3.1. Phương pháp Sắc ký cột .

3.1.1. Đại cương về phương pháp

1. Introduction to column chromatography
Column chromatography is a chromatography technique used to separate
mixture of chemical substances into its individual compounds. Column
chromatography is a widely used method for the purification or separation of
chemical compound mixture in lab. In this chromatography process, the
molecule mixture is separated depending on its differentials partitioning
between a stationary phase and a mobile phase.

2 Principles of column chromatograph

Column Chromatography consists of two phases: one mobile phase and one
contiguous stationery phase. The stationery phase is solid and the mobile phase is
liquid. The compound mixture moves along with the mobile phase through stationery
phase and separates depending on the different degree of adhesion (to the silica) of
each component in the sample or the compound mixture.

When the mobile phase along with the mixture that needs to be separated is introduced
from the top of the column, the movement of the individual components of the
mixture is at different rates. The components with lower adsorption and affinity to
stationary phase travel faster when compared to the greater adsorption and affinity
with the stationary phase. The components that move fast are removed first whereas
the components that move slow are eluted out last.
The adsorption of solute molecules to the column occurs in a reversible manner. The
rate of the movement of the components is expressed as:
Rf = the distance travelled by solute/ the distance travelled by solvent
Rf is the retardation facto

3 Types of Column Chromatography:

3.1. Adsorption column chromatography – Adsorption chromatography is a technique
of separation, in which the components of the mixture are adsorbed on the surface of
the adsorbent.
3.2. Partition column chromatography – The stationary phase, as well as mobile phase,
are liquid in partition chromatography.
3.3. Gel column chromatography – In this method of chromatography, the separation
takes place through a column packed with gel. The stationary phase is a solvent held
in the gap of a solvent.
3.4. Ion exchange column chromatography – A chromatography technique in which
the stationary phase is always ion exchange resin.
4. Factors affecting column chromatography

Column efficiency and solvent efficiency

As with HPLC, column efficiency is measured in theoretical plates (N) and is a
quantitative measure of the extent of peak broadening – the narrower the peak, the
more efficient will be the column thereby leading to improved resolution.

There are various factors that affect column efficiency and so when comparing
columns these factors need to be stated:

 Stationary phase (and how thick)

 Temperature
 Carrier gas and flow rate
 Particle diameter (packed column)
 Column pressure
 Column diameter.
 Explanation
 The stationery phase
 A glass tube with a circle large inlet and a small outlet with a plug or tap,
named as column is used for this column chromatography. The column is
placed vertically with a stand where the outlet is downward.


 A piece of cotton wool is entered into the outlet and placed over the plug if
there are no glass wool present to stop escaping the stationery phase from the
column. There are two procedure to prepare the column by packing with silica
or alumina:
  Dry method: In dry method at first the column is filled with dry powdered
silica. Then the mobile phase, a suitable solvent is flushed through it until all
the silica are wet and settled. From this point till the end always the column
need to keep wet with solvent.
 Wet method: In wet method firstly a slurry of silica and solvent is prepared and
then poured onto the column using a funnel. More solvent must be used until
the silica is settled into it.
3.1.2 Các thiết bị dụng cụ sử dụng trong quy mô quy mô phòng thí nghiệm (trong
quy mô công nghiệp nếu có thì nêu ra )
3.1.2. Các ví dụ cụ thể (ít nhất 2 vd: Có sơ đồ khối, thuyết minh chi tiết, nêu
tính chất vật lý của các chất tham gia, trong slide không cần nêu thuyết
minh chi tiết)
3.1.3. Example
1. Một phương pháp định lượng được mô tả để xác định formaldehyd (CH 2
O) trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng. Chiết xuất dẫn xuất
Aldehyd được thực hiện tại chỗ với 2,4-dinitrophenylhydrazine trong môi
trường phản ứng 2 pha. Độ thu hồi trung bình của CH2O thêm (0,1 μg /
mL) là 89,9 ± 3,9% với giới hạn phát hiện ước tính là 0,009 mg / kg. Kỹ
thuật này được sử dụng để xác định CH2O trong sữa thương mại 2% và
sữa tươi của bò được nuôi theo chế độ ăn sữa điển hình ở Bắc Mỹ. Nồng
độ trung bình của CH2O trong sữa tươi và thương mại lần lượt là 0,027
và 0,164 mg / kg. .
https://academic.oup.com/jaoac/article-abstract/76/5/1010/5689211
2. Lấy 10 gam lá rau muống còn tươi (khoảng 30 lá) hoặc lá xanh khác cắt
nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá), trộn thêm 2 gam bột CaCO3 để trung
hoà dịch axit của tế bào, có thể cho một ít bột thuỷ tinh cho dễ nghiền.
Nghiền các mẩu lá đến khi thành một thể đồng nhất, cho 15 - 20 ml
axeton 80% hoặc cồn etylic 90o vào cối sứ khuấy đều và để 5 phút rồi
lọc bằng bông trên phễu thuỷ tinh, dung dịch thu được trộn với 2,0 ml
toluen rồi chiết bằng phễu chiết lấy phần trên (màu xanh đậm) được dịch
mẫu.
Tiến hành sắc ký cột Sử dụng buret chuẩn độ loại 25 ml làm cột sắc ký, pha
tĩnh là silicagel kích thước hạt 40 – 60 mesh, bột CaCO3, bột đường glucozơ,
tinh bột sắn dây. Nạp silicagel vào buret đạt chiều cao cột khoảng 10 – 12 cm,
bột đường glucozơ 25 – 30 cm, còn bột canxi cacbonat nạp 15 – 20 cm là được.
Dung môi sử dụng là các hệ: ete dầu hỏa – axeton; toluen – axeton; toluen –
cồn etylic tuyệt đối; axeton – HCl đặc; NH4NO3 4M – NH3 4M; CH3COOH
1,5M – CH3COONH4 1,5M. Cho 3 - 5 giọt mẫu trực tiếp vào cột không để xáo
trộn bề mặt lớp silicagel (pha tĩnh) hoặc mẫu dính lên thành thuỷ tinh phía trên
của buret. Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông hoặc phủ 0,3
cm cát sạch ở bên trên mẫu để khi nạp dung môi vào lớp silicagel (p) và mẫu
không bị xáo trộn. để tốc độ chảy của dung môi khoảng 12 – 15 giọt/phút.