Metode odredjivanja proteina u namirnicama

Izbor metode za određivanje koncentracije proteina u pojedinom slučaju ovisi o količini proteina
kojom se raspolaže, njihovoj koncentraciji, prisutnosti različitih agenasa koji mogu utjecati na
rezultate mjerenja (detergenti, organska otapala, reducirajući agensi, soli, kiseline, lužine itd.), o vrsti
i čistoći proteina u otopini te o potrebnoj preciznosti mjerenja. Fizikalnokemijske metode za
određivanje koncentracije proteina se dijele na apsorpcijske i kolorimetrijske metode.

APSORPCIJSKE METODE

Apsorpcijske metode se baziraju na apsorpciji svjetlosti određene valne duljine u otopini proteina.
Proteini imaju apsorpcijske maksimume pri valnim duljinama od 280 nm i 205 nm (UV dio spektra).
Svjetlost valne duljine 280 nm u molekulama proteina apsorbiraju aromatski prstenovi aminokiselina
(Trp, Phe, Tyr). Proteini sa manjim udjelom aromatskih aminokiselina stoga imaju manju A280 u
odnosu na proteine koji sadrže više aromatskih aminokiselina. Nadalje, na vrijednost A280 utječu
faktori koji djeluju na tercijarnu strukturu proteina (budući da interakcije aminokiselinskih ostataka u
tercijarnoj strukturi doprinose stabilizaciji elektrona u aromatskim prstenovima) kao i prisustvo
drugih molekula u otopini koje apsorbiraju svjetlost pri 280 nm. Svjetlost valne duljine 205 nm
apsorbiraju peptidne veze u proteinima pa aminokiselinski sastav proteina znatno manje utječe na
vrijednost A205 nego što je to slučaj kod A280. Veliki broj pepetidnih veza u molekuli proteina
rezultira visokom vrijednošću apsorbancije pa je mjerenjem A205 moguće detektirati znatno manje
koncentracije proteina nego pri 280 nm (A205 su oko 30 puta veće nego A280 za istu koncentraciju
proteina). Međutim, znatno veći broj kemikalija apsorbira svjetlost pri ovoj valnoj duljini nego što je
to slučaj pri 280 nm (pogotovo one koje sadrže dvostruke veze između atoma ugljika ili ugljika i
kisika). Određivanje koncentracije proteina mjerenjem A280, odnosno A205 je brzo i jednostavno, a
odnos koncentracije proteina i vrijednosti apsorbancija je linearan u širokom opsegu koncentracija.
Dodatna prednost ovih metoda je što se proteinima tijekom mjerenja ne dodaju nikakvi reagensi, niti
se na bilo koji način utječe na njihova svojstva, pa se nakon završetka mjerenja mogu koristiti u
daljnjim eksperimentima.

KOLORIMETRIJSKE METODE

Kolorimetrijske metode se baziraju na kemijskoj reakciji proteina sa različitim reagensima pri čemu se
razvija karakteristično obojenje otopine. Intenzitet razvijene boje je u određenom opsegu
koncentracija proteina proporcionalan koncentraciji proteina, a najpreciznija su mjerenja u
središnjem dijelu područja proporcionalnosti. Na točnost mjerenja mogu utjecati i druge molekule
koje su prisutne u otopini proteina (puferi, soli, detergenti itd.), a na rezultate mjerenja utječe i vrsta
proteina tako da različiti proteini jednake koncentracije mogu pokazivati različite vrijednosti
 apsorbancije. Stoga je od iznimne važnosti da se za izradu baždarnog dijagrama, ukoliko je to
moguće, koristi protein čiju koncentraciju kasnije želimo određivati u uzorcima, odnosno, ako to nije
moguće, protein koji daje najsličnije vrijednosti apsorbancije. Osim toga slijepa proba mora
sadržavati sve komponente koje sadrži i uzorak u kojem mjerimo koncentraciju proteina kako bi se
eliminirao njihov utjecaj na vrijednosti apsorbancije.

Određivanje proteina metodom po Lowry-u

Metoda se bazira na reakciji Cu2+ sa peptidnim vezama proteina u lužnatom mediju pri čemu dolazi
do redukcije Cu2+ u Cu+. Nakon toga se u reakcijsku smjesu dodaje FolinCiocalteu reagens koji
reagira sa Cu+-protein kompleksom kao i sa pobočnim lancima Tyr, Trp i Cys stvarajući u početku
nestabilan kompleks koji se polako reducira pri čemu se razvija plavo obojenje. Prisustvo agenasa koji
zakiseljuju otopinu (npr. kiseline, jaki kiseli puferi, visoka konc. amonij sulfata i sl.), kelirajućih
agenasa koji vežu Cu2+ (npr. EDTA) ili reducirajućih agenasa (npr. -merkaproetanol, ditiotreitol i sl.)
znatno utječe na rezultate mjerenja. Također na rezultate mjerenja utječu i razlike u sadržaju Tyr i
Trp u proteinima.

Određivanje proteina metodom po Bradford-u

Metoda se bazira na reakciji proteina sa bojom Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) u kiselom
mediju. CBB reagira prvenstveno sa pobočnim grupama Arg, a u manjoj mjeri i sa pobočnim grupama
His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Boja se na proteine veže hidrofobnim interakcijama i ionskim vezama što
stabilizira boju u anionskom obliku i dovodi do vidljive promjene boje iz smeđe u plavu. Pri tome se
apsorpcijski maksimum boje pomiče sa 465 nm na 595 nm što se prati spektrofotometrijski. Ova
metoda je u širokoj upotrebi zbog svoje jednostavnosti, brzine i širokog opsega proprocionalnosti
intenziteta obojenja i koncentracije proteina