You are on page 1of 12

Column chromatography in chemistry is a method used to purify individual chemical compounds from mixtures of compounds.

It is often used for preparative applications on scales from micrograms up to kilograms.The main advantage of column chromatography is the relatively low cost and disposability of the stationary phase used in the process. The latter prevents cross-contamination and stationary phase degradation due to recycling. The classical preparative chromatography column, is a glass tube with a diameter from 5 mm to 50 mm and a height of 5 cm to 1 m with a tap and some kind of a filter (a glass frit or glass wool plug to prevent the loss of the stationary phase) at the bottom. Two methods are generally used to prepare a column: the dry method, and the wet method.

For the dry method, the column is first filled with dry stationary phase powder, followed by the addition of mobile phase, which is flushed through the column until it is completely wet, and from this point is never allowed to run dry. For the wet method, a slurry is prepared of the eluent with the stationary phase powder and then carefully poured into the column. Care must be taken to avoid air bubbles. A solution of the organic material is pipetted on top of the stationary phase. This layer is usually topped with a small layer of sand or with cotton or glass wool to protect the shape of the organic layer from the velocity of newly added eluent. Eluent is slowly passed through the column to advance the organic material. Often a spherical eluent reservoir or an eluent-filled and stoppered separating funnel is put on top of the column.

The individual components are retained by the stationary phase differently and separate from each other while they are running at different speeds through the column with the eluent. At the end of the column they elute one at a time. During the entire chromatography process the eluent is collected in a series of fractions. The composition of the eluent flow can be monitored and each fraction is analyzed for dissolved compounds, e.g. by analytical chromatography, UV absorption, or fluorescence. Colored compounds (or fluorescent compounds with the aid of an UV lamp) can be seen through the glass wall as moving bands.

Stationary phase

Column chromatography proceeds by a series of steps.

The stationary phase or adsorbent in column chromatography is a solid. The most common stationary phase for column chromatography is silica gel, followed by alumina. Cellulose powder has often been used in the past. Also possible are ion exchange chromatography, reversed-phase chromatography (RP), affinity chromatography or expanded bed adsorption (EBA). The stationary phases are usually finely ground powders or gels and/or are microporous for an increased surface, though in EBA a fluidized bed is used. There is an important ratio between the stationary phase weight and the dry weight of the analyte mixture that can be applied onto the column. For silica column chromatography, this ratio lies within 20:1 to 100:1, depending on how close to each other the analyte components are being eluted.[1]

Mobile phase (eluent)

The mobile phase or eluent is either a pure solvent or a mixture of different solvents. It is chosen so that the retention factor value of the compound of interest is roughly around 0.2 - 0.3 in order to minimize the time and the amount of eluent to run the chromatography. The eluent has also been chosen so that the different compounds can be separated effectively. The eluent is optimized in small scale pretests, often using thin layer chromatography (TLC) with the same stationary phase. There is an optimum flow rate for each particular separation. A faster flow rate of the eluent minimizes the time required to run a column and thereby minimizes diffusion, resulting in a better separation. However, the maximum flow rate is limited because a finite time is required for analyte to equilibrate between stationary phase and mobile phase, see Van Deemter's equation. A simple laboratory column runs by gravity flow. The flow rate of such a column can be increased by extending the fresh eluent filled column above the top of the stationary phase or decreased by the tap controls. Faster flow rates can be achieved by using a pump or by using compressed gas (e.g. air, nitrogen, or argon) to push the solvent through the column (flash column chromatography).[2][3] The particle size of the stationary phase is generally finer in flash column chromatography than in gravity column chromatography. For example, one of the most widely used silica gel grades in the former technique is mesh 230 400 (40 63 m), while the latter technique typically requires mesh 70 230 (63 200 m) silica gel.[4] A spreadsheet that assists in the successful development of flash columns has been developed. The spreadsheet estimates the retention volume and band volume of analytes, the fraction numbers expected to contain each analyte, and the resolution between adjacent peaks. This information allows users to select optimal parameters for preparative-scale separations before the flash column itself is attempted.[5]

