PHÂN LẬP – KHAI THÁC TIỀM NĂNG HOẠT TÍNH VÀ MỐI QUAN HỆ

PROBIOTIC CỦA SỮA MẸ VÀ PHÂN TRẺ BÚ SỮA MẸ

Nguồn: Evaluation of Potential Probiotics Isolated from Human Milk and

Colostrum, Quésia S. Damaceno1 & Jaqueline P. Souza1 & Jacques R. Nicoli2 & Raquel
L. Paula3 & Gabriela B. Assis 4 & Henrique C. Figueiredo4 & Vasco Azevedo5 &
Flaviano S. Martins1,2,6
Đánh giá các loại men vi sinh tiềm năng được phân lập từ sữa mẹ và sữa non
Tóm tắt: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được sự đa dạng của nhiều loài vi khuẩn trong
sữa mẹ, ngay cả trong mẫu thu thập vô trùng. Nghiên cứu hiện nay đánh giá các vi khuẩn
probiotic tiềm năng được phân lập từ sữa mẹ và các yếu tố liên quan. Mẫu sữa được thu
thập từ 47 phụ nữ khỏe mạnh và nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc và phổ quát
(universal agar) trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Các chủng vi khuẩn được đếm và
được định danh bằng phương pháp Biotyper Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionization–Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) và sau đó thử nghiệm
các đặc tính của probiotic. Tổng số vi khuẩn trong sữa mẹ dao động từ 1,5 đến 4,0 log 10
CFU / mL. Số lượng vi khuẩn cao hơn được tìm thấy trong sữa non (mean = 3.9 log 10
CFU / mL, 95% CI 3.14 -4.22, p = 0,00001). Loài phong phú nhất là Staphylococcus
epidermidis (n = 76). Probiotic tiềm năng là Lactobacillus gasseri (n = 4),
Bifidobacterium breve (n = 1) và Streptococcus salivarius (n = 4). Mặc dù cỡ mẫu nhỏ, L.
gasseri chỉ được phân lập trong sữa mẹ từ các bà mẹ có cân nặng bình thường (a normal
weight range) (18.5-24.9) theo chỉ số BMI (Body mass index) và sau khi sinh thường (a
vaginally delivered partum). Không có probiotic tiềm năng nào cho thấy sự đối kháng
chống lại mầm bệnh, nhưng tất cả chúng đều bị ngưng kết (agglutinate) với các mầm
bệnh khác nhau. Chín vi khuẩn phân lập được thuộc loài L. gasseri, B. breve và S.
salivarius đã được chọn như những probiotic tiềm năng. Nghiên cứu hiện tại xác nhận sự
hiện diện trong sữa mẹ của một hệ vi sinh vật có thể là nguồn probiotic tiềm năng được sử
dụng trong công thức sữa mẹ mô phỏng
Giới thiệu
 Theo “Chính sách toàn cầu về nuôi dưỡng cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ” (Global
Strategy for Infant and Young Child Feeding) từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho con
bú là cách tốt nhất để cung cấp dinh dưỡng lý tưởng cho sức khỏe trẻ sơ sinh. Điều này là
do thành phần phi sinh học của sữa mẹ cấu thành mức cân bằng của tất cả các chất dinh
dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, cũng như các chất bảo vệ như dưới dạng
immunoglobulin (Các globulin miễn dịch (Ig) là các kháng thể, có bản chất là
glycoprotein, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào tổng hợp khi cơ thể bị phơi
nhiễm với các kháng nguyên, có vai trò giúp hệ thống miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa
các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus.), lactoferrin (là một loại glycoprotein,
là kháng thể có trong sữa mẹ, giúp trẻ tăng cường hệ miễn dịch, có nồng độ cao nhất
trong sữa non) và lysozyme.
Theo truyền thống, sữa mẹ được cho là một chất lỏng vô trùng, nhưng những phát
hiện gần đây đã phát hiện ra sự hiện diện của các thành phần sinh học trong sữa mẹ,
chẳng hạn như vi khuẩn, bao gồm cả chi có khả năng bảo vệ như Bifidobacterium. Điều
thú vị là vi khuẩn có trong sữa mẹ với mật độ đủ cho phép sự xâm chiếm lên ruột trẻ sơ
sinh sau khi bú, nhưng không gây ra phản ứng viêm trong tuyến vú. Ngoài ra, sữa mẹ có
chứa yếu tố tăng trưởng của bifidobacteria, còn gọi là Bifidus, được cấu thành từ nhiều
loại oligosacarit nồng độ khá cao (14 đến 20 g / L). Theo cách này, sữa mẹ có thể được
coi là một hệ cộng sinh tự nhiên có chứa cả hai probiotic (Bifidobacterium) và prebiotic
(human milk oligosacarit: HMO). Vì lý do này, nuôi con bằng sữa mẹ đem lại dinh
dưỡng, miễn dịch và vi sinh cần thiết cho sức khỏe trẻ sơ sinh. Không may, việc cho con
bú không phải lúc nào cũng có thể, và cần phải phát triển một công thức mới cho các sản
phẩm thay thế, mô phỏng sữa người theo cách tốt nhất có thể.
Hầu hết các vi sinh vật phổ biến nhất được tìm thấy tự nhiên trong sữa mẹ có quan
hệ hội sinh (commensal) và một số trong chúng có thể là probiotic tiềm năng được sử
dụng trong công thức giống như sữa mẹ. Trong số các probiotic tiềm năng này, chi
Lactobacillus và Bifidobacterium thường được phân lập từ sữa người. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi điều tra một số đặc điểm mong muốn ở các vi khuẩn probiotic được phân
lập từ sữa mẹ, cũng như một số thống số có liên quan đến người mẹ (associated maternal
variables)
Vật liệu và phương pháp
Thiết kế
Các mẫu sữa mẹ và sữa non được thu thập từ 47 phụ nữ khỏe mạnh từ tháng 10 / 2014
đến tháng 5 / 2015. Các tình nguyện viên được tuyển dụng từ một bệnh viện công ở Belo
Horizonte, Brazil, và một sự đồng ý bằng văn bản đã được lấy từ mỗi cá nhân. Tất cả các
thủ tục đã được thực hiện sau khi được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức (CAAE-
31473714.0.0000.5149).
Lấy mẫu sữa mẹ
Các mẫu được thu thập tại các điểm ba lần: (1) 30 phút sau sinh (post-partum) (trước khi
bú), (2) 5-9 ngày sau sinh, và (3) 25-30 ngày sau sinh. Trước khi thu thập mẫu, bầu vú
được làm sạch bằng chất sát trùng Hand EX HC (chlorhexidine gluconate, 2.0%, São
Paulo, Brazil). Các thông số sau đã được đánh giá: loại sinh sản (sinh thường hoặc sinh
mổ), chỉ số khối cơ thể bà mẹ - BMI (thấp, bình thường, hoặc thừa cân), sự biến đổi da vú
(dị ứng và viêm da), sử dụng thuốc kháng khuẩn, tuổi và số lần mang thai trước đó.
Định lượng và phân lập vi khuẩn từ sữa mẹ
Tất cả các mẫu được thu thập trong ống vô trùng và được lưu trữ trên đá lạnh cho đến khi
được xử lý. Để liệt kê và phân lập vi khuẩn kỵ khí, các mẫu được nuôi cấy trên môi
trường thạch máu, Bacteroides Bile Esculin agar (BBE, Difco, Sparks, Hoa Kỳ) và de
Man, Rogosa và Sharpe Agar (MRS, Merck, Darmstadt, Đức) được làm giàu với 0,5 g / L
cystein và được ủ ở 37 ° C cho đến 7 ngày trong buồng yếm khí (Forma Scientific
Company, Marietta, USA) khí quyển chứa 85% N 2, 10% H2 và 5% CO2. Để liệt kê và
phân lập vi khuẩn yếm khí tùy ý (facultative anaerobe), mẫu được nuôi cấy trên môi
trường thạch máu, Brain heart infusion agar (BHI, Difco) được làm giàu với sodium azide
(0,2 g / L), MacConkey agar (Difco) và hypertonic salt mannitol agar (Difco). Các đĩa
thạch được ủ ở 37 ° C khoảng 24 đến 48 h trong điều kiện hiếu khí. Số lượng vi khuẩn
được biểu thị bằng log10 của các đơn vị khuẩn lạc (CFU) trên mỗi mililit sữa hoặc sữa
non.
Định danh vi khuẩn
Sau khi định lượng, các khuẩn lạc với các hình thái khác nhau được phân lập và xác định
không khí tăng trưởng (đối với các chủng được nuôi cấy trong điều kiện yếm khí), xét
nghiệm catalase và nhuộm Gram. Phân lập giả định của Bifidobacterium được xác nhận
bởi xét nghiệm fructose-6-phosphato phosphoketolase (F6PPK) như đã mô tả trước đây.
Tất cả các chủng đều phải trải qua phương pháp chiết xuất protein và định danh bằng
MALDI-TOF MS. Mỗi mẫu, thêm vào 1 μL axit formic (70%) lên trên các vệt tương ứng
và để khô. Sau đó, mỗi vệt được phủ 1 μL dung dịch α-CHCA matrix và để khô tự nhiên.
Phân tích xử lý với Maldi Biotyper (hệ thống máy định danh) (Bruker Daltonics, Đức /
Hoa Kỳ). Các chủng tham chiếu được sử dụng là Escherichia coli DH5 alpha. Định danh
đến mức loài, điểm ngưỡng (cutoff score) quang phổ được sử dụng 2.0 cho quang phổ
phù hợp nhất từ cơ sở dữ liệu tham chiếu. Phương pháp này đã được công nhận là một sự
thay thế nhanh chóng và chính xác để định danh vi khuẩn trong phòng thí nghiệm vi sinh
lâm sàng
Sàng lọc các thuộc tính Probiotic
Sự đối kháng chống lại mầm bệnh
Thử nghiệm đối kháng in vitro được thực hiện bằng Phương pháp khuếch tán hai lớp
thạch (the agar double-layer diffusion method). Các đốm vi khuẩn được cấy vào bề mặt
thạch MRS trong đĩa Petri và được ủ ở 37 ° C trong 24-48 h. Sau khi ủ, các tế bào đã bị
giết bởi việc tiếp xúc với chloroform trong 30 phút và chloroform dư bay hơi thêm 30
phút nữa. Các các tấm được phủ bằng 3,5 ml BHI (Difco) thạch mềm (soft agar) (0,75%)
được cấy với 106 CFU / mL vi khuẩn chỉ thị và ủ ở 37 ° C trong 24-48 h. Các tấm sau đó
kiểm tra sự hiện diện của vòng ức chế xung quanh điểm. Các chủng chỉ thị là
Staphylococcus aureus ATCC 29313, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, E. coli
EIEC ATCC 25922, Salmonella enterica subsp. serphar Typhimurium ATCC 14028 và
Shigella flexneri ATCC 12022.
Kiểm tra khả năng kết tụ (Agglutination Test)
Khả năng chủng vi khuẩn kết tụ với các chủng chỉ thị được đánh giá bởi Pérez-Sotelo et
al. với một số sửa đổi. Tóm tắt như sau, 1 mL dịch nuôi cấy vi khuẩn được thử nghiệm
(107 CFU / mL) trộn với 500 μL các chủng chỉ thị (10 9 CFU / mL) trong ống ly tâm. Các
chủng chỉ thị cũng được thử nghiệm trong khảo nghiệm đối kháng (antagonism assay).
Sau 15 phút, 1h, 3h, một mẫu được lấy từ mỗi thử nghiệm cho thấy sự ngưng kết vĩ mô để
đánh giá khoảng thời gian tối thiểu mà mỗi mẫu yêu cầu để ngưng kết một mầm bệnh cụ
thể. Các mẫu được nhuộm Gram và đánh giá bằng kính hiển vi quang học. Kết quả được
biểu diễn theo thời gian cần thiết cho quá trình ngưng kết bằng các mã sau: + (ngưng kết
tối đa 15 phút), ++ (ngưng kết tối đa 1 h) và +++ (ngưng kết tối đa 3 h).
