KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH MÔI TRƯỜNG GIỐNG LÊN

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN

TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ

N.H. Minh, Đ.D. Tùng, N.N.M. Giao, N.V.T. Nguyên, N.T.T. Ngọc

Khoa Công nghệ Hóa Học và Thực Phẩm

Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh

Số 1, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

TÓM TẮT

Mu ̣c đích của cuô ̣c thí nghiê ̣m này là nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH nhân giố ng
đế n sự sinh trưởng và phát triể n của nấ m men Saccharomyces cerevisiae. Tiế n hành khảo
sát ảnh hưởng của pH nhân giố ng lên đô ̣ng ho ̣c sinh trưởng của nấ m men bằ ng phương
pháp nuôi cấ y mẻ trong thời gian 12 tiế ng với viê ̣c thay đổ i pH của môi trường nhân giố ng
lầ n lươ ̣t là 5.0, 6.0, 7.0, 8.0. Dựa trên các thông số đô ̣ng ho ̣c thu đươ ̣c ta thấ y số lươ ̣ng và
chấ t lươ ̣ng của nấ m men giố ng quyế t đinh
̣ đế n mâ ̣t đô ̣ sinh trưởng của nấ m men, khi số
lươ ̣ng nấ m men giố ng áp đảo thì tố c đô ̣ lên men sẽ nhanh hơn, đây là yế u tố quan tro ̣ng
trong việc chố ng nhiễm đố i với các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i trong quá trin
̀ h lên men.

GIỚI THIỆU

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong
bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces
lớp Ascomycetes ngành nấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời
sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình
lên men làm bánh mì, rượu, và bia (Feldmann, 2011). Saccharomyces cerevisiae là vi sinh
vâ ̣t chủ yế u đươ ̣c dùng trong quá triǹ h lên men. Hầ u hế t các loa ̣i chủng Saccharomyces
cerevisiae phát triể n ở pH từ 2.5 đế n 8.5 nhưng những loa ̣i ưa acid phát triể n tố t ở điề u
kiê ̣n pH thấ p (Carmelo, 1996). Khoảng pH tố i thić h để nấ m men phát triể n là từ 4.0 đế n
6.0 phu ̣ thuô ̣c vào nhiê ̣t đô ̣ sự hiê ̣n diê ̣n của oxy trong môi trường và loa ̣i nấ m men
(Narendranath, 2005). Viê ̣c nghiên cứu các yế u tố ảnh hưởng đế n quá trin
̀ h sinh trưởng của
nấ m men là cầ n thiế t để đảm bảo mu ̣c đić h chính của quá trình nhân giố ng nhằ m ta ̣o ra
quầ n thể nấ m men có chấ t lươ ̣ng tố t, số lươ ̣ng lớn, thời gian nhân giố ng nhanh.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi sinh vật

S. cerevisiae (nấm men bánh mì, MauriPan), được sử dụng trong suốt quá trình nghiên
cứu này, dạng instant dry yeast, men khô bảo quản ở nhiệt độ thường. Quá trình nhân giống
ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Chuẩn bị môi trường nhân giống

Chuẩn bị 1 lit môi trường M1d chứa dịch chiết cà chua từ 100g cà chua, 200g
saccharose, 1g peptone. Môi trường được điều chỉnh giá trị pH lần lượt là 5.0, 6.0, 7.0, 8.0
bằng dung dịch NaOH 0.1 N, được phân phối vào bình nhân giống và được tiệt trùng ở
121oC trong 15 phút. Vi sinh vật được nhân giống trong bình tam giác 250 mL, chứa 100
mL môi trường nhân giống trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng trên thiết bị có khuấy từ với tốc
độ 120 rmp.

Chuẩn bị môi trường lên men

Môi trường lên men là môi trường được chuẩn bị như môi trường nhân giống và được
điều chỉnh đến giá trị pH = 5.0. Sau đó, rót 190 ml môi trường lên men đã chuẩn bị vào
bình tam giác 250 mL và đem đi tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.