[edit] Automated Systems

An automated ion chromatography system. Column chromatography is an extremely time consuming stage in any lab and can quickly become the bottleneck for any process lab. Therefore, several manufacturers have developed automated flash chromatography systems (typically referred to as LPLC, low pressure liquid chromatography, around 50-75 psi) that minimize human involvement in the purification process. Automated systems will include components normally found on more expensive HPLC systems such as a gradient pump, sample injection ports, a UV detector and a fraction collector to collect the eluent. Typically these automated systems can separate samples from a few milligrams up to an industrial kg scale and offer a much cheaper and quicker solution to doing multiple injections on prep-HPLC systems. The resolution (or the ability to separate a mixture) on an LPLC system will always be lower compared to HPLC, as the packing material in an HPLC column can be much smaller, typically only 5 micrometre thus increasing stationary phase surface area, increasing surface interactions and giving better separation. However, the use of this small packing media causes the high back pressure and is why it is termed high pressure liquid chromatography. The LPLC columns are typically packed with silica of around 50 micrometres, thus reducing back pressure and resolution, but it also removes the need for expensive high pressure pumps. Manufacturers are now starting to move into higher pressure flash chromatography systems and have termed these as medium pressure liquid chromatography (MPLC) systems which operate above 150 psi.

Typical set up for manual column chromatography. The software controlling an automated system will coordinate the components, allow a user to only collect the factions that contain their target compound (assuming they are detectable on the system's detector) and help the user to find the resulting purified material within the fraction collector. The software will also save the resulting chromatograph from the process for archival and/or later recall purposes. A representative example of column chromatography as part of an undergraduate laboratory exercise is the separation of three components (out of 28) in the oil of spearmint: carvone,

limonene and dehydrocarveol.[6] A microscale setup consisting of a Pasteur pipette as column with silica gel stationary phase can suffice. The starting eluent is hexane and solvent polarity is increased during the process by adding ethyl acetate.

Column Chromatogram Resolution Calculation

Powdery silicate for column chromatography Typically, column chromatography is set up with peristaltic pumps, flowing buffers and the solution sample through the top of the column. The solutions and buffers pass through the column where a fraction collector at the end of the column setup collects the eluted samples. Prior to the fraction collection, the samples that are eluted from the column pass through a detector such as a spectrophotometer or mass spectrometer so that the concentration of the separated samples in the sample solution mixture can be determined. For example, if you were to separate two different proteins with different binding capacities to the column from a solution sample, a good type of detector would be a spectrophotometer using a wavelength of 280 nm. The higher the concentration of protein that passes through the eluted solution through the column, the higher the absorbance of that wavelength. Because the column chromatography has a constant flow of eluted solution passing through the detector at varying concentrations, the detector must plot the concentration of the eluted sample over a course of time. This plot of sample concentration versus time is called a chromatogram. The ultimate goal of chromatography is to separate different components from a solution mixture. The resolution expresses the extent of separation between the components from the mixture. The higher the resolution of the chromatogram, the better the extent of separation of the samples the column gives. This data is a good way of determining the columns separation properties of that particular sample. The resolution can be calculated from the chromatogram. The separate curves in the diagram represent different sample elution concentration profiles over time based on their affinity to the column resin. To calculate resolution, the retention time and curve width are required. Retention Time: The time from the start of signal detection by the detector to the peak height of the elution concentration profile of each different sample.

Curve Width: The width of the concentration profile curve of the different samples in the chromatogram in units of time. A simplified method of calculating chromatogram resolution is to use the plate model.[7] The plate model assumes that the column can be divided into a certain number of sections, or plates and the mass balance can be calculated for each individual plate. This approach approximates a typical chromatogram curve as a Gaussian distribution curve. By doing this, the curve width is estimated as 4 times the standard deviation of the curve, 4. The retention time is the time from the start of signal detection to the time of the peak height of the Gaussian curve. From the variables in the figure above, the resolution, plate number, and plate height of the column plate model can be calculated using the equations: Resolution (Rs) Rs = 2(tRB tRA)/(wB + wA) Where: tRB = retention time of solute B tRA = retention time of solute A wB = Gaussian curve width of solute B wA = Gaussian curve width of solute A Plate Number (N): N = (tR)2/(w/4)2 Plate Height (H): H = L/N Where L is the length of the column.[7]

