

Izolacija, nabrajanje i identifikacija kvasaca Saccharomyces iz hrane i pića slijede ista načela i
strategije za kvascima, generalno. To uključuje uzastopne operacije: ispiranje ili maceracija uzorka;
razrjeđenje suspenzije; Nabrajanje stanica kvasca u suspenzija od agar pozlaćivanje, najvjerojatniji
broj, membranske filtracije ili mikroskopske metode(nabrajanje celija kvasaca na agrnim podlogama,
najvjerovatniji broj, membranska filtracija ili mikroskopske metode; preciscavanje izoliranih stanica, i
identifikacija roda, vrste ili soja. Pojedinosti tih postupaka bili pregledali su: Fleet (1992), Beuchat
(1993), Deák i Beuchat (1996), Kurtzman i drugi (2003) i Deák (2003).

Opći mediji za njihovu izolaciju i uzgoj su agar sladnog ekstrakta, glukoza-ekstrakt kvasca-pepton
agar, tripton-glukoza-ekstrakt kvasca agar, WL-hranjiva agar i dichloran-ruža Bengal-kloramfenikol
agar (Beuchat,1993; Kurtzman i drugi, 2003). Različiti antibiotici (npr oksitetraciklin, gentamicin,
kloramfenikol, penicilin) mogu se dodati za suzbijanje rasta bakterija, i suplmentacija sa
propionskom kiselinom, bifenilom ili dichloranom su se koristili za ograničavanje rasta gljivica
(Beuchat, 1993;Deák i Beuchat, 1996). Etanol-sulfit-ekstrakt kvasca agar je korištena kao medij za
selektivnu kulturu i izolaciju Saccharomyces kvasaca, i oni eksploatiraju njihovu toleranciju prema
etanolu i sumpornom dioksidu (Kish i ostali,1983), ali nije pogodan medij za pripremu, i kvasci koji
su tolerantni prema etanolu mogu rasti na ovoj podlozi (Heard i Fleet, 1986). Lizin agar je vrlo
koristan medij za nabrajanje ne-Saccharomyces kvasaca kada su oni prisutni u hrani ili pićima,
zajedno sa Saccharomyces vrstama. To ekspolatira činjenicu da većina Saccharomyces vrsta ne može
koristiti lizin kao izvor dušika i neće formirati kolonije na tom mediju. Međutim, neki
Saccharomyces (npr S. unisporus, S. kluyveri Tablica 11.1), povremeno pronađeni u hrani ekosistema,
mogu koristiti lizin i rasti na ovoj podlozi (Heart i Flote, 1986). Općenito, podloge agar medija se
inkubiraju na 25-30°C za 2-7 dana, nakon čega se kolonije ispituju.

Izbor bilo kojeg medija i uzgojnih uvjeta za izolacijom i nabrajanjem Saccharomyces vrste odbacuje
činjenicu da je većina hrane i pića obrađeno u različitoj mjeri i obicno se gaje proporcionalno na
subletalnim ostecenim celijamakoje mogu zahtjevati ozivljavanje prethodnih analiza. Ozlijeđeni
stanice ne mogu formirati kolonije na zakiseljenim medija ili mediju koji sadrži povećane
koncentracije soli (NaCl) ili šećera, na taj nacin pokazujuci manje vrijednosti vidljivih populacija
(Beuchat, 1984;Deák i Beuchat, 1996; Flota i Mian, 1998).

Fleet i Mian (1998) ispituju indukciju subletalnih ozljeda u stanicama S. cerevisiae nakon zagrijavanja
na 50°C za 5-15 minuta, ili zamrzavanja na -196° C, 60 minuta.