Điều kiện lên men

Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành trong bình tam giác 250ml. Sau quá trình nhân
giống, dịch nấm men (10ml) được bổ sung vào 190 ml môi trường lên men đã được chuẩn
bị. Tiến hành lên men trong điều kiện nhiệt độ phòng trên thiết bị có khuấy từ với tốc độ
120 rmp. Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ giờ thứ 0, cứ mỗi một giờ thì lấy mẫu
và đo các chỉ tiêu: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỷ lệ tế bào sống, (c) tỷ lệ tế bào nảy chồi, (d)
hàm lượng đường tổng sẽ được kiểm tra, ghi nhận và biểu diễn thành bảng và đồ thị. Các
thông số động học sinh trưởng của nấm men sẽ được tính toán để rút ra kết luận.

Kỹ thuật phân tích

Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật, tỷ lệ tế bào sống, tỷ lệ tê bào nảy
chồi bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả đếm được là tổng
số tế bào có trong mẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay đã chết (chỉ phân biệt tế
bào nấm nem sống/chết khi tiến hành nhuộm xanh bởi methylene blue).

Tiến hành pha loãng huyền phù nấm men theo tỷ lệ đã chọn với nước cất cùng với
50µl methylene blue 30% rồi để trên máy lắc đều trong 30 giây. Hút huyền phù sau khi lắc
để đưa vào buồng đếm. Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt một giọt huyền phù nấm men vào
cạnh buồng đếm tiếp giáp với hamelle. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế
mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa buồng đếm
và hamelle được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còn các rãnh xung quanh thì không bị
dính ướt. Dùng vật kính ×40 để quan sát, điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa trập để
có thể quan sát rõ tế bào và các đường kẻ.

Đặt buồng kính lên kính hiển vi, điều chỉnh cường độ sáng bằng cửa trập và sử dụng
vật kính ×40 để quan sát cả tế bào lẫn đường kẻ. Tiến hành đếm ô chứa nấm mem theo hai
đường chéo. Bắt đầu đếm tế bào và kết quả đếm mật độ tế bào chỉ có giá trị trong vòng 3
– 5 phút sau khi nhỏ giọt dịch vào buồng đếm, phải đếm các tế bào nằm trên 2 đường kẻ
kề nhau được chọn của từng ô.

Ở mỗi độ pha loãng, sau khi đếm ta được số tế bào trên 5 ô lớn là a, số tế bào nấm
men b (N) trên 1,0 ml mẫu:
 Trong đó:

N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm

a: số tế bào trên 5 ô vuông lớn

b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16×5=80)

400: tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn

0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm

103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1 ml)

10n: độ pha loãng mẫu (lưu ý khi tính độ pha loãng phải bao gồm lượng methylene
blue cho vào mẫu).

Phương trình hồi quy của pha log dựa vào công thức

lnNt = μt + lnNo

(phương trình có dạng: y = ax + b)

Trong đó: Nt: số tế bào ở thời điểm thứ t

No: số tế bào ở thời điểm bắt đầu.

μ: hằng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng.

Các thông số động học

 Tốc độ phân chia tế bào (µ, h-1) đặc trưng thể hiện sự thay đổi của mật độ tế bào trong
một đơn vị thời gian.

Hiệu suất tạo thành tế bào trên một đơn vị cơ chất YN/S (cell. g-1 sucrose)

Tốc độ đặc trưng tạo thành tế bào QN (cell. g-1 sucrose.h-1).

Thời gian thế hệ td (phút)

Trong đó:

No và Nt là số tế bào ở thời điểm bắt đầu và thời điểm thứ t (cell/ml).