Kháng sinh
Tính mẫn cảm với thuốc kháng khuẩn của tất cả các chủng được đánh giá bằng thử
nghiệm khuếch tán đĩa (disk diffusion test) (phương pháp Bauer-Kirby), đối với các loại
kháng sinh sau: penicillin G, cefoxitin, vancomycin, gentamicin, ampicillin, tetracycline,
erythromycin, clindamycin, ciprofloxacin, chloramphenicol, và amoxicillin / clavulanic
acid. Việc đình chỉ từng mẫu (mật độ cấy tương đương 0,5 McFarland tiêu chuẩn) được
tạo vệt bằng cách sử dụng gạc trên bề mặt thạch MRS. Sau đó, mỗi đĩa kháng sinh được
đổ lên trên bề mặt thạch, và các tấm được ủ ở 37 ° C trong 48 giờ trong điều kiện vi hiếu
khí hoặc kỵ khí. Các các tấm sau đó đã được kiểm tra sự hiện diện vòng ức chế xung
quanh đĩa. Mỗi vòng sáng được đo bằng pachymeter và cho kết quả là các giá trị tuyệt đối
(tính bằng mm). Sự vắng mặt của vòng sáng được xem là kháng thuốc đối kháng sinh đã
cho.
Tính mẫn cảm của các chủng phân lập với muối mật
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với muối mật của các chủng được thực hiện
như mô tả bởi Noriega et al. với một số sửa đổi. Dịch nuôi cấy mỗi chủng vi khuẩn được
nhỏ trên môi trường thạch MRS bổ sung oxgall (Difco) nồng độ tăng dần (0.05, 0.1, 0.2,
0.4, 0.8, 1.0 và 2.0%). Các các đĩa được ủ ở 37 ° C trong 72 giờ trong điều kiện yếm khí
hoặc vi hiếu khí. Kết quả được đánh giá theo sự tăng trưởng của từng điểm được thử
nghiệm ở một nồng độ oxgall nhất định. MIC được định nghĩa là nồng độ oxgall thấp nhất
dẫn đến sự không tăng trưởng (growth absence).
Xét nghiệm thoái hóa mucin
Xét nghiệm phân hủy mucin được thực hiện trong đĩa Petri như mô tả trước đây. Môi
trường Luria-Bertani (LB) là bổ sung một phần hog gastric mucin (HGM, loại III, lô
SLBL7748V, Sigma, St. Louis, Hoa Kỳ) ở nồng độ 0,5%, agarose (Sigma, loại I-A) 1,5%
(w / v) và L-cystein (0,5 g / L). Mười microliter dịch nuôi cấy vi khuẩn được cấy trên bề
mặt thạch LB, ủ trong điều kiện yếm khí, ở 37 ° C trong 72 giờ. Sau đó, các tấm được
nhuộm bằng 0,1% Amido Black (Sigma) trong acid acetic 3,5 M trong 30 phút và được
rửa bằng acid acetic 1,2 M cho đến khi vòng đổi màu (vùng ly giải mucin) xuất hiện xung
quanh khuẩn lạc. S. Typhimurium ATCC 14028 được sử dụng làm đối chứng dương.
Mô phỏng dịch dạ dày
Các điều kiện môi trường dạ dày được mô phỏng bằng cách ủ vi khuẩn 1 giờ trong nước
muối vô trùng (0,5% w / v) bổ sung pepsin (INLAB, São Paulo, Brazil) (3 g / L) ở pH 2.0
và đếm trên môi trường thạch MRS như được mô tả trước đây bởi Charteris et al..
Xét nghiệm dung nạp oxy (Oxygen Tolerance Assay)
Đối với Bifidobacterium breve, xét nghiệm dung nạp oxy được thực hiện như mô tả trước
đây. Các đốm của B. breve trên bề mặt thạch MRS có bổ sung cystein (0,5 g / L), sau khi
tăng trưởng trong điều kiện yếm khí trong 48 giờ, được tiếp xúc với oxy trong khí quyển
lên đến 72 giờ khi làm lạnh (4 ° C). Đối chứng của từng đốm được duy trì trong buồng kỵ
khí. Đối với sự tiếp xúc với oxy, đánh giá bốn khoảng (8, 24, 48 và 72 h) trong đó một
đốm được ủ trong môi trường MRS trong điều kiện yếm khí ở 37 ° C, cho 48 h. Tăng
trưởng trong điều kiện kỵ khí được xem xét cho khả năng chịu oxy theo các khoảng thời
gian được đánh giá. Sự tăng trưởng được đánh giá bởi sự xuất hiện độ đục của nước dùng
và sự lắng đọng vi khuẩn trong ống tube.
Phân tích thống kê
Thống kê mô tả được đánh giá theo log 10. Thử nghiệm ANOVA được sử dụng để đánh giá
các biến liên quan đến phương sai số lượng vi khuẩn log10. Thử nghiệm KruskalWallis
được sử dụng để so sánh các mẫu không phân phối bình thường. Tất cả các thử nghiệm
được thực hiện bằng phần mềm STATA 14.0 (StataCorp LP, Texas, Hoa Kỳ). Kết quả
được coi là khác nhau đáng kể với p <0,05
Kết quả
Các mẫu sữa mẹ được thu thập từ tổng số 47 phụ nữ khỏe mạnh (27 bà mẹ sinh thường và
20 bà mẹ sinh mổ). Tuổi trung bình là 25 ± 5,9 năm và BMI trung bình là 26 kg / m2. Hai
bà mẹ bị viêm vú khi tiết sữa và ba người dùng kháng sinh để điều trị nhiễm trùng tiết
niệu khi mang thai.
Tổng số vi khuẩn trung bình trong sữa mẹ dao động từ khoảng 1,5 đến 4,0 log 10 CFU /
mL. Số lượng cao hơn trong sữa non (mean = 3.9 log 10 CFU / mL; 95% CI 3,57-4,22; p =
0,00001) so với sữa thu được 1 tháng sau khi sinh. Đối với sự tăng trưởng trên môi trường
chọn lọc, các nhóm phổ biến nhất là vi khuẩn lactic (MRS agar), Staphylococcus
(hypertonic mannitol agar) và Streptococcus (BHI agar bổ sung sodium azide) (Hình 1).
Không có sự tăng trưởng trên MacConkey và BBE agar. Tương tự, đối với vi khuẩn tổng
số, mật số của các nhóm vi khuẩn cụ thể này cao hơn trong sữa non (khoảng 3.0, 2.0 và
1.0 log10 CFU / mL) so với điểm thứ hai và điểm thứ ba của mẫu thu thập (p = 0,0026).
Sự khác biệt và khoảng tin cậy cho mỗi nhóm trong một điểm nhất định của mẫu thu thập
được hiển thị trong Bảng 1.
Tổng cộng 160 vi khuẩn được phân lập từ môi trường thạch MRS đã được định danh bằng
MALDI-TOF MS, cho thấy ưu thế của Staphylococcus cholermidis (n = 76). Các loài
khác được phân lập là Staphylococcus lugdunensis (n = 7), Lactobacillus gasseri (n = 4),
Streptococcus salivarius (n = 4), Staphylococcus caprae (n = 3), Corynebacterium
tuberculostearicum (n = 3), S. aureus (n = 2), Staphylococcus hominis (n = 2), ,
Streptococcus mitis (n = 2), Corynebacterium kroppenstedtii (n = 2), Staphylococcus
sacarolyticus (n = 1), Staphylococcus capitis (n = 1), Actinomyces neuii (n = 1),
Streptococcus parasanguinis (n = 1), Streptococcus agalactiae (n = 1) và B. breve (n = 1).
Việc định danh không thu được 49 chủng. Một số chủng không được phục hồi sau khi rã
đông.
Các thông số của người mẹ quan sát cho từng loài vi khuẩn được phân lập từ sữa và sữa
non được thể hiện trong Bảng 2. Trong số các vi khuẩn được phân lập, có ba loài được
chọn là các ứng cử viên probiotic: L. gasseri, S. salivarius, và B. breve. Một mẫu nhỏ của
L. gasseri (n = 4) đã được phân lập từ mẫu sữa mẹ của phụ nữ có BMI bình thường và
sinh thường, 6-9 và 30 ngày sau sinh. Các chủng S. salivarius (n = 4) được thu hồi từ sữa
của những phụ nữ đã sinh mổ, 6 đến 9 ngày sau sinh. Phân lập B. breve (n = 1) được tìm
thấy trong sữa của phụ nữ có BMI bình thường, sinh thường và 30 ngày sau sinh (Bảng
2). Về thuộc tính sinh học, các chủng của L. gasseri, S. salivarius, và B. breve không cho
thấy hoạt tính đối kháng, nhưng tất cả chủng phân lập đều ngưng kết mầm bệnh như trong
B ảng 3.
Tất cả các chủng phân lập đều mẫn cảm với kháng sinh beta-lactam và vancomycin (Bảng
4). Tất cả các chủng của L. gasseri, S. salivarius và B. breve kháng với oxgall ở mức
2,0%;
không có sự phát triển của vi khuẩn trong thử nghiệm ở nồng độ tối đa cho tất cả các mẫu.
B. breve cho thấy sự dung nạp đối với oxy trong 72 giờ (dữ liệu không được hiển thị).
Không có sự khác biệt khi quan sát trực quan về độ đục của nước dùng và sự lắng đọng
mẫu so sánh qua thời gian tiếp xúc với oxy (8, 24, 48 và 72 h). Sau khi tiếp xúc với môi
trường dạ dày mô phỏng, 36.6% tế bào vẫn tồn tại với B. breve và một phạm vi từ 42,6
đến 71,9% tế bào vẫn tồn tại đối với mẫu là L. gasseri (Bảng 5).
Các chủng S. salivarius không sống sót trong mô phỏng có stress của môi trường dạ dày.
Không có vi khuẩn phân lập phân giải mucin. Không có vùng ly giải mucin xuất hiện
xung quanh khuẩn lạc của từng mẫu thử nghiệm của probiotic giả định (Bảng 5)
Thảo luận
Sữa mẹ là thực phẩm phù hợp nhất cho trẻ sơ sinh bởi các hợp chất dinh dưỡng hoàn
chỉnh với sự phát triển của một hệ vi sinh vật khỏe mạnh. Sự phát triển của hệ vi sinh vật
được dẫn dắt bởi một số hợp chất sữa quan trọng như glycans (HMO tự do, glycolipids và
glycoprotein). Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides và Bifidobacterium cần thiết
cho quá trình chuyển hóa của HMO. Sữa mẹ là nguồn dinh dưỡng độc quyền cho trẻ sơ
sinh trong 6 tháng đầu đời cung cấp dinh dưỡng cân bằng và các kích thích cần thiết để
cân bằng nội môi đường tiêu hóa (GI).
Nhiều nghiên cứu nêu bật ưu thế của Bifidobacterium trong ruột của trẻ sơ sinh. Các
nghiên cứu phân tích metagenomic đã cung cấp những hiểu biết quan trọng về các cộng
đồng vi sinh vật liên quan tới sự hoàn thiện của ruột. Trên thực tế, hệ vi sinh vật đường
ruột của trẻ bú mẹ có thành phần chủ yếu là bifidobacteria, đặc biệt là loài
Bifidobacterium longum subsp. longum, B. longum subsp. infantis và B. breve.
Trong nghiên cứu này, tổng số cũng như số vi khuẩn cụ thể cao hơn trong sữa non và
giảm trong sữa mẹ chỉ 6 đến 9 ngày sau sinh. Điều này tương tự như kết quả được mô tả
bởi Solís et al. với log 10 CFU / mL giảm từ 5.0 (ngày 1 sau sinh) xuống còn 3.7 (90 ngày
sau sinh). Dường như mật số này chỉ đủ để xâm nhập vào đường ruột của trẻ sơ sinh
nhưng không đủ để kích thích phản ứng viêm của tuyến vú
Nguồn: Characterization and probiotic properties of Lactobacilli from human breast
milk. Chanettee Jamyuang1 · Phanphen Phoonlapdacha2 · Nalinee Chongviriyaphan2 ·
Wasaporn Chanput3 · Sunee Nitisinprasert1 · Massalin Nakphaichit
Tóm tắt
Một số nghiên cứu đã báo cáo một cộng đồng vi sinh vật phức tạp trong sữa mẹ. Cộng
đồng này ảnh hưởng đến hình dạng của hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ sơ sinh và do đó
ảnh hưởng đến sức khỏe của vật chủ. Lactobacillus là một lợi khuẩn quan trọng và có
nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm chức năng. Nghiên cứu này đã phân lập và đánh
giá các vi khuẩn probiotic tiềm năng từ sữa mẹ. Hai loài Lactobacillus, L. plantarum và
L. pentosus, được phân lập từ sữa mẹ của phụ nữ Thái Lan. L. pentosus HM04-22, L.
pentosus HM04-3, L. plantarum HM04-80, L. plantarum HM04-88 và L. plantarum
HM01-1 cho thấy hoạt tính bám dính tốt (> 55%) và sức đề kháng trong dạ dày (pH 2 ) và
điều kiện mật (pH 8). Đặc điểm của các probiotic chỉ ra rằng tất cả các chủng
Lactobacillus phân lập được đều có đặc tính chống bám dính đối với Escherichia coli và
Salmonella Typhimurium. Lactobacillus phân lập các tế bào Caco-2 được bảo vệ khỏi sự
bám dính của mầm bệnh ở 25–40%. Ngoài ra, năm chủng được chọn có đặc tính chống
viêm bằng cách giảm biểu hiện interleukin (IL) -8 ở mức 0,14 ± 0,16 đến 0,52 ± 0,117
lần. Tuy nhiên, các chủng không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen tiếp giáp chặt
chẽ, bao gồm zona occludens (ZO) -1, occludin và claudin-1. Kết luận, 5 chủng
Lactobacillus được chọn lọc từ sữa mẹ là những ứng cử viên để sử dụng làm men vi sinh
để tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, cần phải thực hiện thêm nhiều thử nghiệm trên mô
hình động vật và thử nghiệm lâm sàng.