Oko 20-25% stanica je ozlijeđeno prilikom toplinske obrade, što pokazuje njihovu nesposobnost da
rastu na zakiseljeno sladnog ekstrakta agaru. (acidified malt extract agar) (pH 3.5) ili sladnog
ekstrakta agar s 5% NaCl(or malt extract agar with 5% NaCl).. Zamrzavanje stanica izaziva 55-65%
ozljeda kao što je određeno kulturom na ova dva medija (as determined by culture on these two
media).. Ozlijeđeni stanice mogu biti oživljene inkubacijom u tecnoj hranjivoj podlozi sladnog
ekstrakta (2%) na 25 ° C tijekom 3 sata. (The injured cells couldbe resuscitated by incubation in malt
extract broth (2%) at 25 °C for 3 hours)

Koristan popis medija za uzgoj kvasaca dan je u Kurtzman i drugi,(2003).

PCR-razgradjujuci gradient gel electrophoresis (DGGE) sada se primjenjuje kao molekularni pristup
kulture neovisan za detekciju vrste kvasca u hrani i pića (Giraffa, 2004; Prakitchaiwattanai drugi,
2004), i nekoliko je istraživanja ukazalo detekciju S. cerevisiae ovom metodom u fermentiranim
napicima od vina (Millsi drugi, 2002), fermantacija kiselog tijesta (sourdough fermentation), te u
procesu obrade zrna kahve (coffe bean processing).

Ovaj pristup trebao bi otkriti ozlijeđene ili ne-kulturabilne stanice, pošto to ovisi o analizi od
ekstrahovane DNA, ali brojne operacije su uključene i njihovi uvjeti moraju biti pravilno optimizirani

Standardni, uobičajeni postupak za identificiranje Saccharomyces vrsta temelji se na određivanju

ogromnog niza fenotipskih testova: morfologiji ćelija i spora, fermentaciji šećera, asimilaciji različitih
supstrata ugljika i azota, rasta na različitim temperaturama i rasta u prisutnosti različitih
koncentracija glukoze i soli (NaCl).

Za smanjenje obima posla, vremena i dosade ovih testova, razvijeni su razni dijagnostički kompleti za
identifikaciju kvasacasu. Generalno, ovi kompleti ispituju odgovor rasta kvasaca na nekoliko, pažljivo
odabranih podloga i imaju kompjuterizovane sistema za obradu i poređenje podataka s referentnim
bazama podataka. Takvi paketi uključuju API 20C, 32C ID, SIM, Rapid yeasts Plus i yeast ident food
system i ocijenjeni su od strane raznih istraživača tokom godina (Rohmet al., 1990;Torok i King,
1991a; Deák i Beuchat, 1993b, 1996; Velázquezet al.,2001. godine; Ariaset al., 2002. godine; Robert,
2003). U BIOLOG sistem obuhvata slične principie, ali koristi veću raznolikost i broj supstrata, i ima
veću bazu podataka (Praphailong et al., 1997). Razne Saccharomyces vrste (ali ne sve) su uključene u
bazu podataka od ovih sistema koji uglavnom daju dobre, ali ne i nedvosmislene podatke. Ovi
kompleti obezbjeđuju 'prvu fazu', brzu dijagnostiku, da treba pratiti s više fenotipskih ili molekularnih
testova.

Profiliranje masnih kiselina se koristi kao brza metoda za identifikaciju i diferencijaciju Saccharomyces
vrsta iz drugih kvasaca (Malfeito-Ferreira et al. 1997; Loureiro, 2000) i da se diferenciraju
Saccharomyces vrste unutar Senso stricto i u senso lato grupe (Botha i Kock, 1993).

Elektroforetski izoenzima profile na osnovu esteraze, kisela fosfataza i glukoza-6-fosfat

dehidrogenaze kombinacije enzima, mogu diferencirati S. cerevisiae,S. bayanus,S. pastorianus i S.
paradoxus (Duarte et al., 1999). Molekularne metode su sada razvili do te mjere da oni mogu biti
rutinski primjenjuje na identifikaciju kvasac. Oni su brži i više zgodan od kulturnih metode, i smatra se
da daju konačan, više pouzdan podaci. Osim roda i vrste identifikacija, oni također dozvoljavaju
naprezanje kucanje i diferencijacija. Primjena ovih metoda na hranu i piće kvasaca je pregledan od
strane Loureiro i Querol (1999), Kurtzman et al.