So và St là nồng độ cơ chất ở thời điểm bắt đầu và thời điểm thứ t (g/ml).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đường cong sinh trưởng của nấm men

 Hình 1: Đồ thị đường cong sinh trưởng của nấm men

Số lượng tế bào nấm men sau quá trình nhân giống 24h trong bài khảo sát này có
khuynh hướng giảm dần theo thứ tự các mẫu nhân giống ở pH lần lượt là 5.0, 6.0, 7.0, 8.0.
Ta có thể lý giải dựa theo nghiên cứu của (Peña, 2015), trong bài nghiên cứu của mình tác
giả đã đề cập đến việc để tạo ra môi trường có pH từ 6.0 – 9.0 thì phải sử dụng một lượng
NaOH nhất định vào môi trường. Theo đó, kết quả của bài nghiên cứu trên cũng đã chỉ ra
rằng sự sinh trưởng của nấm men bị ức chế không phải do pH cao mà chính là do sự thẩm
thấu của lượng Na+ đáng kể vào tế bào và gây ra những biến đổi sinh lý cho tế bào.

Trong các quy trình lên men công nghiệp thương mại, có một thực tế là tuổi và mật
độ giống được sử dụng có ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian của pha lag, tốc độ sinh trưởng,
năng suất sinh khối, khả năng nảy chồi, chất lượng của sản phẩm cuối cùng và chi phí sản
xuất (Sen, 2004). Pha lag trong quá trình lên men đặc trưng cho thời gian cần thiết để các
tế bào thích nghi với môi trường hóa học và vật lý ngay lập tức. Vì vậy, môi trường nhân
giống nên được lựa chọn sao cho gần giống với môi trường sản xuất để giảm thiểu thời
gian thích nghi này (Sen, 2004). Chính vì lẽ đó, trong bài nghiên cứu này, khi dịch nấm
men được đưa từ môi trường giống sang môi trường khảo sát, sự phát triển của chúng
không trải qua pha lag do môi trường khảo sát là tương đương (đối với pH 5.0) và tối ưu
hơn (đối với các pH còn lại). Vì thế, nấm men không cần thời gian thích nghi với môi
trường mới.

Lượng đường trong môi trường mới lớn, lượng tế bào sinh ra nhiều nhưng không làm
ức chế tế bào, không những thế còn giúp nấm men có tốc độ sinh trưởng rất cao. Cụ thể là
đồ thị của các pH khảo sát đi từ giờ đầu tiên đã bắt đầu vô pha sinh trưởng, thời gian pha
sinh trưởng kéo dài gần hết thời gian tiến hành khảo sát. Có thể giải thích như sau: Hoạt
động lên men tăng lên khi lên men với mật độ tế bào ban đầu cao do hàm lượng pyruvate
được tạo ra ngày càng tăng và các hợp chất trao đổi trung gian của chu trình acid citric
được tạo ra hạn chế hơn (Ding, 2009).

Có sự chênh lệch tế bào tối đa ở các mốc pH khảo sát theo giá trị giảm dần, pH mẫu
giống càng cao, số lượng tế bào ở pha cân bằng càng lớn, nhưng không đáng kể. Sự chênh
lệch tế bào tối đa ở các mẫu khảo sát có thể xuất phát từ sự chênh lệch tốc độ sinh trưởng
giữa các mẫu, tốc độ sinh trưởng quá cao làm sinh khối không ổn định và lượng chất độc (
ethanol) sinh ra nhiều, gây ức chế sự phát triển, nên nấm men bị ép vào pha ổn định cụ thể
ở pH = 5.0 và 6.0. Ethanol là sản phẩm chính do quá trình lên men đường ở nấm men. Sự
tích tụ dần ethanol trong quá trình lên men đường của nấm men có thể dẫn đến sự ức chế
quá trình lên men (Casey, 1986), nồng độ ethanol trên 15% (v/v) dẫn đến bất hoạt ngay lập
tức quá trình chuyển hóa và sinh trưởng của hầu hết các chủng Saccharomyces cerevisiae
; ở nồng độ thấp hơn tạo ra tác dụng ức chế sự sinh trưởng của nấm men ở các mức độ khác
nhau tùy thuộc vào lượng ethanol tích tụ (Lloyd, 1993). Một báo cáo khác cũng đã cho
thấy ethanol có tác dụng khác nhau và riêng biệt trên cụ thể tốc độ tăng trưởng của quần
thể nấm men, khả năng sống sót và tốc độ lên men cụ thể của nấm men (D'amore, 1989).
Tốc độ sinh trưởng thấp hơn ở mẫu pH 7.0 và 8.0 giúp sinh khối ổn định hơn, các sản phẩm
lên men ít hơn, hạn chế sự ức chế sinh trưởng nên pha log kéo dài hơn làm số lượng tế bào
tối đa cao hơn so với pH 5.0 và 6.0.
 Cả 4 đường cong sinh trưởng đều có xu hướng nằm ngang từ giờ 10 đến giờ 11. Ta
có thể giải thích là do mật độ tế bào đã đạt mức tối đa làm cho nấm men không thể sinh
trưởng thêm mặc dù cơ chất trong môi trường còn nhiều (dựa theo đồ thị hàm lượng
đường).