Giới thiệu
Sữa mẹ chứa một cộng đồng vi khuẩn phức tạp, tác động đến việc hình thành hệ vi sinh
vật đường ruột của trẻ sơ sinh. Sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột trong giai đoạn
đầu đóng một vai trò trong việc hình thành hàng rào đường ruột và trưởng thành hệ thống
miễn dịch. Sự gián đoạn của các quá trình sinh học có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con
người sau này trong cuộc sống. Firmicutes và Proteobacteria được tìm thấy là phyla
chiếm ưu thế trong sữa mẹ. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật trong sữa rất đa dạng và phụ thuộc
vào các yếu tố và hành vi của người mẹ như việc cho con bú và các thành phần khác của
sữa.
Probiotics là những vi khuẩn có lợi ảnh hưởng đến sức khỏe của vật chủ. Hầu hết các loài
probiotic đều thuộc nhóm vi khuẩn axit lactic. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng vi
khuẩn axit lactic như Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, Enterococcus
và Lactobacillus và các thành viên của Propionibacterium và Bifidobacterium đã được
phân lập và đặc trưng từ sữa mẹ (Martín et al. 2003; Rajokaa et al. 2017). Lactobacillus
gasseri, Bifidobacterium breve và Streptococcus salivarius được phân lập từ sữa mẹ cho
thấy các đặc tính lợi khuẩn tiềm năng để ngưng kết với mầm bệnh (Damaceno và cộng sự
2017). Việc phân lập được Lactobacillus crispatus và Lactobacillus gasseri từ sữa mẹ chỉ
ra rằng vi khuẩn có thể biểu hiện khả năng chống lại các tình trạng đường tiêu hóa và bám
dính tốt trên các dòng tế bào ruột. Hơn nữa, Lactobacillus gasseri và Enterococcus
faecalis thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bằng cách tạo ra bacteriocin (Kozak và cộng sự
2015). So với các loài khác, Lactobacillus và Bifidobacterium được sử dụng rộng rãi nhất
trong ngành thực phẩm và đồ uống (Fenster và cộng sự 2019; Terpou và cộng sự 2019).
Khả năng bám dính của men vi sinh là một yếu tố quan trọng góp phần tạo ra các tác dụng
có lợi lâu dài trên vật chủ. Probiotics có thể được khu trú trên cả niêm mạc ruột và tế bào
biểu mô. Probiotics có thể điều chỉnh sinh lý bệnh đường ruột bằng cách tăng cường chức
năng hàng rào biểu mô (Anderson et al. 2010; Jose et al. 2015). Các mối nối chặt chẽ (TJs
- Tight junctions) được hình thành bởi các chất dimer protein kéo dài không gian giữa các
màng tế bào liền kề. Các protein mảng bám TJ chính bao gồm zonula occludens (ZO) -1,
occludin và claudin. Những protein này tạo thành cấu trúc chính và điều chỉnh một số
chức năng của TJ (Mccall et al. 2009). Lactobacillus amylophilus D14 đã được chứng
minh là cải thiện tính thấm ruột do Escherichia coli (ETEC) và Salmonella Typhimurium
gây ra (Yu et al. 2012). Lactobacillus plantarum có thể bảo vệ các điểm nối tế bào và
hàng rào niêm mạc bị tổn thương do nhiễm mầm bệnh (Karczewski và cộng sự 2010;
Potoćnjak và cộng sự 2017).
Probiotics có thể giúp duy trì và khôi phục sự cân bằng của hệ thống miễn dịch đường
ruột. Tế bào biểu mô ruột tiết ra chemokine thu hút bạch cầu trung tính mạnh như
interleukin (IL) -8 trong quá trình lây nhiễm gây bệnh. Mặc dù IL-8 nhằm mục đích
chống lại và loại bỏ mầm bệnh, nhưng quá trình sản xuất dai dẳng của nó có thể làm hỏng
các tế bào biểu mô. Viêm loét đại tràng và bệnh Crohn là những bệnh ví dụ liên quan đến
sự tổng hợp dai dẳng của IL-8. Bifidobacterium Infantis W52, Lactobacillus casei W56 và
Lactococcus lactis W58 ức chế đáng kể sự tổng hợp IL-8 của tế bào Caco-2 khi
Salmonella được đồng ủ (Malago et al. 2009).
Do đó, mục đích của nghiên cứu này là (i) phân lập và sàng lọc Lactobacillus spp. từ sữa
mẹ; (ii) xác định các đặc tính lợi khuẩn của Lactobacillus spp. bao gồm khả năng chống
lại axit và muối mật, và khả năng bám dính với cả chất nhầy và tế bào Caco-2 như một
mô hình của tế bào biểu mô; (iii) kiểm tra tác động của các chủng Lactobacillus đối với sự
bám dính của mầm bệnh đường ruột; và (iv) kiểm tra khả năng của các chủng
Lactobacillus trong việc tăng cường các chức năng của hàng rào biểu mô và điều chỉnh
miễn dịch.
Nguyên liệu và phương pháp
Phân lập Lactobacillus từ sữa mẹ
Các mẫu sữa được thu thập từ 5 phụ nữ khỏe mạnh tại Bệnh viện Ramathibodi, Thái Lan,
những người đang trong giai đoạn cho con bú từ 2–6 tháng sau khi sinh. Tất cả các quy
trình liên quan đến đối tượng là con người đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của
Bệnh viện Ramathibodi, Thái Lan (số tham chiếu: ID1058-16). Làm sạch quầng vú và
núm vú bằng nước vô trùng. Các mẫu được thu thập trong một ống vô trùng có chứa canh
trường Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Difco ™, Pháp) kết hợp với 0,05% l-cysteine
(Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ).
Mẫu sữa được giữ trong hộp kỵ khí trên đá trong quá trình vận chuyển. Để phân lập, các
mẫu sữa được pha loãng với nước muối thường (0,85% NaCl) và được nuôi cấy trên
thạch MRS chứa 0,05% l-cysteine và CaCO3 trong 24-48 giờ ở 37 ° C trong một buồng
kỵ khí.
Các dòng vi khuẩn phân lập được lựa chọn dựa trên sự khác biệt về hình thái, bao gồm
kích thước, màu sắc và sản xuất axit. Các chủng đã chọn được bảo quản trong môi trường
MRS (Difco ™, Pháp) chứa 20% (v / v) glycerol ở - 20 ° C. Trước khi thử nghiệm hoạt
tính, các dòng phân lập được hoạt hoá hai lần trong môi trường MRS ở 37 ° C trong 24-48
giờ trong một buồng kỵ khí.
Định danh các chủng vi khuẩn phân lập
Các chủng phân lập được chọn được quan sát bằng kính hiển vi quang học để xác định
hình thái và kết quả nhuộm Gram. Tất cả các chủng vi khuẩn Gram dương có hình que
đều được định danh ở cấp độ chi (genus) bằng phân tích khối phổ MALDI – TOF. Một
khuẩn lạc của tế bào vi khuẩn được trải lên một tấm neo bằng thép MALDI – TOF – MS
(tấm BigAnchor 96 giếng; Bruker Daltonics, Đức). Thêm 1µ axit fomic 70% (Sigma-
Aldrich, Hoa Kỳ) được vào đĩa giếng, sau đó là dung dịch nền (4-hydroxy - axit
cyanocinnamic (HCCA), Bruker Daltonics, Đức). Tấm được làm khô ở nhiệt độ phòng.
Một tiêu chuẩn kiểm tra vi khuẩn (Bacterial test standard) (BTS; Bruker Daltonics) đã
được sử dụng để hiệu chuẩn khối phổ kế MicroFlexLT Bruker Daltonics. Kết quả được
biểu thị dưới dạng giá trị log score cho thấy sự giống nhau của mẫu không xác định và
các cấu hình được so sánh bằng phần mềm MALDI BioTyper 3.0 (phiên bản 3.3.1.0).
Điểm số (score) cắt bỏ là ≥ 2,00 và 1,700–1,900 đối với các cấp loài và chi, tương ứng.
Thử nghiệm độ bám dính Mucin
Thử nghiệm độ bám dính được thực hiện theo phương pháp sửa đổi của Sánchez et al.
(2010). Một trăm microlit của dung dịch mucin dạ dày lợn loại III (Sigma, Hoa Kỳ) tinh
khiết trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (10 mg / ml) được cố định trên đĩa vi
phân polystyrene khử trùng 96 giếng (F96 Maxisorp Immunoplate; Nunc, Đan Mạch) ở 4
° C trong 18 giờ. Các giếng được rửa hai lần với 200 µl PBS và ủ với 20 g / l albumin
huyết thanh bò (BSA) (Sigma-Aldrich) ở 4 ° C trong 2 giờ. Để loại bỏ BSA không liên
kết, các giếng đã được rửa hai lần với 200 µl PBS. Sau đó, 100 µl huyền phù tế bào vi
khuẩn 109 CFU / ml được thêm vào và ủ ở 37 ° C trong 1 giờ trước khi 200 µl PBS được
sử dụng để loại bỏ vi khuẩn không liên kết khỏi giếng sau khi ủ bằng cách rửa năm lần.
Sau đó, 200 µl dung dịch Triton X-100 0,05% (v / v) (Sigma-Aldrich, Singapore) được
thêm vào và ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để loại bỏ các tế bào bám vào. Hỗn dịch tế
bào được trộn kỹ bằng micropipet và 100 µl huyền phù thu được được lấy mẫu và mạ để
thu được các đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililit hoặc CFU / ml (N Adhere) trên thạch
MRS. Các tế bào khả thi trước khi hấp thụ mucin (N Initial) và sau (NAdhere) đã được thống
kê. Phần trăm độ bám dính được tính theo công thức sau:

Thử nghiệm tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi tiếp xúc tuần tự với đường tiêu hóa mô
phỏng
Khả năng chịu đựng của các chủng phân lập đối với các tình trạng mô phỏng đường tiêu
hóa được xác định bằng phương pháp được mô tả bởi Ranadheera và cộng sự. (2012) với
những sửa đổi nhỏ. Dịch dạ dày mô phỏng được chuẩn bị bằng cách hòa tan 3 g / L pepsin
(P7000) trong NaCl 0,5% (w / v) đã lọc vô trùng, được điều chỉnh đến pH 2,0 bằng HCl 4
M. Dịch ruột non mô phỏng được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 g / L pancreatin USP
(P7545) trong dung dịch vô trùng của 0,5% NaCl với 0,45% muối mật, được điều chỉnh
đến pH 8,0 với NaOH 0,1 M vô trùng. Thử nghiệm tỷ lệ sống sót của tế bào được thực
hiện bằng cách thêm 1 ml huyền phù tế bào vi khuẩn 10 9 CFU / ml vào 9 ml dung dịch
dịch dạ dày mô phỏng trong 60 phút ở 37 ° C. Dung dịch dịch vị được loại bỏ bằng cách
ly tâm ở tốc độ 8000 vòng / phút trong 5 phút và sau đó được hoà tan lại trong 9 ml dịch
ruột non mô phỏng. Các mẫu tiếp tục được ủ trong 120 phút ở 37 ° C. Dịch ruột sau đó
được loại bỏ bằng ly tâm ở tốc độ 8000 vòng / phút trong 5 phút. Khối tế bào được hoà
tan trong dung dịch NaCl 0,85% (w / v) vô trùng. Các tế bào sống sót được đếm trên các
đĩa MRS. Các tế bào sống sót trước (N0) và sau (N1) phát triển trong đường tiêu hóa mô
phỏng được thống kê bằng phương trình của Uraipan và Hongpattarakere (2015) như sau:
Các đặc tính chống bám dính của Lactobacillus phân lập chống lại các mầm bệnh
trên tế bào Caco - 2
Sự ức chế bám dính của các chủng Lactobacillus phân lập chống lại E. coli O157: H7
DMST 12743 và S. Typhimurium ATCC 13311 trên tế bào CaCo-2 được khảo sát theo ba
thử nghiệm: (i) sự bảo vệ, (ii) bám dính cạnh tranh, và (iii) chuyển vị (Ren và cộng sự
2012).