Column Adsorption Equilibrium

For an adsorption column, the column resin (the stationary phase) is composed of microbeads. Even smaller particles such as proteins, carbohydrates, metal ions, or other chemical compounds are conjugated onto the microbeads. Each binding particle that is attached to the microbead can be assumed to bind in a 1:1 ratio with the solute sample sent through the column that needs to be purified or separated. Binding between the target molecule to be separated and the binding molecule on the column beads can be modeled using a simple equilibrium reaction Keq = [CS]/([C][S]) where Keq is the equilibrium constant, [C] and [S] are the concentrations of the target molecule and the binding molecule on the column resin, respectively. [CS] is the concentration of the complex of the target molecule bound to the column resin.[7] Using this as a basis, three different isotherms can be used to describe the binding dynamics of a column chromatography: linear, Langmuir, and Freundlich.

The linear isotherm occurs when the solute concentration needed to be purified is very small relative to the binding molecule. Thus, the equilibrium can be defined as: [CS] = Keq[C]. For industrial scale uses, the total binding molecules on the column resin beads must be factored in because unoccupied sites must be taken into account. The Langmuir isotherm and Freundlich isotherm are useful in describing this equilibrium. Langmuir Isotherm: [CS] = (KeqStot[C])/(1 + Keq[C]), where Stot is the total binding molecules on the beads. Freundlich Isotherm: [CS] = Keq[C]1/n The Freundlich isotherm is used when the column can bind to many different samples in the solution that needs to be purified. Because the many different samples have different binding constants to the beads, there are many different Keqs. Therefore, the Langmuir isotherm is not a good model for binding in this case.[

Kromatografi lajur dalam kimia adalah satu kaedah yang digunakan untuk membersihkan bahan kimia individu dari campuran sebatian. Ia sering digunakan untuk persiapan aplikasi pada skala dari mikrogram sehingga kilograms.The kelebihan utama lajur kromatografi kos yang agak rendah dan disposability fasa pegun yang digunakan dalam proses. Yang terakhir ini menghalang salibpencemaran dan degradasi fasa pegun kerana untuk kitar semula. Lajur kromatografi persiapan klasik, tiub kaca dengan garis pusat daripada 5 mm hingga 50 mm dan ketinggian 5 cm kepada 1 m dengan paip dan beberapa jenis penapis (frit kaca atau kaca plug wol - Kerugian untuk mencegah fasa pegun) di bahagian bawah. Dua kaedah yang digunakan untuk menyediakan lajur: kaedah kering, dan kaedah basah. * Untuk kaedah kering, ruang yang mula-mula dipenuhi dengan serbuk fasa pegun kering, diikuti dengan penambahan fasa mudah alih, yang membilas melalui ruangan sehingga ia benar-benar basah, dan dari sudut ini tidak dibenarkan untuk menjalankan kering. * Untuk kaedah basah, buburan bersedia eluent itu dengan serbuk fasa pegun dan kemudian berhati-hati dituangkan ke dalam turus. Perhatian perlu