Qua 11 giờ lên men, mật độ tế bào ở mẫu giống có pH 8.0 là cao nhất, đạt tối đa bằng
19.95 lnN/ml và thấp nhất ở pH 5.0 bằng 19.5 lnN/ml. Mẫu giống pH 5.0 và 6.0 vào pha
ổn định ở sau 8 giờ lên men, mẫu giống pH 7.0 sau 10 giờ và pH 8.0 có xu hướng vào pha
ổn định sau 11 giờ.

Đồ thị pha log

 Hình 2: Đồ thị pha log của các mẫu khảo sát

Pha log ở cả 4 mẫu đều diễn ra từ giờ 0, do thời gian pha lag không đáng kể. Mẫu ở
pH 8.0 kết thúc vào giờ 11, pH 7.0 kết thúc vào giờ 10, pH 5.0 và 6.0 kết thúc ở giờ 8.0.
Mẫu pH 8.0 có thời gian pha log dài nhất do lượng giống ban đầu thấp, tốc độ sinh trưởng
chậm hơn nên quá trình lên men ổn định và có xu hướng kéo dài hơn.

Hàm lượng đường tổng

 Hình 3: Đồ thị thể hiện hàm lượng đường tổng trong thời gian khảo sát

Hàm lượng chất khô tính theo sucrose được do bằng khúc xạ kế ở tất cả môi trường
đều có xu hướng giảm. Không có pha lag, sinh vật bắt đầu dùng đường cho quá trình lên
men từ giờ đầu nên đã có sự giảm hàm đường đường ở giờ 1. Mẫu có lượng giống càng
cao, tốc độ tiêu thụ đường càng cao (Ghorbani, 2011). Nhưng đến giờ thứ 11 thì cả 4 mẫu
khảo sát đều có lượng đường còn lại là tương đương nhau.

Phần trăm tế bào sống

 Hình 4: Đồ thị đường cong thể hiện % tế bào sống

Tỉ lệ tế bào sống khi bắt đầu pha log khá cao, dao động trong khoảng 87 - 90%. Tỉ lệ
tế bào sống sau 1 giờ lên men bắt đầu tăng mạnh. Tỉ lệ tế bào sống đạt mức cao nhất 97%
đối với pH 5.0 và pH 6.0 ở giờ thứ 6. Hai mẫu pH 7.0 và 8.0 có sự chênh lệch về tỉ lệ tế
bào sống khi đạt mức cao nhất là không đáng kể, chênh lệch khoảng 1 – 2%. Khi bắt đầu
vào pha ổn định, có sự giảm tỉ lệ tế bào sống, mẫu pH 5.0 và 6.0 giảm nhanh hơn mẫu pH
7.0 và 8.0 do vào pha ổn định sớm hơn.
 Hình 5: Đồ thị thể hiện % nảy chồi