Tế bào Caco-2 được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu Dulbecco’s Modified
Eagle's (DMEM) (HyClone, Hoa Kỳ) được bổ sung 10% (v / v) huyết thanh bào thai bò
(HyClone, Hoa Kỳ), 1% (v / v) axit amin không cần thiết ( HyClone, Hoa Kỳ) và 1% (v /
v) penicillin – streptomycin (10.000 IU / ml và 10.000 μg / ml) (Invitrogen, Hoa Kỳ),
tương ứng. Tế bào Caco-2 được nuôi cấy trong bình nuôi cấy ở 37 ° C trong môi trường
5% CO2 cho đến khi hợp lưu. Các tế bào được cấy xấp sỉ khoảng 10 5 tế bào trên mỗi
giếng vào các đĩa nuôi cấy mô 24 giếng trong 21 ngày sau hợp lưu.
Các chủng vi khuẩn lactobacillus phân lập từ môi trường nuôi cấy trong 18 giờ ở 37 ° C
trong môi trường MRS được thu hoạch, rửa hai lần bằng PBS và được tái hoà tan trong
DMEM không bổ sung để đạt được nồng độ 10 9 CFU / ml. E. coli O157: H7 DMST
12743 và S. Typhimurium ATCC 13311 được hoạt hoá trong môi trường dinh dưỡng (NB
- nutrient broth) ở 37 ° C trong 18 giờ. Tế bào vi khuẩn được thu hoạch, rửa sạch hai lần
bằng PBS và tái hoà tan trong DMEM không bổ sung để đạt được nồng độ 109 CFU / ml.
Trong thử nghiệm bảo vệ, các đơn lớp tế bào Caco-2 được cấy với 300 µl chủng
Lactobacillus (1 × 109 CFU / ml) hoà tan trong DMEM và ủ trong 30 phút ở 37 ° C trong
môi trường 5% CO2 và 95% không khí . Tổng cộng 300 µl mầm bệnh (10 9 CFU / ml) hoà
tan trong DMEM được thêm vào và ủ trong 30 phút ở 37 ° C trong môi trường có 5%
CO2 và 95% không khí.
Trong thử nghiệm cạnh tranh, đơn lớp tế bào Caco-2 được cấy với cả 300 µl chủng
Lactobacillus (1 × 109 CFU / ml) và 300 µl huyền phù mầm bệnh trong DMEM và ủ trong
1 giờ ở 37 ° C trong môi trường 5% CO2 và 95% không khí.
Trong thử nghiệm dịch chuyển, các tế bào đơn lớp Caco-2 được cấy 300 µl mầm bệnh (1
× 109 CFU / ml) hoà tan trong DMEM và được ủ trong 30 phút ở 37 ° C trong môi trường
5% CO2 và 95% không khí. Tổng cộng 300 µl các chủng Lactobacillus (1 × 10 9 CFU /
ml) hoà tan trong DMEM được thêm vào và ủ trong 30 phút ở 37 ° C trong môi trường
5% CO2 và 95% không khí.
Các tế bào không kết dính được loại bỏ bằng cách rửa 4 lần với PBS vô trùng. Các tế bào
kết dính được ly giải với 0,1% Triton X-100 (Merck, Đức) trong 10 phút. Nồng độ của tế
bào vi khuẩn bám dính được đếm bằng cách đếm đĩa làm ba lần trên thạch xylose lysine
desoxycholate (XLD) đối với S. Typhimurium và thạch eosin-methylene blue agar (EMB)
đối với E. coli và sau đó được ủ ở 37 ° C trong 48 giờ. Khả năng ức chế sự bám dính của
các chủng vi khuẩn Lactobacillus được xác định bằng cách so sánh khả năng bám dính
của mầm bệnh khi có sự hiện diện của các chủng vi khuẩn Lactobacillus với khi chỉ có
mầm bệnh, được biểu thị bằng phần trăm.
Kiểm tra các đặc tính điều hòa miễn dịch
Nghiên cứu sự biểu hiện của các cytokine (IL-6 và IL-8) và các protein nối chặt (ZO-1,
claudin-1 và occlidin) của dòng tế bào Caco-2 có và không có tế bào vi khuẩn. Các đơn
lớp tế bào Caco-2 được nuôi cấy trên các đĩa 24 giếng như đã mô tả trước đây. Vi khuẩn
axit lactic hoặc mầm bệnh được pha loãng trong DMEM không bổ sung và ủ trên tế bào
Caco-2 trong 6 giờ ở 37 ° C trong môi trường 5% CO2 và 95% không khí.
RNA được tách chiết từ tế bào Caco-2 bằng thuốc thử Trizol (Thermo Fisher Scientific,
USA). RNA tổng số được tinh sạch bằng bộ kit phân lập RNA, RNase (Thermo Fisher
Scientific, Hoa Kỳ). CDNA được tổng hợp bằng Bộ kit tổng hợp cDNA Prime Script First
Strand (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ). Mức độ biểu hiện gen của hai cytokine (IL-6
và IL-8) và ba protein nối chặt (ZO-1, claudin-1 và occludin) từ tế bào Caco-2 được định
lượng bằng LightCycler® 480 real-time PCR (Roche, Nước Đức). Trình tự mồi được thể
hiện trong Bảng 1. Hỗn hợp phản ứng chứa 0,8 µl mồi xuôi (10 µg / µl), 0,8 µl mồi ngược
(10 µg / µl), 10 µl LightCycler® 480 SYBR Green Master (Roche, Đức) và 2 µl cDNA
(50 ng / µl) với thể tích được điều chỉnh thành 20 µl bằng nước DI (deinonized). Khuếch
đại real – time PCR được thực hiện trong các điều kiện sau: 45 chu kỳ ở 95 ° C trong 3
phút, 95 ° C trong 10 giây và 55 ° C trong 30 giây. Gen β-Actin được sử dụng như một
đối chứng nội bộ để bình thường hóa. Mỗi phản ứng được thực hiện như năm lần lặp lại.
 − ΔΔCt
Để định lượng tương đối các bản sao, công thức RQ = 2 được sử dụng trong phân
tích dữ liệu định lượng real – time PCR theo Livak và Schmittgen (2001).
Phân tích thống kê
Dữ liệu được phân tích bằng phân tích phương sai (ANOVA) với mức ý nghĩa p ≤ 0,05.
Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng SPSS phiên bản 15.0.
Các kết quả
Phân lập và xác định Lactobacillus spp. từ sữa mẹ
Tất cả các phân lập vi khuẩn Gram dương và sinh axit được chọn từ năm mẫu sữa mẹ.
Dưới kính hiển vi quang học, các chủng phân lập được có hình que và hình cầu khuẩn.
Tất cả các chủng hình que được xác định là Lactobacillus bởi MALDI – TOF – MS. Trên
toàn cầu, Lactobacillus được phân lập từ ba mẫu sữa (Hình 1). Các chủng phân lập này
thuộc về hai loài, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus pentosus. Các loài thường
xuyên được phân lập từ sữa mẹ là L. plantarum
Kiểm tra hoạt động bám dính và khả năng chịu đựng của đường ruột
Bốn mươi ba chủng phân lập Lactobacillus đã được sàng lọc các đặc tính bám dính. Dữ
liệu chỉ ra các hoạt động khác nhau về độ bám dính của mucin, như trong Hình 2. Tỷ lệ
phần trăm hoạt động bám dính của các chủng Lactobacillus thay đổi từ 46,12 ± 0,03 đến
64,51 ± 0,36%. Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) được sử dụng làm tiêu chí chủng
tham chiếu tiêu chuẩn với hoạt tính bám dính là 64,64 ± 0,68%. Từ bốn mươi ba dòng
phân lập, hoạt tính bám dính của 24 dòng phân lập là 55%, và 24 dòng phân lập này đã
được chọn. Chủng HM04-80 và HM04-88 cho thấy hoạt tính bám dính cao nhất lần lượt
là 64,51 ± 0,36% và 62,59 ± 0,30%.
Tỷ lệ sống sót của 24 chủng Lactobacillus được chọn được khảo sát trong đường tiêu hóa
mô phỏng. Kết quả cho thấy những dòng phân lập này có tỷ lệ sống từ 40 đến 63% (Hình
3). Ngoài ra, chủng tham chiếu, L. rhamnosus GG, cho thấy tỷ lệ sống là 54,86 ± 0,57%.
Các chủng Lactobacillus có tỷ lệ sống sót cao nhất đã được lựa chọn, bao gồm L.
plantarum HM04-80, L. plantarum HM04-88, L. pentosus HM04-22, L. pentosus HM04-
3 và L. plantarum HM01-1 (p ≤ 0,05).
Chống bám dính chống lại mầm bệnh trên tế bào Caco - 2
Các dòng Lactobacillus được chọn lọc có khả năng ức chế sự bám dính của E. coli và S.
Typhimurium trên tế bào Caco-2. Hoạt động ức chế cao nhất được quan sát thấy trong thử
nghiệm bảo vệ, sau đó là cạnh tranh và dịch chuyển (Hình 4).
Hoạt động ức chế của năm chủng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng.
Hoạt động ức chế của cơ chế bảo vệ, cạnh tranh và dịch chuyển của các chủng
Lactobacillus chống lại S. Typhimurium là 30,56 ± 2,22–40,26 ± 1,75%, 21,77 ± 1,52–
26,68 ± 4,72%
và 13,72 ± 1,75–19,18 ± 1,72%, tương ứng. Sự ức chế của các chủng phân lập
Lactobacillus đối với E. coli thấp hơn so với S. Typhimurium. Hoạt động ức chế của các
cơ chế bảo vệ, cạnh tranh và dịch chuyển chống lại E. coli là 20,43 ± 1,80–25,17%, 11.49
± 1.09–14.19 ± 1.40% and 0.20 ± 0.73–3.79 ± 4.00%, respectively
Đặc tính điều hòa miễn dịch
Mức độ biểu hiện của các protein nối chặt trong ruột của tế bào Caco-2 có và không có
chủng Lactobacilli đã được khảo sát (Hình 5). Kết quả chỉ ra rằng năm chủng không ảnh
hưởng đến sự biểu hiện ZO-1, occludin và claudin-1. Mặt khác, các vi khuẩn gây bệnh,
bao gồm cả E. coli và S. Typhimurium, làm giảm tất cả các biểu hiện của protein nối chặt
(p ≤ 0,05).
Sự kích thích của các cytokine gây viêm, bao gồm IL-6 và IL-8, của tế bào Caco-2 được
theo dõi bằng real – time PCR (Hình 6). Điều thú vị là năm chủng lactobacilli phân lập
cho thấy mức IL-8 giảm đáng kể ở mức 0,14 ± 0,16 đến 0,52 ± 0,117 lần, trong khi E. coli
và S. Typhimurium gây ra sự biểu hiện IL-8 khoảng 2-2,5 lần. Hoạt tính giảm của IL-8
không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa năm chủng (p ≤ 0,05). Tuy nhiên, sự biểu hiện của
IL-6 trong tế bào Caco-2 không được quan sát thấy ở bất kỳ chủng phân lập nào được thử
nghiệm.
Thảo luận
Sữa mẹ là thức ăn tốt nhất cho trẻ sơ sinh. Sữa chứa các cộng đồng vi khuẩn phức tạp ảnh
hưởng đến việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột của trẻ sơ sinh. Tuy nhiên, hệ vi sinh
vật trong sữa rất đa dạng và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố của mẹ và các thành phần của
sữa (Moosavi et al. 2019). Kết quả của chúng tôi cho thấy chỉ có ba mẫu sữa được phân
tích có chứa Lactobacillus. Chúng được xác định là L. plantarum và L. pentosus. Tương
tự, Sharma et al. (2017) đã xác định các chủng vi khuẩn lactobacilli trong sữa mẹ của phụ
nữ Ấn Độ bằng genus – specific PCR và giải trình tự dựa trên 16S - rRNA. Các chủng
này thuộc 5 loài: L. casei, L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum và L. pentosus.
Ngoài ra, Taghizadeh et al. (2017) báo cáo rằng 35 mẫu sữa mẹ của phụ nữ Iran có chứa
lactobacilli (87,5%) dựa trên các xét nghiệm kiểu hình. Tất cả các chủng đều được xác
nhận bằng phương pháp xác định kiểu gen (PCR) là L. plantarum. Hơn nữa, Dubos et al.
(2011) đã báo cáo sự đa dạng sinh học của Lactobacillus spp. từ 116 bà mẹ người Chile
ở mức 55,3% với hàm lượng Lactobacillus spp. ở 3,33 ± 0,55 log CFU / ml. Các loài chủ
yếu là L. plantarum (64%), L. fermentum (16%) và L. pentosus (9%). Jara và cộng sự.