diambil untuk mengelakkan gelembung udara. A penyelesaian bahan organik pipetted di atas fasa pegun. Lapisan ini biasanya mendahului dengan lapisan pasir yang kecil atau dengan kapas, bulu lembut kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari halaju eluent baru ditambah. Eluent perlahan-lahan melalui kolum untuk memajukan bahan organik. Sering kali takungan eluent sfera atau saluran eluent diisi dan stoppered memisahkan diletakkan di atas tiang. Komponen-komponen individu dikekalkan oleh fasa pegun yang berbeza dan berasingan antara satu sama lain ketika mereka berjalan pada kelajuan yang berbeza melalui ruangan dengan eluent. Pada akhir ruang yang mereka elute satu pada satu-satu masa. Semasa proses kromatografi seluruh eluent dikumpulkan dalam satu siri pecahan. Komposisi aliran eluent boleh dipantau dan setiap pecahan dianalisis bagi sebatian terlarut, contohnya oleh kromatografi analisis, penyerapan UV, atau pendarfluor. Sebatian berwarna (atau sebatian pendarfluor dengan bantuan lampu UV) boleh dilihat melalui dinding kaca sebagai bergerak ke band. Kromatografi Lajur hasil oleh satu siri langkah-langkah. Fasa pegun atau Adsorben dalam lajur kromatografi pepejal. Fasa pegun yang paling biasa untuk kromatografi ruangan gel silika, diikuti oleh alumina. Serbuk selulosa telah sering digunakan pada masa lalu. Juga mungkin kromatografi pertukaran ion, balikan-fasa kromatografi (RP), pertalian kromatografi atau berkembang katil penjerapan (EBA). Fasa pegun biasanya serbuk tanah halus atau gel dan / atau microporous untuk permukaan yang lebih tinggi, walaupun di EBA katil fluidized digunakan. Terdapat nisbah penting antara berat fasa pegun dan berat kering campuran analyte yang boleh digunakan ke dalam ruang yang. Untuk silika lajur kromatografi, nisbah ini terletak dalam 20:01 untuk 100:1, bergantung kepada sejauh mana jarak antara satu sama lain komponen analyte eluted. [1] [Sunting] Fasa Bergerak (eluent) Fasa mudah alih atau eluent sama ada pelarut yang tulen atau campuran pelarut yang berbeza. Ia adalah dipilih supaya faktor pengekalan nilai kompaun kepentingan kira-kira sekitar 0,2 - 0,3 untuk mengurangkan masa dan jumlah

eluent untuk menjalankan kromatografi. Eluent juga telah dipilih supaya sebatian yang berbeza boleh dipisahkan dengan berkesan. Eluent dioptimumkan dalam pretests skala kecil, sering menggunakan kromatografi lapisan nipis (TLC) dengan fasa pegun yang sama. Terdapat kadar alir optimum untuk perpisahan setiap tertentu. Kadar aliran yang lebih cepat eluent yang mengurangkan masa yang diperlukan untuk menjalankan lajur dan penyebaran dan dengan itu mengurangkan, yang mengakibatkan pemisahan lebih baik. Walau bagaimanapun, kadar aliran maksimum adalah terhad kerana masa yang terhingga adalah dikehendaki untuk analyte memperimbangkan antara fasa pegun dan fasa bergerak, lihat persamaan Van Deemter. Ruangan makmal yang mudah dijalankan oleh aliran graviti. Kadar aliran lajur boleh meningkat dengan melanjutkan lajur baru eluent yang diisi di atas bahagian atas fasa pegun atau menurun kawalan paip. Kadar aliran yang lebih cepat boleh dicapai dengan menggunakan pam atau dengan menggunakan gas yang dimampatkan (contohnya udara, nitrogen, argon) untuk menolak pelarut melalui ruang (flash lajur kromatografi). [2] [3] Saiz zarah fasa pegun adalah umumnya lebih halus dalam flash lajur kromatografi daripada dalam kromatografi ruangan graviti. Sebagai contoh, salah satu gel yang paling digunakan secara meluas gred silika dalam bekas teknik mesh 230 - 400 (40 - 63 m), manakala teknik kedua biasanya memerlukan mesh 70 - 230 (63 - 200 m). Gel silika [4] A spreadsheet yang membantu kejayaan pembangunan tiang flash telah dibangunkan. Spreadsheet menganggarkan isipadu jumlah dan pengekalan band analytes, nombor pecahan yang dijangka mengandungi setiap analyte, dan resolusi antara puncak yang bersebelahan. Maklumat ini membolehkan pengguna untuk memilih parameter yang optimum untuk pemisahan-besaran persiapan sebelum ruangan flash sendiri cuba. [5]
[Sunting] Sistem Automasi Suatu sistem kromatografi ion automatik.

Kromatografi lajur adalah peringkat yang sangat memakan masa apa-apa di dalam makmal dan boleh dengan cepat menjadi kesesakan bagi mana-mana makmal proses. Oleh itu, beberapa badan pengeluar telah membangunkan sistem automatik flash kromatografi (biasanya dirujuk sebagai LPLC, kromatografi cecair tekanan rendah, sekitar 50-75 psi) yang mengurangkan penglibatan manusia dalam proses penyucian. Sistem automatik akan termasuk komponen yang biasanya dijumpai pada sistem HPLC yang lebih mahal seperti pam kecerunan, pelabuhan suntikan sampel, pengesan UV dan pengumpul pecahan untuk mengumpul eluent. Biasanya sistem automatik ini boleh memisahkan sampel dari beberapa miligram sehingga skala kg perindustrian dan menawarkan penyelesaian yang lebih murah dan cepat untuk melakukan suntikan di beberapa tempat di prep-HPLC sistem. Resolusi (atau kemampuan untuk memisahkan campuran) pada sistem LPLC selalunya akan lebih rendah berbanding untuk HPLC, sebagai bahan pembungkusan dalam ruang HPLC boleh lebih kecil, biasanya hanya 5 micrometre seterusnya meningkatkan fasa kawasan permukaan pegun, meningkatkan interaksi permukaan dan memberi pemisahan yang lebih baik. Walau bagaimanapun, penggunaan media pembungkusan kecil ini menyebabkan tekanan belakang yang tinggi dan mengapa ia dipanggil kromatografi cecair tekanan tinggi. Ruangan LPLC biasanya dibungkus dengan silika sekitar 50 mikrometer, sekali gus mengurangkan tekanan dan resolusi, tetapi ia juga menghapuskan keperluan untuk pam tekanan tinggi yang mahal. Pengilang kini mula berpindah ke yang lebih tinggi tekanan sistem kromatografi flash dan telah dipanggil-tekanan cecair kromatografi (MPLC) sebagai bahasa pengantar sistem yang beroperasi di atas 150 psi. Tipikal ditubuhkan untuk manual lajur kromatografi. Perisian yang mengawal sistem automatik akan menyelaras komponen, membenarkan pengguna untuk hanya mengumpulkan kumpulan-kumpulan yang mengandungi kompaun sasaran mereka (menganggap mereka dikesan pengesan sistem) dan membantu pengguna untuk mencari kebendaan hasil yang disucikan dalam pemungut pecahan. Perisian ini juga akan menjimatkan Berolak Kromatografi yang terhasil daripada proses untuk arkib dan / atau kemudian ingat tujuan. Satu contoh yang mewakili lajur kromatografi sebagai sebahagian daripada latihan makmal seorang pelajar institusi pengajian pemisahan tiga komponen (daripada 28) dalam minyak spermin: carvone, limonene dan dehydrocarveol [6] setup microscale terdiri pipet Pasteur sebagai ruang dengan. fasa gel silika pegun boleh memadai. Eluent bermula heksana dan kekutuban pelarut meningkat semasa proses itu dengan menambah asetat etil. [Sunting] Lajur Kromatogram Resolusi hitungan Silikat serbuk untuk kromatografi ruangan Biasanya, kromatografi ruangan yang ditubuhkan dengan pam peristaltik, penampan yang mengalir dan contoh penyelesaian melalui bahagian atas tiang. Penyelesaian dan penampan melalui ruang di mana pengumpul pecahan pada akhir persediaan ruang mengumpul sampel eluted. Sebelum koleksi pecahan, sampel yang eluted dari pas ruang melalui pengesan seperti spektrometer spectrophotometer atau jisim supaya kepekatan sampel yang dipisahkan dalam campuran larutan sampel boleh ditentukan.

Sebagai contoh, jika anda adalah untuk memisahkan dua protein yang berbeza dengan kapasiti yang berlainan mengikat terus ke kolum dari sampel penyelesaian, jenis yang baik pengesan akan spectrophotometer menggunakan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi kepekatan protein yang melalui penyelesaian eluted melalui ruangan, yang lebih tinggi kuantiti panjang gelombang itu. Kerana kromatografi ruangan mempunyai aliran malar penyelesaian eluted melalui pengesan pada kepekatan yang berbeza-beza, pengesan mesti plot kepekatan sampel eluted sepanjang masa. Plot kepekatan sampel melawan masa ini dipanggil Kromatogram. Matlamat akhir kromatografi untuk memisahkan komponen yang berbeza dari campuran penyelesaian. Resolusi meluahkan sejauh mana pemisahan antara komponen dari campuran. Semakin tinggi resolusi Kromatogram, lebih baik sejauh mana pemisahan sampel ruang yang memberikan. Data ini adalah cara yang baik menentukan ciri-ciri pemisahan lajur sampel tersebut. Resolusi boleh dikira dari Kromatogram. Lengkung berasingan dalam rajah mewakili profil sampel elution kepekatan yang berbeza dari masa ke masa berdasarkan pertalian mereka untuk resin lajur. Untuk mengira resolusi, masa tahanan dan lebar lengkung dikehendaki. Penyimpanan Masa: Masa dari awal pengesanan isyarat oleh pengesan ketinggian puncak profil kepekatan elution setiap sampel yang berbeza. The Curve Lebar: lebar lengkung profil kepekatan sampel yang berbeza dalam Kromatogram dalam unit masa. Satu kaedah yang mudah mengira resolusi Kromatogram adalah untuk menggunakan model plat. [7] model plat mengandaikan bahawa ruang yang boleh dibahagikan kepada beberapa tertentu bahagian, atau plat dan baki jisim boleh dikira bagi setiap plat individu. Pendekatan ini lebih kurang Kromatogram lengkung tipikal sebagai lengkung agihan Gaussian. Dengan cara ini, lebar lengkung adalah dianggarkan sebagai 4 kali sisihan piawai lengkung, 4. Masa tahanan dari awal pengesanan isyarat ke semasa ketinggian puncak lengkung Gaussian. Dari pembolehubah dalam rajah di atas, resolusi, nombor plat, dan ketinggian plat model plat ruangan boleh dikira dengan menggunakan persamaan: Resolusi (RM) Rs = 2 (TRB - TRA) / (WB + wa) Di mana: TRB = masa tahanan B bahan larut TRA = masa tahanan bahan larut A WB = Gaussian keluk lebar B bahan larut

wa = Gaussian lebar lengkung A bahan larut Nombor Plate (N): N = (TR) 2 / (w / 4) 2 Ketinggian Plate (H): H=L/N Jika L ialah panjang tiang. [7] [Sunting] Lajur Adsorpsi Keseimbangan Untuk ruangan penjerapan, resin ruang (fasa pegun) terdiri microbeads. Malah yang lebih kecil zarah seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau sebatian kimia yang lain adalah conjugated ke microbeads. Setiap zarah mengikat yang dilampirkan kepada microbead boleh dianggap mengikat dalam nisbah 01:01 dengan sampel bahan larut yang dihantar melalui ruang yang perlu disucikan atau dipisahkan. Mengikat antara molekul sasaran dipisahkan dan molekul mengikat manik lajur boleh dimodelkan menggunakan tindak balas keseimbangan yang mudah Keq = [CS] / ([C] [S]) di mana Keq adalah pemalar keseimbangan, [C] dan [ S] kepekatan molekul sasaran dan molekul mengikat resin ruang masingmasing. [CS] kepekatan kompleks molekul sasaran yang terikat kepada resin ruang. [7] Menggunakan ini sebagai asas, tiga sesuhu yang berbeza boleh digunakan untuk menerangkan dinamik mengikat lajur kromatografi: linear, Langmuir, dan Freundlich. Sesuhu linear berlaku apabila kepekatan bahan larut yang diperlukan untuk disucikan adalah saudara yang sangat kecil kepada molekul yang mengikat. Oleh itu, keseimbangan dapat ditakrifkan sebagai: [CS] = Keq [C]. Untuk kegunaan skala industri, jumlah molekul yang mengikat manik resin ruangan mesti kira kerana laman itu tidak berpenghuni mestilah diambil kira. Sesuhu Langmuir dan Freundlich sesuhu berguna dalam menerangkan keseimbangan ini. Langmuir sesuhu: [CS] = (KeqStot [C]) / (1 + Keq [C]), di mana Stot adalah jumlah molekul mengikat manik. Freundlich sesuhu: [CS] = Keq [C] 1 / n Sesuhu Freundlich digunakan apabila ruang yang boleh mengikat pada sampel pelbagai dalam penyelesaian yang perlu dibersihkan. Kerana sampel yang berlainan mempunyai pemalar yang berbeza yang mengikat kepada manik, terdapat banyak berbeza Keq. Oleh itu, garisan sesuhu Langmuir bukan model yang baik untuk mengikat dalam hal ini. [