Nhìn chung ở pha log, tốc độ sinh trưởng đạt cực đại, do đó tỉ lệ nảy chồi tăng theo
pha log đến cực đại và giảm vào đầu pha ổn định do khi vào pha ổn định tế bào bị ức chế
sinh trưởng. Riêng mẫu pH 8.0 đang có xu hướng vào pha ổn định nên đồ thị tỉ lệ chồi có
hướng đi ngang. Tại cuối pha log, đầu pha ổn định thì tỷ lệ nảy chồi có xu hướng giảm do
lượng cơ chất bắt đầu cạn kiệt (Boucherie, 1985), khả năng sinh trưởng giảm, lượng tế bào
sinh ra bằng tế bào chết đi, tỷ lệ nảy chồi không còn tăng cao như những giờ đầu của pha.

Phần trăm tế bào chết

 Hình 6: Đồ thị biểu hiện % chết của tế bào nấm men trong thời gian khảo sát

Nhìn chung, đồ thị % tế bào chết ở các pH khảo sát có chung xu hướng ban đầu là
giảm dần điều này phụ hợp với mật độ sinh trưởng đã khảo sát. Lượng tế bào chết ở pH
7.0 và 8.0 cao hơn 2 mẫu còn lại vì môi trường pH cao ức chế sự phát triển của nấm làm tỉ
lệ tế bào chết cao hơn. Tiếp theo sự sinh trưởng nấm men đi vào pha log thì % tế bào chết
giảm dần, do tế bào chết đi ít hơn tế bào sinh ra. Đến khoảng giờ thứ 6, % tế bào chết không
giảm nữa mà bắt đầu có dấu hiệu tăng dần. Lí do như vậy là do tế bào nấm men đang dần
vào pha ổn định, tốc độ sinh trưởng chậm dần, số tế bào sống vẫn nhiều nhưng lượng tê
bào sinh ra ít, dẫn đến % tế bào chết tăng.

Khi bắt đầu vào pha cân bằng, đồ thị tế bào chết có xu hướng đi lên, tỉ lệ tế bào chết
tăng lên do tốc độ sinh trưởng chậm lại. Có thể thấy tỉ lệ tế bào chết ở pH 5.0 và 6.0 tăng
nhanh hơn 2 mẫu còn lại do pha log của 2 mẫu này ngắn hơn, bước vào pha cân bằng sớm
hơn. Nhìn chung, tỉ lệ tế bào chết nằm trong khoảng từ 3 – 14%.

Độ pH môi trường tối ưu cho sự phát triển của S. cerevisiae là 5.0-5.5, điều này có
thể giải thích tỷ lệ sống tương đối cao hơn ở pH 5.0 (Verduyn, 1990). Nhìn chung, nấm
men sở hữu phạm vi tăng trưởng pH rộng được báo cáo là tăng trưởng trong phạm vi pH
2.5-8.0 (Praphailong, 1997). Do đó, độ pH nhân giống quá thấp hoặc quá cao sẽ ức chế
một phần sự phát triển của vi sinh vật, từ đó mà lượng tế bào chết đi ở những khoảng pH
này cao hơn so với khỏang pH tối ưu là 5.0.

Thông số động học

pH môi trường Thời gian thế Hằng số tốc độ
giống hệ(td) sinh trưởng(µ)
5 90.31786 0.46
6 85.34974 0.49
7 75.86576 0.55
8 71.06407 0.59

Theo số liệu khảo sát được ta thấy rằng thời gian thế hệ của các mẫu khảo sát pH
giống, giảm dần từ pH=5 đến pH=8. Dựa vào đồ thị mật độ sinh trưởng ta thấy được rằng
mật độ tế bào nấm men ban đầu có sự chênh lệch giữa các mẫu khảo sát. Mẫu pH=5 có số
lượng tế bào ban đầu nhiều nhất, thời gian pha log kéo dài khoảng 7h. Trong khi mẫu pH=8
tế bào ban đầu ít nhất, thời gian pha log kéo dài khoảng 11h. Mà lượng tế bào nấm men đạt
cực đại là tương đương nên sự chênh lệch thời gian thế hệ giữa các mẫu là có căn cứ.

Đối với hằng số tốc độ tăng trưởng ta dựa vào công thức tính hằng số tốc độ ta thấy
được rằng khi thời gian thế hệ càng cao thì tốc độ sinh trưởng càng chậm. Dựa vào số liệu
ta thấy được rằng mẫu pH giống = 5 có hằng số tốc độ sinh trưởng chậm nhất, và tăng dần
cho đến mẫu pH giống = 8.

KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, khi sử dụng môi trường lên men Md1 thay
giá đỗ bằng cà chua để nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae ở các điều kiện pH
nhân giống khác nhau (5.0, 6.0, 7.0, 8.0) trong cùng một nhiệt độ phòng, thì sau 12 giờ
nuôi cấy (kể từ khi tiếp giống), ở các mẫu pH 5.0 và 6.0 số lượng tế bào đạt cực đại nhanh
hơn so vởi các mẫu pH 7.0 và 8.0. Do đó, thời gian sinh trưởng của nấm men càng dài,
đồng thời lượng sinh khối thu được cũng nhiều hơn ở các mẫu có pH nhân giống càng cao.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Boucherie, H. (1985). Protein synthesis during transition and stationary phases under
glucose limitation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of bacteriology, 161(1),
385-392.
Carmelo, V. B.-C. (1996). Activity of plasma membrane H+-ATPase and expression of
PMA1 and PMA2 genes in Saccharomyces cerevisiae cells grown at optimal and
low pH. Archives of microbiology, 166(5), 315-320.
Casey, G. P. (1986). Ethanol tolerance in yeasts. CRC Critical Reviews in Microbiology,
13(3), 219-280.
D'amore, T. P. (1989). A study of ethanol tolerance in yeast. Critical reviews in
biotechnology, 9(4), 287-304.
Ding, M. Z. (2009). Inoculum size-dependent interactive regulation of metabolism and
stress response of Saccharomyces cerevisiae revealed by comparative
metabolomics. Journal of biotechnology, 144(4), 279-286.
Feldmann, H. (2011). Yeast: molecular and cell biology. John Wiley & Sons.
Ghorbani, F. Y. (2011). Cane molasses fermentation for continuous ethanol production in
an immobilized cells reactor by Saccharomyces cerevisiae. Renewable energy,
36(2), 503-509.
Lloyd, D. M. (1993). Effects of growth with ethanol on fermentation and membrane
fluidity of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 9(8), 825-833.
Narendranath, N. V. (2005). Relationship between pH and medium dissolved solids in
terms of growth and metabolism of lactobacilli and Saccharomyces cerevisiae
during ethanol production. Appl. Environ. Microbiol., 71(5), 2239-2243.
Nwaka, S. &. (1997). Molecular biology of trehalose and the trehalases in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Trong S. &. Nwaka, Progress in nucleic acid research
and molecular biology (trang 197-237). Academic Press.
Nwaka, S. &. (1997). Molecular biology of trehalose and the trehalases in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Trong S. &. Nwaka, Progress in nucleic acid research
and molecular biology (trang 197-237). Academic Press.
Peña, A. S. (2015). Effects of high medium pH on growth, metabolism and transport in
Saccharomyces cerevisiae. FEMS yeast research, 15(2).
Praphailong, W. &. (1997). The effect of pH, sodium chloride, sucrose, sorbate and
benzoate on the growth of food spoilage yeasts. Food Microbiology, 14(5), 459-
468.
Sen, R. &. (2004). Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze
the effects of inoculum age and size on surfactin production. Biochemical
Engineering Journal, 21(2), 141-148.
Verduyn, C. P. (1990). Energetics of Saccharomyces cerevisiae in anaerobic glucose-
limited chemostat cultures. Microbiology, 136(3), 405-412.