(2011) phát hiện ra rằng hệ vi sinh vật của 48 mẫu sữa mẹ của phụ nữ Mexico bao gồm L.
acidophilus (52%), L. plantarum (7%), L. paracasei (30%), L. salivarius (7%) và L.
curvatus (4%). Các loài lactobacillus trong sữa mẹ khác nhau tùy thuộc vào quốc gia và
thói quen ăn uống, trong khi môi trường ảnh hưởng đến mật độ quần thể vi sinh vật.
Các loài L. plantarum và L. pentosus có liên quan chặt chẽ về mặt kiểu gen và có kiểu
hình rất giống nhau (Torriani et al. 2001). Tuy nhiên, các đặc tính probiotic xảy ra đặc
biệt ở cấp độ chủng. Hoạt động bám dính đường ruột là một trong những tiêu chí lựa chọn
chính cho các chủng probiotic. Khả năng bám dính rất quan trọng đối với sự xâm nhập
của probiotic (Blum et al. 2000). Hầu hết các vi khuẩn đường ruột bám dính và khu trú ở
lớp mucin (Sengupta và cộng sự 2013). Do đó, Lactobacillus phân lập từ sữa mẹ đã được
kiểm tra hoạt tính bám dính trên mucin so với một chủng thương mại, L. rhamnosus GG.
Chỉ có 21% tổng số chủng Lactobacillus phân lập có hoạt tính bám dính tương tự như
chủng thương mại. Khả năng bám dính của vi khuẩn phụ thuộc vào các cơ chế đặc trưng
của chủng liên quan đến các thành phần bề mặt tế bào vi khuẩn, chẳng hạn như chất kết
dính, polysaccharid và protein (Khalili và Ahmad 2015).
Khả năng chịu đựng stress đường tiêu hóa là chìa khóa để đảm bảo hoạt động của
probiotic.
Một số lượng lớn probiotics khả thi phải đến được ruột với số lượng thích hợp để tạo ra
tác dụng có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng (Angelis và Gobbetti 2004). Ở đây, tỷ lệ
sống sót trong điều kiện GI là tiêu chí thứ hai để lựa chọn probiotic. Năm chủng, bao gồm
L. pentosus HM04-22, L. pentosus HM04-3, L. plantarum HM04-80, L. plantarum
HM04-88 và L. plantarum HM01-1, sống sót trong điều kiện đường ruột ở 54–62%, tức là
tốt hơn chủng thương mại. Do đó, năm chủng vi khuẩn này là những ứng cử viên tiềm
năng để ứng dụng rộng rãi làm men vi sinh.
Đặc tính bám dính của men vi sinh trên lớp ruột giúp bảo vệ khỏi sự lây nhiễm của mầm
bệnh. Trong nghiên cứu này, tất cả các chủng Lactobacillus được chọn có thể ức chế sự
bám dính của E. coli và S. Typhimurium. Khả năng ức chế bám dính của 5 chủng
Lactobacillus là tương tự nhau, và cơ chế chống bám dính hiệu quả nhất là bảo vệ (p ≤
0,05). Ngoài ra, các chủng Lactobacillus phân lập cho thấy khả năng chống bám dính S.
Typhimurium tốt hơn E. coli, có thể do E. coli có hoạt tính bám dính trên các dòng tế bào
ruột cao hơn các chủng Lactobacillus. Kết quả này tương tự với các thử nghiệm ức chế L.
salivarius và L. plantarum, có thể bảo vệ Staphylococcus aureus bám vào tế bào Caco-2.
Chống bám dính làm giảm nhẹ các cơ chế cạnh tranh và dịch chuyển (Ren et al. 2012).
Những kết quả này cho thấy probiotic có thể bảo vệ sự xâm nhập của mầm bệnh trên tế
bào vật chủ bằng cách ngăn chặn sự bám dính của mầm bệnh với các thụ thể của tế bào
ruột.
Các protein tiếp giáp chặt chẽ là rào cản quan trọng cho khoảng trống giữa các tế bào
ruột. Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng S. Typhimurium và E. coli ngăn chặn sự biểu hiện
của các protein tiếp giáp chặt chẽ. Đây có thể là bằng chứng ngày càng tăng cho thấy sự
gia tăng tính thẩm thấu của các phân tử tích điện và không tích điện của tế bào ruột dẫn
đến việc kích hoạt hệ thống miễn dịch và bài tiết các chất trung gian gây viêm (Singh et
al. 2018). Các bệnh viêm ruột khác có thể xảy ra. Đã có báo cáo về lợi ích của probiotic
đối với chức năng làm hàng rào bảo vệ đường ruột (Blackwood và cộng sự 2017). Tuy
nhiên, không có sự gia tăng biểu hiện của protein tiếp giáp chặt trong năm chủng
Lactobacillus được chọn lọc được phân lập từ sữa mẹ khi so sánh với việc điều trị không
sử dụng probiotic.
Một số chủng lợi khuẩn điều chỉnh khả năng miễn dịch bẩm sinh, đặc biệt bằng cách duy
trì sự cân bằng giữa các cytokine tiền viêm (pro-inflammatory) và chống viêm (anti-
inflammatory) (Perez-Cano và cộng sự 2010; Fernandez và cộng sự 2011; Ren và cộng sự
2013; Plaza-Diaz và cộng sự 2014; Tuo và cộng sự 2018). Đáng chú ý, các đặc tính điều
chỉnh miễn dịch của các chủng Lactobacillus từ sữa mẹ đã được quan sát thấy. Các chủng
Lactobacillus phân lập được các cytokine tiền viêm (IL-8) bị ức chế đáng kể khi so sánh
với phương pháp điều trị không dùng probiotic. Mức độ của các cytokine tiền viêm có
liên quan đến các bệnh viêm nhiễm như hội chứng chuyển hóa, béo phì, tiểu đường và
viêm mãn tính ở ruột (Morita và cộng sự 2002; Alexandraki và cộng sự 2006; Luongo và
cộng sự 2017). Việc áp dụng probiotic có thể giúp làm giảm tình trạng viêm mãn tính và
khó chịu cấp tính ở đường tiêu hóa.
Kết luận, kết quả này chỉ ra rằng sữa mẹ là nguồn cung cấp men vi sinh cho hệ vi sinh vật
đường ruột của trẻ sơ sinh. Việc phân lập và chọn lọc Lactobacillus từ sữa mẹ đã thu được
5 chủng lợi khuẩn tiềm năng, bao gồm L. pentosus HM04-22, L. pentosus HM04-3, L.
plantarum HM04-80, L. plantarum HM04-88 và L. plantarum HM01- 1. Các chủng này
tăng cường chức năng hàng rào của ruột bằng cách ức chế sự bám dính của mầm bệnh
vào các tế bào ruột. Hơn nữa, chúng cho thấy đặc tính chống viêm và tồn tại tốt trong điều
kiện đường tiêu hóa. Cần phải tiến hành thêm để mô tả đầy đủ tính năng của các chủng vi
khuẩn Lactobacillus trong các nghiên cứu in vivo và áp dụng các chủng phân lập này vào
các thành phần thực phẩm chức năng trong các sản phẩm sữa trong tương lai.

Nguồn: Lactobacillus rhamnosus from human breast milk shows therapeutic

function against foodborne infection by multi-drug resistant Escherichia coli in
mice. Na Li,†a Bing Pang,†a Guanwen Liu,a Xixi Zhao,a Xiaoguang Xu,a Chunmei
Jiang,a Baowei Yang,b Yanlin Liuc and Junling Shi
Sự xuất hiện của các mầm bệnh đa kháng thuốc (MDR - multi-drug resistant) đang thách
thức rất lớn sự phát triển của các loại thuốc mới. Các probiotic với khả năng ức chế mầm
bệnh MDR có lợi hơn so với thuốc kháng sinh và thuốc hóa học do tính an toàn cao hơn
và ít tác dụng phụ hơn. Nghiên cứu này báo cáo rằng Lactobacillus rhamnosus SHA113
(được phân lập từ sữa mẹ) ức chế đáng kể MDR Escherichia coli cả in vitro và in vivo.
MDR E. coli gây ra những tác dụng viêm nghiêm trọng hơn. Nồng độ TNF-α và IL-6 tăng
lên, trong khi hàm lượng IL-10 giảm trong huyết thanh. MDR E. coli gây rối loạn cân
bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng tổng số coliform, giảm vi khuẩn axit lactic trong
phân, giảm Firmicute, và tăng cả vi khuẩn Bacteroidetes và Proteobacteria. Vào cuối quá
trình xử lý, điều trị bằng ampicillin (AMP) làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn axit lactic so
với tổng số coliform trong phân và làm trầm trọng thêm sự gia tăng của vi khuẩn
Proteobacteria do MDR E. coli gây ra. Việc điều trị bằng L. rhamnosus SHA113 dẫn đến
giảm tổng số coliform trong phân nhiều hơn và nhanh hơn đồng thời làm giảm đáng kể
Proteobacteria trong hệ vi sinh vật đường ruột. Sự gia tăng tổng số coliform trong phân
(do nhiễm MDR E. coli) có tương quan thuận với IL-6 và TNF-α và tương quan nghịch
với IL-10 trong huyết thanh. Tuy nhiên, sự gia tăng của vi khuẩn axit lactic trong phân
(do điều trị L. rhamnosus SHA113) có tương quan nghịch với TNF-α trong huyết thanh,
cho thấy SHA113 có tác dụng chống viêm. Những kết quả này cho thấy L. rhamnosus
SHA113 có tiềm năng lớn trong việc ức chế nhiễm trùng do MDR E. coli và để điều
chỉnh sự cân bằng của đường ruột.
1. Giới thiệu
Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh phổ rộng đã dẫn đến sự phong phú của
các mầm bệnh đa kháng thuốc (MDR) và gây ra khủng hoảng về hiệu quả của thuốc để ức
chế các mầm bệnh MDR. Sự gia tăng của tình trạng kháng thuốc kháng sinh là một mối
đe dọa cấp bách đối với sức khỏe cộng đồng mà nếu không có biện pháp can thiệp, có thể
hạn chế nghiêm trọng tính hiệu quả của các phương pháp điều trị kháng sinh thông
thường. Sự xuất hiện của các mầm bệnh MDR làm tăng tỷ lệ lây truyền bệnh và sự khó
khăn để tìm cách chữa trị. Hơn 30% các ca nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện là do vi
khuẩn Gram âm, trong đó E. coli là nguyên nhân gây ra hầu hết các bệnh nhiễm trùng
đường tiết niệu. Các báo cáo từ Châu Âu, Châu Á và Ấn Độ nhấn mạnh E. coli MDR là
một vấn đề toàn cầu. Hussain và cộng sự. báo cáo rằng nhiễm E. coli MDR trong thị
trường gia cầm bán lẻ ở Ấn Độ cao tới 68% ở gà thịt và 64% ở gà nuôi thả . Thậm chí có
sự xuất hiện cao của mầm bệnh MDR trong phòng chăm sóc đặc biệt (ICU - intensive
care unit) của Các bệnh viện ở Ugandan. Tỷ lệ ngày càng tăng của các bệnh nhiễm trùng
đường tiết niệu mắc phải trong cộng đồng (UTIs - urinary tract infections) do MDR E.
coli chứng tỏ rằng E. coli gây bệnh MDR có thể có trong thực phẩm như thịt gia cầm hoặc
thịt lợn và do đó lây nhiễm sang người qua đường ăn uống.
Kể từ khi lan rộng của việc kháng kháng sinh giữa các mầm bệnh nhanh hơn nhiều so với
sự phát triển của các loại thuốc mới, mầm bệnh MDR đã trở thành một vấn đề sức khỏe
cộng đồng toàn cầu và buộc mọi người phải tìm ra những cách mới để chống lại mầm
bệnh MDR. Hiện nay, nhiều protein kinaza, polypeptit, và quinazoline đã được phát triển
như chất bổ trợ kháng sinh chống lại vi khuẩn MDR.
Một số chiết xuất thực vật và chiết xuất từ vi khuẩn nội sinh đã được phát hiện có khả
năng điều trị tốt MDR E coli. Ví dụ, berberine, một loại thuốc cổ truyền của Trung Quốc,
liên kết mạnh mẽ với axit nucleic của vi khuẩn gây bệnh và do đó cho thấy khả năng
kháng khuẩn đáng kể đối với E. coli MDR. Methyl quercetin, được sản xuất bởi một loại
nấm nội sinh từ vỏ Eucommia (cây Đỗ trọng), cũng được tìm thấy để ức chế một cách
đáng kể E. coli MDR từ thực phẩm, Staphylococcus aureus và Salmonella có đuôi gai.
Procyanidins cho thấy tác dụng ức chế sự bám dính của MDR E. coli với các tế bào biểu
mô tiết niệu.
Ngoài các sản phẩm tự nhiên, probiotic sống, chủ yếu là vi khuẩn axit lactic (LAB - lactic
acid bacteria) , cũng có tiềm năng lớn để ức chế vi khuẩn gây bệnh và cho thấy tiềm năng
kiểm soát nhiễm trùng E. coli MDR. Sự xuất hiện của nhiều lợi khuẩn sống trong hệ vi
sinh vật đường ruột rất tốt cho sức khỏe của vật chủ. Hiện nay, sự phát triển và ứng dụng
của chế phẩm sinh học đã trở thành một điểm nóng trong nghiên cứu thực phẩm và y học.
Probiotics có lợi theo nhiều cách; ví dụ, chúng bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các
mầm bệnh đường ruột bằng cách kích thích các tế bào biểu mô để tăng tính toàn vẹn của
niêm mạc. Chúng cũng có tác dụng cân bằng nội môi, viêm nhiễm và bệnh lý miễn dịch
như chất ức chế hoặc chất hoạt hóa miễn dịch. Probiotics cũng cung cấp các sản phẩm
cuối cùng có chức năng như axit hữu cơ có thể được sử dụng bởi vật chủ, và cạnh tranh
tích cực với các mầm bệnh để xâm nhập và phòng bệnh. Người ta đã chứng minh rằng các
tế bào probiotic sống và các sản phẩm được lên men bởi chúng có thể ức chế vi khuẩn gây
bệnh, bao gồm cả E. coli, Enterococcus faecalis, và Salmonella. Theo các probiotic đã
được FDA phê duyệt, Lactobacillus rhamnosus đóng một vai trò quan trọng trong chức
năng sinh lý và chăm sóc sức khỏe bằng cách điều chỉnh hệ vi khuẩn đường ruột, ngăn
ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện khả năng miễn dịch và chống lại bệnh ung thư. L.
rhamnosus và các chất chuyển hóa của nó được tìm thấy để ức chế sáu vi khuẩn Gram
dương và chín vi khuẩn gây bệnh Gram âm và tám loài Candida trong ống nghiệm. Các
thử nghiệm in vivo được tiến hành trên động vật chỉ ra rằng L. rhamnosus có tác dụng
probiotic tốt chống lại nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium. Tuy nhiên, không có báo
cáo về khả năng ức chế của L. rhamnosus đối với vi khuẩn gây bệnh MDR và ảnh hưởng
của nó đối với hàng rào ruột và hệ vi khuẩn đường ruột.
Nghiên cứu này báo cáo tiềm năng to lớn của L. rhamnosus từ sữa mẹ trong việc ức chế
MDR E. coli cả in vitro và in vivo, cũng như tác động của nó lên hàng rào ruột, tính thấm
ruột, biểu hiện của các yếu tố gây viêm và hệ vi khuẩn đường ruột.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vi sinh vật và hóa chất
E. coli QBQ009, có khả năng kháng ampicillin (AMP), streptomycin (STR),
chloramphenicol (CHL), tetracycline (TE) và axit nalidixic (NAL), được sử dụng như một
mầm bệnh MDR trong nghiên cứu này. Nó được phân lập từ chuồng lợn ở Fufeng, tỉnh
Thiểm Tây, Trung Quốc, và do Giáo sư Baowei Yang của Đại học Northwest A&F,
Trung Quốc đóng góp. E. coli ATCC25922 được mua từ Bộ sưu tập nuôi cấy mô Hoa Kỳ
(ATCC - American Tissue Culture Collection) và được sử dụng như một loài gây bệnh
không kháng thuốc đối chứng. Cả QBQ009 và ATCC25922 đều được nuôi cấy trong môi
trường Luria – Bertani (LB) trong 12 giờ, ở 37 ° C, 200 vòng / phút để chuẩn bị tế bào
sống ở giữa pha tăng trưởng logarit.
L. rhamnosus SHA113 (mã là CCTCCM2017839) trước đây đã được phân lập từ sữa mẹ
của phụ nữ khỏe mạnh và được lưu trữ tại Trung tâm Bảo tồn Vi sinh vật Tiêu biểu Trung
Quốc (Vũ Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc) và được sử dụng làm probiotic trong nghiên
cứu này. Nó được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy trong môi trường deMan, Rogosa và
Sharpe (MRS) (Hopebio, Qingdao, Trung Quốc) ở 37 ° C trong 24 giờ trong điều kiện
yếm khí không lắc.
2.2. Khả năng ức chế của L. rhamnosus chống lại MDR E. coli trong ống nghiệm
Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch tiêu chuẩn được sử dụng để xác định độ nhạy
kháng sinh của MDR E. coli và hoạt tính kháng khuẩn của L. rhamnosus SHA113 dựa
trên các phương pháp đã được báo cáo trước đây với những sửa đổi nhỏ. Để đo khả năng
kháng thuốc, E. coli QBQ009 và ATCC25922 được cấy riêng rẽ trên đĩa LB ở nồng độ
106 CFU mL-1, sau đó bổ sung 100 μL AMP (32 g mL − 1), TE (16 g mL − 1 ),
norfloxacin (FPA; 8 g mL − 1), chloramphenicol (CHL; 32 g mL − 1), và aminoglycoside
(64 g mL − 1) trong các lỗ đục (đường kính: 8 mm), và dịch nuôi cấy L. rhamnosus
SHA113. Sau khi nuôi cấy trong 24 giờ, đường kính của vùng ức chế vi khuẩn (DIZ,
không bao gồm đường kính giếng) được đo. Mỗi thử nghiệm được tiến hành ba lần.
Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của L. rhamnosus SHA113 chống lại E. coli QBQ009
ở trạng thái cùng tồn tại, chúng được nuôi cấy riêng biệt (với kích thước cấy là 10 6 CFU
mL-1) trong hỗn hợp môi trường lỏng LB và MRS (tại tỷ lệ 1: 1) trong 12 giờ trước khi
chúng được thu thập sau khi ly tâm và chuyển cùng nhau sang môi trường hỗn hợp tươi.
Riêng E. coli QBQ009 được chuyển sang môi trường hỗn hợp tươi được sử dụng làm đối
chứng để khảo sát ảnh hưởng của môi trường. Tất cả các chế phẩm được nuôi cấy liên tục
ở 37 ° C. Trong quá trình nuôi cấy, lượng E. coli sống được kiểm tra ở 0 giờ, 8 giờ, 12
giờ, 14 giờ, 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ bằng môi trường McConkey Agar (Hopebio,
Qingdao, Trung Quốc).
2.3. Sự ức chế của L. rhamnosus chống lại sự lây nhiễm MDR E. coli ở chuột
Thí nghiệm trên động vật đã được Ủy ban Bảo vệ và Sử dụng Động vật của Đại học Bách
khoa Tây Bắc phê duyệt (số giấy phép: SCXXK 2017003). Các thí nghiệm được tiến hành
theo hướng dẫn và bảo vệ động vật của Viện Y tế Quốc gia. 66 con chuột Kunming (KM)
đực trưởng thành (18–22 g) được mua từ Trung tâm Thí nghiệm Động vật của Đại học
Xi’an Jiaotong. Trong thời gian thí nghiệm, chuột được nuôi ở Trung tâm thí nghiệm
động vật của Đại học Bách khoa Tây Bắc ở nhiệt độ phòng (22 ± 2 ° C), độ ẩm tương đối
là 50%, chu kỳ sáng tối là 12 giờ. Trong quá trình thí nghiệm, những con chuột đực khỏe
mạnh được chia ngẫu nhiên thành 7 nhóm với 9 con chuột mỗi nhóm. Hình 1 cho thấy sơ
đồ thử nghiệm.
Các thí nghiệm được tiến hành trong 14 ngày bao gồm cả giai đoạn lây nhiễm và giai
đoạn điều trị. Sự sắp xếp được mô tả chi tiết trong Hình 1. Nhóm đối chứng được cho ăn
đệm phosphat (PBS, pH = 7,4) trong suốt toàn bộ thí nghiệm

2.4. Phép đo các thông số của động vật

Trọng lượng cơ thể, số lượng vi khuẩn trong phân, và mức độ của các yếu tố miễn dịch và
hệ vi sinh vật đường ruột được kiểm tra cho tất cả các nhóm. Cơ chế ức chế đáng kể hơn
của L. rhamnosus SHA113 chống lại MDR E. coli so với AMP được phân tích theo
những thay đổi về tính thấm của ruột, biểu hiện của protein bám dính trong ruột, và đặc
điểm hoại tử và mô bệnh học của các nhóm sau: đối chứng, EC QBQ, LAC, EC QBQ +
LAC và EC QBQ + AMP.
2.4.1. Trọng lượng cơ thể hàng ngày và lượng vi khuẩn trong phân.
Trọng lượng cơ thể của các con vật được ghi lại mỗi ngày; Phân tươi được thu thập và xác
định tổng số khuẩn lạc coliform và vi khuẩn axit lactic bằng cách sử dụng môi trường
nuôi cấy chọn lọc McCabe và môi trường nuôi cấy chọn lọc M17, tương ứng. Trạng thái
tinh thần, sự xuất hiện của tiêu chảy và máu trong phân của chuột cũng được quan sát và
ghi lại.
2.4.2. Chỉ số nội tạng sau khi chết. Khám nghiệm tử thi được thực hiện để kiểm tra sơ
bộ bề mặt bên ngoài, các khoang lồng ngực và ổ bụng và thành phần của chúng. Lá lách,
thận và gan được cân đo ngay sau khi mổ xẻ.
2.4.3. Mức độ của các yếu tố miễn dịch trong huyết thanh. Vào ngày thứ 15, những
con chuột bị tước thức ăn và nước uống trong 7 giờ trước khi chúng bị giết. Các mẫu máu
được thu thập từ mắt trước khi những con chuột bị giết bằng cách cắt bỏ cổ tử cung. Các
mẫu máu ngay lập tức được đặt vào ống ly tâm trong nồi cách thủy 37 ° C trong 1 đến 2
giờ trước khi được bảo quản ở 4 ° C trong 3–4 giờ. Sau khi rút cục máu đông, huyết thanh
thu được sau khi ly tâm ở 3000 vòng / phút trong 15 phút như phần nổi phía trên. Sau đó,
hàm lượng interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) và TNF-α trong huyết thanh được
kiểm tra bằng bộ kit ELISA (Thermo Fisher Scientific, Thượng Hải, Trung Quốc) theo
hướng dẫn vận hành và tài liệu tham khảo 25.
2.4.4. Đo hệ vi sinh vật đường ruột trong manh tràng. Sáu con chuột được chọn ngẫu
nhiên từ mỗi nhóm để thu thập thành phần trong manh tràng và trích xuất DNA của
chúng. Các mẫu DNA đông lạnh được lưu trữ ở -20 ° C và được gửi đến Personalbio
(Thượng Hải, Trung Quốc) để giải trình tự. Đối với mỗi mẫu DNA, các đoạn V3 và V4
của 16S rDNA được phân tích bằng PCR với điện di gel gradient biến tính (DGGE -
denaturation gradient gel electrophoresis). Các đoạn DNA được giải trình tự bằng nền
tảng Illumina MiSeq. Việc sàng lọc, xử lý và kiểm tra chất lượng của dữ liệu trình tự gốc
được thực hiện bởi Personalbio (Thượng Hải, Trung Quốc).
Đối với sự đa dạng alpha của hệ vi sinh vật đường ruột, phần mềm hiểu biết định lượng
về hệ sinh thái vi sinh vật (QIIME - the quantitative insights into microbial ecology) để
phân tích cộng đồng vi sinh vật đã được sử dụng để hợp nhất các trình tự chất lượng cao
thu được ở mức độ giống nhau về trình tự 97% và phân chia các đơn vị phân loại hoạt
động (OTUs - the operational taxonomic units) . Trình tự có mức độ phong phú cao nhất
của mỗi ma trận OTU được chọn làm trình tự đại diện của OTU.
Đối với sự đa dạng beta của hệ vi sinh vật đường ruột, sau khi biến đổi tuyến tính, phân
tích PCA dự kiến dữ liệu chiều cao ban đầu (chẳng hạn như ma trận mức độ phong phú
OTU của hệ) vào hệ tọa độ không gian (cụ thể là thành phần chính) với các chiều thấp
hơn thông qua sự kết hợp của các phép biến đổi tuyến tính. Mục tiêu là để đạt được việc
giảm kích thước và đơn giản hóa cấu trúc dữ liệu, đồng thời hiển thị sự phân bố tự nhiên
của các mẫu
2.5. Phân tích thống kê Các hình được vẽ bằng GraphPad, Prism6 hoặc R3.5.3. Phân tích
mức độ đáng kể được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) và kiểm
định t Student sử dụng SPSS19.0 (Chicago, IL, Hoa Kỳ). Tất cả dữ liệu được hiển thị
dưới dạng sai số trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM), và P <0,05 chỉ ra
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Sự ức chế của L. rhamnosus trên MDR E. coli in vitro
Được trình bày trong Hình 2A, EC QBQ009 cho thấy khả năng kháng AMP (32 g mL −
1), TE (16 g mL − 1) và FPA (8 g mL− 1), trong khi EC 25922 chỉ chống được TE và
FPA, nhưng không chống được AMP. Do đó, AMP đã được lựa chọn để sử dụng trong
các thí nghiệm sâu hơn nhằm khảo sát khả năng kháng thuốc của EC QBQ009.
Cả môi trường nuôi cấy có tế bào và không tế bào của L. rhamnosus SHA113 đều ức chế
đáng kể sự phát triển của E. coli QBQ009 kháng AMP và E. coli ATCC25922 không
kháng AMP (Hình 2B).
Để xác minh khả năng ức chế của L. rhamnosus SHA113 đối với E. coli QBQ009 trong
môi trường nuôi cấy lỏng, hỗn hợp môi trường LB và MRS lỏng được sử dụng để nuôi
cấy riêng E. coli QBQ009 và cùng với L. rhamnosus SHA113 sau khi chuyển sang môi
trường tươi. Kết quả là, sự xuất hiện đồng thời của L. rhamnosus SHA113 làm giảm đáng
kể số lượng E. coli QBQ009 sống so với E. coli QBQ009 không có L. rhamnosus
SHA113 (Hình 3). Điều này chỉ ra rằng sự hiện diện của các tế bào L. rhamnosus
SHA113 làm giảm đáng kể khả năng sống sót và thậm chí giết chết các tế bào của MDR
E. coli QBQ009.
3.2. Các trường hợp gây bệnh của MDR E. coli
Người ta đã báo cáo rằng nhiễm khuẩn E. coli gây bệnh có thể gây rối loạn hệ vi khuẩn
đường ruột và tiêu chảy ở chuột. Theo các thí nghiệm sơ bộ, 1 × 10 8 cfu mL-1 của E. coli
gây tiêu chảy nghiêm trọng hơn và một loạt các phản ứng phụ so với các liều khác (1 ×
106 cfu mL − 1 và 1 × 107 cfu mL − 1). Do đó, cả E. coli QBQ009 và ATCC25922 đều
được sử dụng ở liều 1 × 10 8 cfu mL-1 trong nghiên cứu này. Kết quả là cả hai trường hợp
nhiễm vi khuẩn E. coli QBQ009 và ATCC25922 đều gây ra các dấu hiệu rõ ràng như tâm
thần bất ổn, đảo ngược mao mạch, di chuyển chậm, tiêu chảy, và thậm chí tan máu sau
khi nhiễm trong 3 ngày.
3.2.1. Nhiễm khuẩn E. coli gây giảm trọng lượng cơ thể và giảm vi khuẩn axit lactic
trong phân và gây viêm.
Hình 4A cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột tăng ở tất cả các nhóm. Tuy nhiên, cả hai
trường hợp nhiễm vi khuẩn E. coli QBQ009 và ATCC 25922 đều làm giảm sự gia tăng
trọng lượng cơ thể so với những con chuột khỏe mạnh trong suốt thời gian thí nghiệm,
mặc dù điều này không đáng kể.
So với nhóm đối chứng, tổng lượng coliform trong phân cao hơn đáng kể, trong khi lượng
vi khuẩn axit lactic thấp hơn đáng kể ở tất cả các nhóm bị nhiễm E. coli. Tổng số lượng
coliform trong phân tăng lên trong thời gian nuôi E. coli (7 ngày đầu) và giảm sau khi
ngừng cho E. coli ăn trong 7 ngày tiếp theo (Hình 4B). Ngược lại, số lượng vi khuẩn axit
lactic trong phân giảm trong thời kỳ nuôi dưỡng E. coli và tăng lên
sau khi ngừng cho E. coli ăn (Hình 4C). Sự giảm tổng số coliform và tăng tổng số vi
khuẩn axit lactic sau khi ngừng lây nhiễm E. coli cho thấy rằng hệ vi sinh vật đường ruột
có thể tự sửa chữa sự cố và sự mất cân bằng trong hệ vi sinh vật do nhiễm E. coli gây ra
ngay cả khi không có bất kỳ sự can thiệp trực tiếp nào.
Tuy nhiên, tình trạng viêm và mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột không được sửa
chữa hoàn toàn trong quá trình sửa chữa tự động. Như thể hiện trong Hình 4D-F và 5, sau
khi tự động sửa chữa trong 7 ngày, cả hai nhóm bị nhiễm MDR E. coli QBQ009 và
ATCC 25922 vẫn cho thấy các tín hiệu viêm đáng kể, chẳng hạn như tăng mức IL-6 và
TNF-α và giảm các mức độ IL- 10. Trong khi đó, E. coli kháng AMP QBQ009 gây ra
mức IL-10 giảm đáng kể hơn so với E. coli ATCC25922 không kháng AMP. Điều này
phù hợp với các báo cáo trước đây khi nhiễm trùng do vi khuẩn có thể gây ra bất thường
trong các cytokine gây viêm, bao gồm TNF-α, IL-6 và IL-10, thông qua miễn dịch bẩm
sinh và có được.
3.2.2. Nhiễm khuẩn E.coli làm thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột trong manh tràng.
Phân tích chỉ số Chao1 và Shannon cho thấy nhiễm khuẩn E. coli QBQ009 và ATCC
25922 gây ra sự gia tăng nhẹ và thay đổi nhẹ về mức độ phong phú hệ vi sinh đường ruột
đồng nhất, nhưng mức độ khác biệt không đáng kể (Hình 5A và B). Sự đa dạng beta của
hệ vi khuẩn đường ruột khác biệt đáng kể giữa các nhóm CON, EC, QBQ và EC 25922,
cho rằng nhiễm khuẩn E. coli đã gây ra sự thay đổi đáng kể trong sự phân bố vi sinh vật ở
cấp độ chi. Sự thay đổi sự phân bố của vi sinh vật do nhiễm E. coli QBQ009 gây ra khác
hẳn so với do nhiễm ATCC 25922.
Phân tích PLS-DA dựa trên mô hình hồi quy bình phương tối thiểu một phần (the Partial
Least Squares regression model) là một phương pháp nhận dạng mẫu có giám sát có thể
phân biệt dữ liệu cấu trúc cộng đồng dựa trên thông tin phân phối / nhóm mẫu đã cho.
PLS-DA đã sắp xếp lại thứ tự các mẫu trong hệ tọa độ chiều thấp mới bằng cách tìm hiệp
phương sai tối đa (the maximum covariance) của ma trận độ phong phú của loài và thông
tin phân phối / nhóm mẫu đã cho. Sử dụng phần mềm R, mô hình phân biệt PLS-DA được
xây dựng dựa trên ma trận độ phong phú của loài và dữ liệu phân nhóm mẫu. Tầm quan
trọng thay đổi trong hệ số dự báo (projection coefficients) của mỗi loài cũng được tính
toán (giá trị VIP phải > 1 và giá trị này càng lớn thì sự đóng góp của loài này vào các thế
hệ giữa các nhóm càng lớn). Điều này cho thấy rằng cấu trúc cộng đồng của hệ vi sinh vật
ở những con chuột bị nhiễm vi khuẩn E. coli khác biệt đáng kể so với ở nhóm đối chứng.
Ở cấp độ phylum, nhiễm E.coli làm giảm sự phong phú của Firmicutes và tăng sự phong
phú của Bacteroidetes và Proteobacteria trong cộng đồng vi sinh vật so với nhóm đối
chứng. Nhiễm khuẩn E. coli QBQ 009 dẫn đến xu hướng tương tự, nhưng gây ra những
thay đổi đáng kể hơn
về các khía cạnh này so với ATCC 25922. Về mặt phân loại, hầu hết vi khuẩn axit lactic
thuộc Firmicutes, trong khi E. coli thuộc Proteobacteria. Do đó, những thay đổi như vậy
phù hợp với sự gia tăng của tổng số coliform và sự giảm vi khuẩn axit lactic trong phân.
Điều này cũng chứng minh rằng nhiễm khuẩn E. coli có thể làm thay đổi cả hệ vi sinh vật
trong phân và manh tràng. Nhìn chung, MDR E. coli QBQ 009 kháng AMP có xu hướng
gây ra những thay đổi lớn hơn so với E. coli 25922 không kháng AMP, mặc dù những lỗi
này không đáng kể.
3.3. Giới hạn của AMP trong việc chữa khỏi nhiễm MDR E. coli
Theo kết quả của các thí nghiệm in vitro, MDR E. coli QBQ009 kháng AMP, trong khi E.
coli ATCC 25922 thì không. Để xác minh những hạn chế của AMP đối với sự lây nhiễm
MDR E. coli in vivo, AMP đã được sử dụng để điều trị nhiễm MDR E. coli QBQ 009 ở
chuột.
3.3.1. Điều trị AMP làm tăng trọng lượng cơ thể, giảm vi khuẩn axit lactic trong
phân, không làm giảm tổng số coliform, và gây ra tác dụng chống viêm.
Được thể hiện trong Hình 6, so với những con chuột khỏe mạnh, việc uống AMP ảnh
hưởng một chút đến trọng lượng cơ thể, gây ra sự giảm nhẹ tổng số coliform và giảm
đáng kể vi khuẩn axit lactic trong phân, giảm đáng kể IL-6 và giảm nhẹ IL-10, trong khi
tăng mức TNF-α trong huyết thanh. Điều này cho thấy tác dụng của nó đối với cảm ứng
viêm và tác động lên hoạt động của các tế bào miễn dịch. Điều này có nghĩa là AMP tồn
dư trong thực phẩm có khả năng gây hại và gây rối loạn hệ thống miễn dịch cân bằng vi
khuẩn đường ruột ở động vật khỏe mạnh.
Đối với các nhóm nhiễm MDR E. coli, việc điều trị bằng AMP không thể làm giảm tổng
số coliform ở hầu hết các giai đoạn điều trị nhưng làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn
axit lactic ngay sau khi điều trị. Khi kết thúc điều trị, mức IL-6 trong huyết thanh hầu như
giảm xuống bằng mức của nhóm đối chứng khỏe mạnh, trong khi mức IL-10 và TNF-α
vẫn cao hơn ở chuột khỏe mạnh. Những kết quả này chỉ ra rằng điều trị AMP không thể
chữa khỏi nhiễm trùng MDR E. coli mặc dù nó gây ra tác dụng chống viêm.
3.3.2. Tác động của AMP lên hệ vi khuẩn đường ruột.
Hình 7 chỉ ra rằng lượng AMP qua đường uống có ảnh hưởng nhẹ đến sự phong phú và
sự phân bố rộng rãi của sự phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột (Hình 7A và B).
Những thay đổi tương tự của sự phân bố vi sinh vật cũng được tìm thấy ở cấp độ chi so
với những thay đổi được quan sát thấy trong nhiễm khuẩn E. coli (Hình 7C) ở chuột khỏe
mạnh. So với chuột bị nhiễm E.coli MDR, điều trị bằng AMP đã làm giảm Chao1 và
Shannon

các chỉ số, nhưng các đặc điểm này không đáng kể, và làm thay đổi đáng kể sự phân bố
của vi sinh vật ở cấp độ chi (Hình 7D).
Ở cấp độ phylum, việc sử dụng AMP làm giảm sự gia tăng của Bacteroidetes, nhưng gia
tăng sự phong phú của Proteobacteria do nhiễm MDR E. coli, mà không ảnh hưởng đến
sự phong phú của Firmicutes. Ở những con chuột khỏe mạnh, lượng AMP qua đường
uống làm giảm sự phong phú của vi khuẩn Firmicutes và Proteobacteria và làm tăng sự
phong phú của Bacteroidetes trong hệ vi sinh đường ruột (Hình 7D). Việc giảm lượng
Firmicutes ở những con chuột khỏe mạnh và sự thúc đẩy sự phong phú của Proteobacteria
ở những con chuột bị nhiễm MDR E. coli không thuận lợi cho sức khỏe động vật. Nhìn
chung, điều trị AMP không khắc phục được hiệu quả các rối loạn hệ vi sinh vật đường
ruột do nhiễm E. coli MDR và gây ra các tác động bất lợi lên cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột của chuột khỏe mạnh.
Do đó, có thể kết luận rằng AMP gây ra những hạn chế và bất lợi đáng kể đối với việc ức
chế E. coli MDR, chủ yếu là do nó không thể ức chế sự phát triển của coliform trong ruột
và gây ra những ảnh hưởng không mong muốn làm giảm sự đa dạng của hệ vi khuẩn
đường ruột và gây ra rối loạn vi khuẩn đường ruột (mặc dù nó có tác dụng chống viêm).
Tất cả các kết quả này đều phù hợp với các báo cáo trước đây chỉ ra rằng kháng sinh là
một yếu tố rất mạnh gây mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Việc sử dụng kháng sinh
có thể làm giảm sự đa dạng và phong phú của hệ vi khuẩn đường ruột, do đó làm giảm
khả năng đào thải cạnh tranh, và gián tiếp phá hủy cấu trúc cộng đồng. Do đó, nó cản trở
sự tương tác giữa các loài vi sinh vật và hệ thống bổ sung của các con đường chuyển hóa
chất dinh dưỡng, dẫn đến sự biến động lớn của môi trường ruột.
3.4. Ức chế khả năng lây nhiễm MDR E. coli do L. rhamnosus gây ra
3.4.1. Tác dụng của L. rhamnosus lên trọng lượng cơ thể, vi khuẩn trong phân và
các cytokine gây viêm trong huyết thanh.
Trước các thí nghiệm chính thức trên động vật, khả năng ức chế nhiễm vi khuẩn E. coli
MDR (1 × 108 cfu mL-1) của L. rhamnosus SHA113 đã được xác định ở các liều khác
nhau là 1 × 106 cfu mL -1,1 × 10 7 cfu mL− 1, 1 × 10 8 cfu mL − 1 và 1 × 10 9 cfu m − 1.
Kết quả là, liều 1 × 10 9 cfu mL-1 cho thấy tác dụng ức chế đáng kể nhất đối với nhiễm
khuẩn E. coli. Do đó, nó đã được sử dụng trong các thí nghiệm trên động vật.
Hình 8 cho thấy rằng, đối với những con chuột khỏe mạnh, cho ăn L. rhamnosus SHA
113 không ảnh hưởng đáng kể đến trọng lượng cơ thể và nồng độ cytokine trong huyết
thanh (P> 0,05), nhưng làm giảm đáng kể tổng số coliform và tăng LAB trong phân. Điều
này phù hợp với sự ức chế của L. rhamnosus SHA 113 trên E. coli QBQ 009 in vitro.
Người ta đã đề xuất rằng việc bổ sung men vi sinh có thể là một cách thực tế để giảm các
rối loạn do hóa trị gây ra, và một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng probiotic có tác dụng bảo
vệ đối với chứng rối loạn điều hòa. Trong nghiên cứu này, cho ăn L. rhamnosus SHA 113
đã đảo ngược một chút việc giảm trọng lượng cơ thể,
đảo ngược nhanh chóng và đáng kể sự gia tăng tổng số coliform, và giảm LAB trong phân
do nhiễm E. coli QBQ 009. Cho ăn L. rhamnosus SHA 113 cũng làm giảm đáng kể nồng
độ IL-6 và TNF-α và tăng nồng độ IL-10 trong huyết thanh của chuột bị nhiễm MDR E.
coli, do đó cho thấy tác dụng chống viêm đáng kể.
Nhìn chung, so với điều trị bằng AMP, việc cho ăn L. rhamnosus SHA 113 đạt hiệu quả
điều trị tốt hơn liên quan đến trọng lượng cơ thể, tổng số coliform và các cytokine gây
viêm trong huyết thanh, đưa các mức này gần hơn với mức của chuột khỏe mạnh.
Ngoài ra, trong quá trình thí nghiệm, các dấu hiệu rối loạn tâm thần, đảo ngược mao
mạch, di chuyển chậm, tiêu chảy, và thậm chí cả máu tụ sau khi nhiễm E. coli đã được
đảo ngược ở một mức độ nhất định sau khi sử dụng AMP, nhưng đáng kể hơn bởi L.
rhamnosus SHA113. Điều này phù hợp với các báo cáo về các probiotic khác, ví dụ,
Saccharomyces boulardii làm giảm đáng kể tình trạng sụt cân và mức độ nghiêm trọng
của bệnh tiêu chảy do E. coli gây độc ruột gây ra. Ngoài ra, những con chuột khỏe mạnh
được cho ăn L. rhamnosus SHA113 vẫn giữ được trạng thái tinh thần bình thường trong
toàn bộ thí nghiệm.
Hơn nữa, hệ số tương quan giữa vi khuẩn trong phân và các cytokine gây viêm trong
huyết thanh chỉ ra rằng nhiễm E. coli (gây ra sự gia tăng tổng số coliform trong phân, EC-
FB) gây ra sự gia tăng đáng kể các cytokine gây viêm IL-6 và TNF-α, cho thấy sự xuất
hiện của chứng viêm. Tuy nhiên, việc cho ăn L. rhamnosus SHA113 (gây ra sự gia tăng
LAB trong phân, LAC-FB) làm giảm đáng kể mức TNF-α trong huyết thanh, do đó cho
thấy tác dụng chống viêm (Hình 9).
3.4.2. Khả năng của L. rhamnosus trong việc đảo ngược sự mở rộng lá lách do
nhiễm khuẩn E. coli.
Bảng 1 cho thấy nhiễm E. coli ATCC 25922 và QBQ 009 làm tăng chỉ số lá lách đáng kể,
đáng kể hơn bởi QBQ 009, cho thấy nhiễm MDR E. coli QBQ 009 có xu hướng gây tổn
thương nặng hơn đến chức năng và cấu trúc của lá lách . Điều trị bằng L. rhamnosus
SHA113 có thể đảo ngược đáng kể sự gia tăng chỉ số lá lách do nhiễm E. coli MDR, trong
khi AMP không thể. Cho chuột khỏe mạnh ăn AMP và L. rhamnosus SHA113 làm cho
chỉ số gan giảm nhẹ nhưng mức độ này không đáng kể. Các chất kháng khuẩn, chẳng hạn
như hợp chất EMTAHDCA, thường được sử dụng để điều trị chứng lách to ở chuột bằng
cách điều chỉnh chu kỳ tế bào, chuyển hóa tế bào, tín hiệu, phiên mã và protein vận
chuyển trong lá lách. Tuy nhiên, cơ chế mà L. rhamnosus SHA113 chữa trị chứng lách to
do nhiễm khuẩn E. coli cho đến nay vẫn chưa rõ ràng.
Các kết quả nhiễm vi khuẩn E. coli trên các chỉ số nội tạng phù hợp với các báo cáo trước
đây. Theo báo cáo, nhiễm khuẩn E.coli gây ra lá lách to và tổn thương gan và thậm chí đe
dọa sức khỏe con người. Nhiễm Salmonella toàn thân cũng được phát hiện là nguyên
nhân gây ra tình trạng lách to kéo dài ở chuột hoặc vật chủ người. Vi khuẩn lactic đã được
báo cáo làm giảm tổn thương gan do nhiễm vi khuẩn và độc tính cấp tính ở một mức độ
nhất định. Tuy nhiên, điều này không được tìm thấy trong nghiên cứu hiện tại đối với L.
rhamnosus SHA113.
Hơn nữa, gan của những con chuột khỏe mạnh và những con chỉ được cho ăn L.
rhamnosus SHA113 xuất hiện bình thường với độ sâu
màu đỏ, nhưng rõ ràng là nhạt hơn và có màu vàng ở chuột bị nhiễm E. coli QBQ 009,
cho thấy có tổn thương chức năng. Điều này có thể được đảo ngược bằng cách điều trị với
AMP và L. rhamnosus SHA113 (Hình 10).
Ngoài ra, nhiễm E. coli QBQ009 cũng làm tăng bạch cầu (WBC - white blood cells) và tỷ
lệ bạch cầu trung tính (NE% WBC - the neutrophil percentage of white blood cells) trong
máu. Điều trị bằng AMP và L. rhamnosus SHA113 đã đảo ngược những thay đổi này
xuống gần mức
của những con chuột khỏe mạnh, mặc dù các tác dụng không đáng kể. Điều này phù hợp
với khả năng chống viêm của AMP và L. rhamnosus SHA113. Không có sự khác biệt rõ
ràng nào được tìm thấy trong các tế bào máu khác giữa các nhóm khác nhau (Bảng 2).
3.4.3. Cho ăn L. rhamnosus có lợi cho thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột.
Hình 11 cho thấy đối với những con chuột khỏe mạnh, việc cho ăn L. rhamnosus SHA113
không ảnh hưởng đáng kể đến chỉ số Chao1 và Shannon. Tuy nhiên, nó gây ra một sự
thay đổi nhỏ trong thành phần cộng đồng của hệ vi sinh vật đường ruột, làm tăng đáng kể
sự phong phú của Bacteroidetes và giảm sự phong phú của Proteobacteria. Điều này đồng
ý với kết quả phát hiện được sự giảm tổng số coliform trong phân do cho ăn L.
rhamnosus. Tuy nhiên, sự giảm Firmicutes không phù hợp với sự gia tăng của vi khuẩn
axit lactic được phát hiện trong phân do cho ăn L. rhamnosus. Điều này có thể là do sự
tương tác giữa việc gia tăng Bacteroidetes làm ức chế vi khuẩn thuộc Firmicutes, điều này
cần được nghiên cứu thêm.
Đối với những con chuột bị nhiễm MDR E. coli, việc cho ăn L. rhamnosus đã làm đảo
ngược đáng kể sự gia tăng của Bacteroidetes và giảm Firmicutes do nhiễm MDR E. coli.
Tuy nhiên, điều trị bằng AMP đã làm giảm sự đa dạng α của hệ vi khuẩn đường ruột và
gia tăng sự phong phú của vi khuẩn Proteobacteria do nhiễm khuẩn E. coli MDR mà
không ảnh hưởng đến sự phong phú của Firmicutes. Điều này chỉ ra rằng điều trị AMP
không thể ức chế, nhưng thúc đẩy sự lây nhiễm mầm bệnh (chủ yếu thuộc về vi khuẩn
Proteobacteria). Điều trị bằng L. rhamnosus SHA 113 đã chữa khỏi đáng kể sự lây nhiễm
mầm bệnh và đảo ngược các tác nhân gây viêm gần như ở mức độ của những con chuột
khỏe mạnh.
4. Kết luận
Theo các thí nghiệm trước đây được thực hiện trong ống nghiệm, một số vi khuẩn axit
lactic (bao gồm cả Lactobacillus rhamnosus) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể
chống lại các mầm bệnh đường tiết niệu đa kháng thuốc, bao gồm cả E. coli. Trong các
báo cáo trước đây của chúng tôi, các chủng L. rhamnosus khác được phân lập từ người
sữa cũng có khả năng ức chế E. coli tiêu chuẩn. Trong các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi,
các chủng này cũng cho thấy khả năng ức chế E. coli đa kháng thuốc thấp hơn SHA113.
Do đó, chỉ SHA113 được sử dụng trong nghiên cứu này. Bên cạnh đó, H. Szajewska và
M. Kolodziej đã báo cáo rằng Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng ngăn ngừa tiêu
chảy liên quan đến kháng sinh ở trẻ em và người lớn. Tuy nhiên, kết quả này khác với kết
quả của chúng tôi tập trung vào nhiễm khuẩn E.coli trong đường ruột .
MDR E. coli kháng AMP có thể gây ra sự gia tăng tương tự của tổng số coliform và giảm
lượng vi khuẩn axit lactic trong phân và rối loạn miễn dịch, viêm và rối loạn hệ vi sinh
đường ruột nghiêm trọng hơn so với MDR E. coli không kháng AMP. AMP không thể
làm giảm một cách hiệu quả sự phong phú của tổng số coliform trong phân, nhưng thúc
đẩy sự gia tăng sự phong phú của Proteobacteria trong hệ vi sinh vật đường ruột. Ngược
lại, cho ăn L. rhamnosus SHA113 làm giảm hiệu quả và nhanh chóng tổng số lượng
coliform, tăng số lượng vi khuẩn axit lactic trong phân, đảo ngược sự mở rộng lá lách và
tác dụng chống viêm gây ra bởi MDR E. coli QBQ 009 kháng AMP, và làm tăng sự
phong phú của Bacteroidetes trong hệ vi sinh vật đường ruột. Nhìn chung, L. rhamnosus
SHA113 mạnh hơn AMP để chữa bệnh nhiễm khuẩn E.coli MDR kháng AMP và sửa
chữa sự mất cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột.