4. Những ưu – nhược điểm của xét nghiệm PCR.

4.1. Ưu điểm

Phương pháp xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm
truyền thống như:

-  Cho kết quả xét nghiệm nhanh, thường không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét
nghiệm.

-  Phát hiện được các tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm lâm sàng không
có khả năng phát hiện với các xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống như các tác
nhân virus (HCV, HBV, HPV…), tác nhân vi sinh không thể triển khai nuôi cấy được tại
phòng thí nghiệm lâm sàng vì khả năng gây dịch cao (H5N1) hay khó nuôi cấy (C.
trachomatis, L.pneumophila), hay có mặt rất ít trong bệnh phẩm ( tuberculosis trong lao
ngoài phổi, tác nhân viêm màng não mủ cụt đầu…), hay là các tác nhân có thể nuôi cấy
được nhưng thời gian có kết quả chung cuộc quá lâu (M. tuberculosis).

- Xét nghiệm PCR còn có thể cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/ 1 ml
máu. Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiên
lượng giai đoạn bệnh.

- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh di truyền khác...nhằm có biện pháp
phòng ngừa bệnh.

- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau.

4.2. Nhược điểm

- Xét nghiệm PCR rất khó thực hiện được một cách chuẩn mực tại các phòng thí nghiệm
lâm sàng.

- Giá thành khá cao.

- Đòi hỏi trình độ của kỹ thuật viên, bác sĩ phải là người có trình độ cao.

- Đòi hỏi trang thiết bị , máy móc kỹ thuật hiện đại.

Vấn đề 1: ARN nhiễm ADN tổng số (genomic DNA)

Nhận biết: Trong trường hợp này, trên ảnh điện di sẽ xuất hiện các vệt smear khối
lượng phân tử cao hoặc mẫu đối chứng– RT (bao gồm toàn bộ thành phần cần cho phản
ứng RT-PCR, ngoại trừ enzyme reverse transcriptase) lên băng sau khi tiến hành PCR.
Nguyên nhân: Bất cứ quy trình phân tách ARN nào cũng đều xuất hiện những vết
ADN. Điều này đúng khi xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi TRIzol (phenol) và màng lọc
xoay silica. Nguyên nhân có thể do sự đứt gãy không hoàn toàn của ADN tổng số trong
quá trình nghiền đồng thể (homogenization). Trong phương pháp sử dụng phenol, pH
của phenol chính là yếu tố then chốt (cần pH acid) và kỹ năng thao tác với pipet ở pha
nước sẽ quyết định mức độ nhiễm ADN.

Giải pháp: ADN tổng số cần được làm đồng nhất hoàn toàn nhờ sử dụng các phương
pháp như phá vỡ cấu trúc ADN bằng một máy đập hạt vận tốc cao (high velocity bead
beater) hoặc một polytron rotor stator. Mẫu sẽ được làm nóng trong suốt quá trình
nghiền đồng thể nhưng làm lạnh mẫu trong guanidine sẽ khiến muối này kết tủa. Do
đó, cần cân bằng thời gian nghiền đồng thể với thời gian làm lạnh mẫu tới nhiệt độ
phòng.

Sử dụng DNase là cách tốt nhất để loại bỏ ADN tổng số (Hình minh họa). Bộ kit RTS
DNase™ chứa enzyme DNase có hoạt độ cao, bền ở nhiệt độ phòng có thể loại bỏ ADN
hiệu quả. Sau bước loại ADN, resin được dùng để loại bỏ enzyme DNase mà không cần
dùng nhiệt độ hay EDTA. Kit này được khuyến khích sử dụng cho các mẫu giàu ADN
tổng số (ví dụ mô lá lách), các mẫu đã được tinh sạch trước bước xử lý với DNase.

Cột ly tâm silica dùng trong việc tách chiết ADN/

ARN hoạt động như thế nào?
BioMedia
Ngày nay, phần lớn các phòng thí nghiệm đều sử dụng các bộ kit thương mại dùng cột
ly tâm cho việc tách chiết acid nucleic. Cột ly tâm chứa chất bám silica (silica resin) cho
phép gắn chọn lọc ADN/ ARN, phụ thuộc vào điều kiện muối và bị ảnh hưởng bởi các
nhân tố khác do phương pháp tách chiết. Khi mọi thứ đều tốt đẹp, những bộ kit thương
mại này sẽ giúp toàn bộ quá trình trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn là phương pháp
truyền thống. Tuy nhiên, chúng ta thực sự không biết được cơ chế thực sự bên trong
của những bộ hóa chất bí ẩn và các bộ dung dịch tách chiết ADN trong các kit, do đó lẽ
dĩ nhiên việc giải quyết các rắc rối sẽ càng khó khăn hơn.

Bài viết này sẽ trình bày hoạt động của cột ly tâm silica sử dụng  trong các bộ kit và giải
thích chi tiết từng bước của quá trình, đồng thời, cũng điểm qua một vài vấn đề thường
gặp khi sử dụng cột silica để cung cấp thêm kiến thức cũng như hiểu biết về quá trình
này tới những người làm việc trong phòng thí nghiệm.

Quá trình ly giải

Khi bắt đầu tiến hành quá trình ly giải, chúng ta cần xác định thứ mình muốn là ADN
hay ARN, nhìn chung thì thường sử dụng đệm ly giải chứa nồng độ các muối chaotropic
(muối hoạt động bề mặt) cao. Các chaotrope (chất hoạt động bề mặt) sẽ làm mất ổn
định liên kết hydro, lực van der Walls và tương tác kị nước. Protein cũng bị mất ổn định,
bao gồm các nuclease, và sự liên kết của acid nucleic với nước cũng bị cản trở, tạo điều
kiện để chuyển chúng lên màng silica.

Các muối chaotropic gồm có guanidine HCl, guanidine thiocyanate, urea, và lithium
perchlorate.

Bên cạnh các chaotrope, đệm ly giải cũng chứa các chất biến tính để giúp hòa tan các
protein và ly giải ADN. Các enzyme được sử dụng cho quá trình ly giải tùy thuộc vào
từng loại mẫu. Protenase K là một trong số các enzyme hoạt động thực sự rất tốt trong
đệm biến tính này; protein càng bị biến tính, nghĩa là Protenase K hoạt động càng
tốt. Tuy nhiên, enzyme lysozyme lại không hoạt động được trong điều kiện biến tính
của đệm ly giải, do vậy, việc xử lý lysozyme cần phải được tiến hành trước khi thêm các
muối biến tính.

Đối với việc tách plasmid, quá trình ly giải rất khác so với việc tách ARN hoặc ADN tổng
số bởi vì việc đầu tiên là cần tách plasmid khỏi ADN tổng số. Nếu bạn cho các chất
chaotrope vào, đồng nghĩa với việc bạn sẽ giải phóng rất nhiều thành phần cùng một
lúc, và khi đó không thể phân tách hoàn toàn phân tử ADN vòng nhỏ từ nhiễm sắc thể
có khối lượng cao. Vì vậy trong quá trình tách plasmid, các chất chaotrope không được
thêm vào trước khi đệm ly giải và các muối được sử dụng trong việc gắn.

Quá trình gắn

Các muối chaotropic rất quan trọng đối với bước ly giải và bước gắn acid nucleic lên
màng silica. ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và sau đó rửa giải (elute) ở lực ion
thấp. 

Gắn ADN lên màng trong sự có mặt của muối

chaotropic. (Nguồn:  http://photoscience.la.asu.edu/)
Để tăng cường khả năng gắn cả acid nucleic lên màng, các alcohol cũng được thêm vào
giai đoạn này. Hầu hết người ta thường sử dụng ethanol nhưng trong một vài trường
hợp dùng isopropanol.

Nồng độ và thể tích của ethanol được sử dụng đều có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả
của quá trình gắn.

 Nếu sử dụng lượng quá lớn ethanol (về nồng độ hoặc thể tích) sẽ khiến acid
nucleic dễ bị đứt gãy thành các mảnh nhỏ, các mảnh này làm ảnh hưởng đến độ
đọc UV260 và làm giảm sản lượng mẫu thu được.
 Ngược lại nếu quá ít ethanol (về nồng độ hoặc thể tích) thì sẽ rất khó có thể rửa
sạch tất cả các muối trên màng. Điều cần nhớ ở đây là ethanol có ảnh hưởng đến
việc gắn và khối lượng ethanol thêm vào cần được tối ưu hóa khi bạn sử dụng
bất kì bộ kit nào. Sự thay đổi trong bước này có thể làm thay đổi sản phẩm bạn
thu hồi nên nếu bạn gặp vấn đề gì hoặc muốn giải quyết các rắc rối, hãy nghĩ
ngay đến bước này.

Một cách khác để kiểm tra các rắc rối là giữ lại toàn bộ dịch chảy qua sau quá trình gắn
và tủa lại dung dịch đó để quan sát xem liệu bạn có thể tìm thấy acid nucleic không.
Nếu bạn có sử dụng chất biến tính chứa SDS trong bước ly giải, thì hãy thử sử dụng
NaCl để kết tủa SDS, tránh làm nhiễm chất biến tính vào ADN hoặc ARN.

Quá trình rửa

Dung dịch ly giải của bạn cần được ly tâm để có thể đi qua màng silica, sau ly tâm chỉ
ADN hoặc ARN được giữ lại trên màng, còn các thành phần khác như protein,
poysaccarid,... sẽ bị rửa trôi. Nhưng, lúc này, màng vẫn có thể còn dính các protein hay
các muối bị sót lại. Nếu mẫu có nguồn gốc từ thực vật, thì khi đó sẽ còn lại polysaccarid
hoặc có thể là một vài sắc tố dính trên màng. Còn nếu mẫu lấy từ máu, màng khi đó sẽ
có màu nâu hoặc vàng.

Mục đích của bước rửa là giúp loại bỏ các thành phần không sạch. Thông thường có hai
lần rửa, mặc dù còn tùy thuộc vào từng loại mẫu. Dung dịch rửa lần một thường có một
lượng nhỏ muối chaotropic nhằm loại bỏ protein và các chất màu. Tiếp đó sẽ là bước
rửa ethanol để loại bỏ muối. Nếu như sản phẩm không chứa nhiều protein như plasmid
hoặc sản phẩm PCR thì chỉ cần một bước rửa ethanol là đủ. Việc loại bỏ các muối
chaotropic là rất quan trọng để làm tăng sản lượng và độ tinh sạch của ADN hoặc ARN.
Một số các kit thậm chí còn khuyến cáo rửa cột hai lần với ethanol. Vì nếu sau khi rửa
cột, muối vẫn còn, thì lúc đó việc elute (rửa giải) các acid nucleic cũng rất kém, độ đọc
A230 sẽ cao, kết quả là tỉ lệ A260/A230 thấp.

Làm khô bằng ly tâm

Sau bước rửa bằng ethanol, hầu hết các quy trình đều có một bước ly tâm để là làm
khô cột. Việc này giúp loại bỏ ethanol và là cần thiết để có dung dịch rửa giải (eluant)
sạch. Khi đệm Tris 10mM hoặc nước được thêm vào màng để rửa giải, các acid nucleic
sẽ bị hydrat hóa và được giải phóng nhanh chóng ra khỏi màng. Nhưng nếu như cột vẫn
còn dính ethanol, thì các axit nucleic sẽ không thể bị hydrate hóa hoàn toàn và hiệu
suất rửa giải cũng thấp.
Nếu bỏ qua bước làm khô cột sẽ dẫn đến việc bị nhiễm ethanol và sản lượng thu được
thấp.

Dấu hiệu nhận biết chính của vấn đề này chính là khi bạn cho (load) mẫu vào các giếng
trên gel agarose để điện di, ADN sẽ không chìm mà nổi trong đệm, kể cả khi bạn đã
cho dye. Dấu hiệu khác của việc nhiễm ethanol là khi để mẫu ở -20 oC, nó sẽ không bị
đóng đá.

Quá trình rửa giải (Elution)

Bước cuối cùng của quy trình là giải phóng các ADN hoặc ARN sạch khỏi màng silica.
Đối với tách chiết ADN, người ta thường dùng dung dịch muối Tris 10 mM ở pH 8-9.
ADN ổn định hơn khi ở pH gần với pH trung tính (pH 7) và sẽ hòa tan nhanh hơn khi ở
trong đệm. Điều này là đúng kể cả với các hạt tủa ADN. Còn đối với việc dùng nước để
rửa giải (elution) thì ADN với khối lượng phân tử lớn có thể không bị hydrat hoàn toàn
do nước thường có pH thấp, khoảng 4 - 5. Để việc rửa giải đạt hiệu quả tối đa, bạn có
thể ủ màng với đệm rửa giải khoảng vài phút trước khi ly tâm.

Ngược lại, ARN ổn định ở pH hơi acid và do đó, nước thường hay được dùng để rửa giải
ARN vì chúng cũng dễ dàng hòa tan trong nước.

Quy trình tách chiết ADN bằng  cột silica đơn giản. (Nguồn:  http://www.yeastern.com/)

Những điều kiện nào khác có thể gây ảnh hưởng xấu đến cột silica?

 Lượng ADN thu hồi thấp: Nếu đã có lần bạn thu được sản lượng thấp hơn lượng
bạn mong đợi trong một mẫu thì một vài nhân tố sau có thể ảnh hưởng đến việc
này:
 + Quá trình ly giải: việc ly giải không hoàn toàn thường là nguyên nhân chính
của việc lượng ADN thu được thấp.

+ Điều kiện gắn lên màng không đúng.

+ Cần sử dụng ethanol sạch chất lượng cao (đúng 100%) khi pha loãng đệm
hoặc khi thêm vào bước gắn. Ethanol chất lượng thấp hoặc đã để lâu có thể chứa
nước và nồng độ khi đó không đúng 100%. Nếu đệm rửa không chuẩn, bạn sẽ
làm rửa trôi mất ADN hoặc ARN.

 Độ tinh sạch thấp: 

        + Nếu mẫu bị nhiễm protein (tỉ số A260/ 280 thấp), có thể là do lượng mẫu bạn
sử dụng ban đầu quá nhiều và protein đã không được loại bỏ hoặc hòa tan hoàn toàn.

       + Nếu mẫu có tỉ số A260/230 không tốt, là do muối còn sót lại từ việc gắn hoặc từ
đệm rửa. Cần đảm bảo rằng sử dụng ethanol chất lượng tốt nhất để pha đệm rửa và
nếu vấn đề này tiếp tục xảy ra, hãy  tiến hành thêm một bước rửa cột nữa.

        + Một vài mẫu có nhiều chất ức chế hơn các mẫu khác. Các mẫu có tính chất môi
trường thường có xu hướng dễ tinh sạch bởi các thành phần humic được hòa tan trong
quá trình tách. Humic tương tự như ADN và rất khó loại bỏ khỏi màng silica. Đối với loại
mẫu này, kỹ thuật điển hình là loại bỏ protein và humic trước khi cho lên cột.

 Thoái hóa (Degradation):

        + Vấn đề này thường được quan tâm hơn đối với quá trình tách ARN, bạn có thể
đọc thêm trong bài viết “Giải quyết các vấn đề trong quá trình tách chiết ARN” để
thu được những lời khuyên hữu ích. Chủ yếu với ARN, sự thoái hóa diễn ra khi việc  bảo
quản mẫu không đúng cách hoặc các dung dịch ly giải không đủ hiệu quả, giả sử trong
trường hợpc bạn đã rửa giải với nước không chứa RNAase.

         + Còn trong quá trình tách ADN, sự thoái hóa không phải là một vấn đề lớn bởi vì
với PCR, ADN dù có bị đứt gãy thì nó vẫn hoạt động tốt. Nhưng nếu bạn hy vọng ADN
không bị đứt gãy nhiều, bạn có thể sử dụng phương pháp ly giải siêu mạnh.

 Tinh sạch sản phẩm PCR: 

      + Tinh sạch sản phẩm PCR bằng công nghệ cột ly tâm silica là dễ dàng nhất, bởi vì
đơn giản nó liên quan đến việc thêm nồng độ cao của muối gắn (thường là từ 3 – 5 thể
tích muối trên một thể tích phản ứng PCR) và sau đó tiến hành ly tâm cột.

      + Nên khi việc tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thất bại, nó có thể khiến chúng ta
rất bực bội, khó chịu. Khi đó, câu hỏi đầu tiên cần đặt ra là: “Bạn đã kiểm tra kết quả
phản ứng PCR trên gel chưa?” bởi vì bạn không thể đo nồng độ để biết chính xác lượng
sản phẩm PCR, do có quá nhiều thành phần phản ứng PCR hấp thụ ở bước sóng UV 260
như: các nucleotide, chất biến tính, muối, và mồi. Do đó, việc thất bại trong quá trình
tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit có thể do phản ứng PCR bị thất bại và ngay từ đầu đã
không có sản phẩm phản ứng nào.

      + Nhưng nếu bạn thu được nhiều sản phẩm PCR, cách giải quyết tốt nhất là giữ lại
các dịch chảy qua của bạn sau quá trình gắn. Nếu ADN không gắn lên màng thì nó phải
ở đó. Bạn luôn có thể giải quyết được và bắt đầu lại từ đầu. Và sau đó hãy gọi cho bên
hỗ trợ kỹ thuật và yêu cầu thay thế bộ kit khác

Điện di (Phần 1)
BioMedia
1. Nguyên lý cơ bản

Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng
của điện trường. Điện di thường được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc vắng mặt của
môi trường hoặc chất nền rắn nơi mà phân tử tích điện dịch chuyển. Hệ thống điện di
dung dịch sử dụng hệ đệm dung dịch thay cho môi trường rắn, những hệ thống như vậy
có thể chịu ảnh hưởng bởi sự xáo trộn mẫu do có sự khuếch tán của phân tử tích điện,
làm giảm độ phân giải trong quá trình ứng dụng, phân tách và các bước loại bỏ mẫu.
Như vậy hệ thống điện di dung dịch phải sử dụng một vài phương tiện nhằm ổn định
dung dịch trong tế bào điện di. Ví dụ: hệ thống điện di độ chênh hòa tan sử dụng các
chất tan không có ion với mật độ khác nhau (Vd: Đường sucrose hoặc glycerol) để giảm
thiểu độ khuếch tán của vật chất được tách ra trong quá trình điện di như Hình 1.
Nhưng ngay cả có những cải tiến thì hệ thống phân tách điện di vẫn còn hạn chế đó là
khi dùng cho việc chuẩn bị tỷ lệ xích vật chất (preparative scale: preparative là một từ
tối nghĩa, trong công nghệ sinh học nó có nghĩa là việc cô lập vài mili gram vật chất cho
việc đánh giá hoạt động sinh lý học của nó) bằng phân tách điện di.

Hình 1: Hệ thống điện di dung dịch.

Ứng dụng thiết thực nhất của phương pháp điện di trong công nghệ hóa sinh là điện di
vùng (zonal electrophoresis), trong đó dung dịch ion có vai trò như một khuôn đỡ rắn
và mẫu sẽ được đưa vào dưới dạng điểm hoặc băng vật chất. Giấy điện di, dải cellulose
acetate, dải cellulose nitrate và gel điện di là những thành phần của hệ thống điện di
(Hình 2). Những hệ thống này thông thông thường được sử dụng cho phân tích hơn là
việc chuẩn bị tỷ lệ xích vật chất (preparative scale).

Hình 2: Hai hệ thống điện di vùng (zonal electrophoresis).

Tất cả các dạng của hệ thống điện di đều tuân theo quy luật như trong phương trình (*)
sau đây:
(*) Độ linh động của phân tử =  

Độ linh động hoặc tốc độ chuyển động của phân tử tăng lên khi hiệu điện thế và điện
tích của phân tử tăng lên và ngược lại độ linh động giảm khi ma sát giữa các phân tử
hoặc độ nhớt của môi trường tăng làm cản trở dòng chảy. Tổng chuyển động thực tế
của các phân tử tăng dần theo thời gian vì thế độ linh động được định nghĩa là tốc độ
của sự di chuyển, phương trình (*) là phương trình cực kỳ quan trọng trong ngành hóa
sinh thực nghiệm. Tất cả các hệ thống điện di đều sử dụng một hiệu điện thế bằng
nhau và không đổi trên toàn bộ tiết diện cắt ngang của dải giấy, gel hay dung dịch
dùng trong phân tách điện di. Đơn vị của điện trường là V/cm (độ lớn của nó được xác
định bằng giá trị của điện áp), và theo định luật Ohm (V = IR) ta có điện áp V là hàm
của dòng điện I và điện trở R, điện trở của hệ thống được quyết định bởi bản chất của
thiết bị điện di và thành phần bộ đệm. Do đó dòng điện (vd: mA) thường được dùng để
xác định yêu cầu về hiệu điện thế của phép phân tách điện di. Điện trở của hệ thống là
thành phần rất quan trọng vì nó sẽ quyết định lượng nhiệt sinh ra trong quá trình điện
di. Khi mà độ linh động điện di cũng phụ thuộc vào nhiệt độ do đó nhiệt độ của chất
nền phân tách phải được điều khiển. Nếu một lượng nhiệt đủ lớn xuất hiện trong quá
trình điện di thì yêu cầu hệ thống phải có một số thiết bị làm mát để duy trì được nhiệt
độ không đổi trong suốt quá trình làm việc. Các mô hình “smiling” thường thấy trên
phiến gel điện di là kết quả của sự gia nhiệt không đồng dạng của nó.

Nếu điện áp hoặc dòng điện được cấp cho hệ thống điện di là không đổi trong suốt quá
trình phân tách điện di thì độ linh động của phân tử sẽ phụ thuộc vào các thành phần là
dòng điện tích và tính ma sát của phân tử trong mẫu. Xét quá trình phân tách điện di
trên giấy của acid glutamine, este methyl asaparagine và glycinamide tại giá trị pH 6.0.
Điện tích và khối lượng phân tử của các hợp chất được mô tả trong Hình 3.

Hình 3: Phân tách bằng điện di giấy của acid glutamic, glutamine, asparagine, methyl
ester và  glycinamide tại pH 6.0. Glycinamide, có điện tích +1 và khối lượng phân tử là
75 có thể không nhất thiết di chuyển nhanh gấp hai lần với asparagine methyl ester có
cùng điện tích nhưng có kích thước gấp hai lần. Đặc biệt, tính  chất của đệm có thể ảnh
hưởng đến sự phân bố độ ma sát của các phân tử nhỏ. Lực ion cao hơn có thể làm giảm
sự phân bố ma sát.

Ta thấy các acid amin cùng kích thước và este methyl asparagine được phân tách tuân
theo hàm về điện tích của chúng ở giá trị pH 6.0 trong khi glycinamite (có cùng điện
tích nhưng kích thước chỉ bằng nửa so với este methyl asparagines) lại di chuyển xa
hơn về phía cực âm (-) của hệ thống.

Nói chung các nguyên lý được minh họa trong Hình 3 có thể được sử dụng để minh họa
tính linh động của phân tử ion cỡ nhỏ. Các nguyên lý này đặc biệt hữu ích cho việc tiên
đoán khả năng phân tách điện di của các phân tử nhỏ chứa các nhóm có tính acid hoặc
bazơ yếu, các phân tử này chỉ mang theo một phần điện tích trung bình trong dải pH
liên quan đến phép chuẩn của chúng, ví dụ trong phân tách điện di của các nucleotide
hoặc các acid amin.

Sự phân tách điện di của các phân tử lớn hơn các đại phân tử tuân theo nguyên lý của
phương trình (*) nhưng các yếu tố khác sẽ ảnh hưởng đến độ phân giải của các đại
phân tử. Độ ma sát của phân tử trong quá trình di chuyển điện di bị ảnh hưởng bởi cả
hai yếu tố là hình dạng và kích thước của phân tử. Nếu quá trình điện di được thực hiện
trong một môi trường có các rào cản có tác dụng cản trở đáng kể sự chuyển động của
các đại phân tử thông qua nó (ví dụ như hai hệ thống thường được dùng là
polyacrylamide và agarose) lúc này kích thước phân tử được chứng minh là yếu tố quan
trọng nhất quyết định tính linh động của nó. Nếu tỷ lệ điện tích/khối lượng của đại phân
tử được phân tách là xấp xỉ như nhau thì kích thước của phân tử là yếu tố duy nhất ảnh
hưởng đến tính di động điện di. Những điều kiện này đang được sử dụng để xác định
khối lượng phân tử của tiểu phần protein bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide có chứa natri dodecyl sunphát (SDS-PAGE), và trong phân tách điện di
của các thang oligonucleotide trong quá trình giải trình tự ADN. Đối với phân tử cỡ nhỏ
có các liên kết có thể xoay tự do, do đó hình dạng phân tử không ảnh hưởng nhiều đến
ma sát, nên điều quyết định chính đến độ ma sát là kích thước của phân tử. Tuy nhiên
các đại phân tử thường có hình dạng xác định với tỷ lệ cụ thể của các trục (ví dụ tỷ lệ
chiều dài với chiều rộng) kết quả là cả hình dạng và kích thước đều ảnh hưởng tới sự di
chuyển của phân tử. Phân tử có tỷ lệ lớn giữa các trục (hình dạng thuôn dài) thể hiện
tính linh động trong quá trình điện di thấp hơn so với phân tử dạng hình cầu có điện
tích và khối lượng bằng nhau. Ngoài ra các đại phân tử có tính linh động không giống
với nguyên lý điện di từ phương trình (*) bởi vì sự tương tác của nó với các ion hoặc do
sự phụ thuộc của điện tích vào sự liên kết của các nội phân tử.

2. Các dạng đặc trưng của điện di thường được sử dụng trong công nghệ sinh
học

– Điện di giấy ( Paper Electrophoresis): Điện di trên giấy là phương pháp điện di

thường được sử dụng để phân tích và phân giải các phân tử cỡ nhỏ. Phương pháp này
không được sử dụng để phân giải các đại phân tử (ví dụ protein…) bởi vì sự hấp thụ và
sức căng bề mặt liên kết với giấy điện di thường làm thay đổi hoặc biến tính các đại
phân tử tạo ra độ phân giải kém.

Có hai phương pháp điện di giấy.

 Đối với quy trình khô, mẫu của chất tan được hòa tan trong nước hoặc một bộ
đệm dễ bay hơi sau đó nó được nhỏ một giọt nhỏ hoặc sọc mỏng lên đường gốc
(origin line) hoặc đường chì (pencil line) trên giấy, sau đó các hợp chất tiêu
chuẩn thích hợp đã biết được đưa vào các vị trí khác trên đường gốc của giấy.
Nếu bạn dự đoán được rằng sự di chuyển điện di sẽ về cả hai phía điện cực của
hệ thống thì đường gốc nên được đặt tại tâm của giấy, còn nếu sự di chuyển điện
di chỉ theo một hướng điện cực thì đường gốc nên được đặt tại gần một đầu (rìa)
của giấy. Sau khi dung môi hòa tan có chứa các mẫu đã bay hơi hết, giấy được
làm ẩm với đệm điện di bằng cách phun đồng nhất hoặc ngâm thấm các đầu của
tờ giấy để làm ẩm cả 2 đầu và đường gốc của nó.
 Quy trình ướt, mẫu dung dịch cô đặc trong nước cất được nhỏ lên trên giấy trước
khi được làm ẩm với đệm điện di. Quy trình khô có lợi thế so với quy trình ướt đó
 là cho phép điểm mẫu ban đầu nhỏ và độ phân giải tốt hơn đối với những hợp
chất có cùng độ linh động. Tuy nhiên quy trình khô khá bất tiện bởi vì việc nhúng
và phun đòi hỏi kỹ năng thao tác để ngăn việc làm dây mẫu ra ngoài. Quy trình
ướt đơn giản hơn nhiều nhưng giọt mẫu điểm thường lớn hơn và độ phân giải thu
được kém hơn do sự khuếch tán của mẫu.

Sau khi mẫu được đặt lên mảnh giấy ẩm, giấy này được đưa vào buồng điện di để cho
cả hai đầu của giấy đều tiếp xúc với bình chứa bộ đệm điện di và các điện cực (Hình 4).
Nếu đường gốc không nằm tại tâm của tờ giấy thì tờ giấy phải được định vị sao cho có
thể cho phép tối đa sự di chuyển về phía điện cực mong muốn. Sau đó buồng điện di
được đóng lại để ngăn sốc điện và điện trường sẽ được cấp cho hệ thống.

Dưới tác dụng của điện trường và điện trở lên dòng điện, bộ đệm giấy sinh ra nhiệt, đây
là vấn đề lớn và khó khăn nhất đối với phương pháp điện di trên giấy bởi vì nhiệt sinh
ra có tác dụng sấy khô giấy làm cản trở dòng điện và kết quả làm cho điện trở lại tăng
lên v.v. Kể cả nếu ta có thể ngăn chặn quá trình bị sấy khô của giấy bởi nhiệt thì lượng
nhiệt sinh ra này vẫn làm thay đổi tính chất dòng điện và trở kháng của hệ thống làm
biến dạng sự di chuyển của phân tử.

Hình 4: Hai hệ thống điện di giấy.

Bởi vì những khó khăn trên nên các hệ thống điện di trên giấy hiện đại đã được thiết kế
để khắc phục những vấn đề về nhiệt lượng sinh ra. Hầu hết các thiết bị sử dụng điện áp
thấp được thiết kế dưới dạng nhỏ gọn cơ động và nó có thể được vận hành trong phòng
lạnh hoặc trong buồng đông lạnh. Ngược lại các thiết bị sử dụng điện áp cao thường sử
dụng hệ thống làm mát dạng giường phẳng hoặc được vận hành trong một bồn làm mát
chứa dung môi trơ và không phân cực (ví dụ: Varso-một sản phẩm từ chưng cất dầu
mỏ). Dung dịch này hấp thụ nhiệt tỏa ra từ hệ thống mà không cần trộn với nước, bộ
đệm hoặc các mẫu trên giấy (Hình 4). Sau khi điện di các mẫu trên giấy với thời gian và
điện áp yêu cầu cho sự phân tách tối ưu, dòng điện sẽ được ngắt, giấy được lấy ra khỏi
hệ thống và được sấy khô sau đó ta có thể xác định được sự hiện diện và vị trí của các
phân tử cần quan tâm.

– Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis): Đây là một phương pháp mới cho
sự phân tích điện di và có ứng dụng ngày càng nhiều trong nghiên cứu sinh hóa.

Tên của phương pháp đã giúp ta phần nào đoán được nguyên lý hoạt động của nó,
trong đó vật chất được phân tích và môi trường điện di được đặt trong một ống mao
dẫn mịn, dài (thông thường dài từ 50 đến 100cm và đường kính trong từ 15 đến 100
μm). Một lượng mẫu rất nhỏ (cỡ nano lít) được đặt tại một đầu của ống mao dẫn và
chịu sự điện di dưới trường tạo bởi điện áp từ 20 đến 30kV. Chất phân tích sẽ được
phân tách tuân theo nguyên lý của phương trình (*) và được phát hiện khi chúng xuất
hiện ở đều bên kia của ống mao dẫn thông thường là bằng phương pháp sắc kí lỏng
hiệu năng cao. Ưu điểm của điện di mao dẫn là nó cho độ phân giải cực cao, tốc độ và
độ nhạy cao đối với việc phân tích các mẫu rất nhỏ nhưng rõ ràng nó không thực sự
hữu ích trong phương pháp chuẩn bị vật liệu (preparative). Nó thường sử dụng trong
việc phân tách các phân tử ADN có kích thước khác nhau chỉ một nucleotit đơn lẻ. Bởi vì
phương pháp điện di mao dẫn có độ phân giải rất cao, nên nó là cơ sở để phân tách các
polynucleotide trong trình tự ADN kiểu mới. Phương pháp điện di mao dẫn cũng phù
hợp với sự phân tách các phân tử không tích điện bằng cách thêm các vi hạt tích điện
vào trong môi trường dung dịch điện di. Nếu hỗn hợp dung dịch hòa tan được ngăn cách
giữa môi trường nước và phần kỵ nước bên trong của vi hạt được đưa vào trong hệ
thống này thì chúng có thể được phân tách bằng phương pháp điện di. Điện di mao dẫn
là một phương pháp có tính linh động cao, phạm vi ứng dụng và phương pháp tối ưu
hóa cho nó vẫn đang được nghiên cứu.

– Điện di trên gel ( Gel Electrophoresis): Đối với phương pháp điện di trên gel,
phân tử được phân tách trong hệ đệm lỏng được hỗ trợ trong một chất nền polime. Hệ
thống điện di trên gel có một số ưu điểm rõ rệt. Đầu tiên, chúng có thể thích hợp trên
những mẫu lớn hơn so với hầu hết các hệ thống điện di giấy, và cũng có thể sử dụng
cho việc chuẩn bị tỷ lệ xích (preparative scale) cho các đại phân tử. Thứ hai là tính chất
của chất nền gel có thể thay đổi theo ý muốn để phù hợp với những ứng dụng cụ thể,
bởi vì gel làm tăng độ ma sát và điều chỉnh sự linh động điện di (xem phương trình
(*)). Vật liệu để làm chất nền có nồng độ thấp hoặc mức độ thấp các liên kết chéo của
các monomer trong hệ thống gel có thể được sử dụng rộng rãi như một thiết bị ổn định
hoặc loại bỏ đối lưu với sự cản trở tương đối thấp của ma sát lên  sự chuyển động của
các đại phân tử. Vật liệu có nồng độ cao hoặc mật độ các liên kết chéo của các
monomer lớn được sử dụng để tạo ma sát dùng trong việc sàng lọc phân tử. Sàng lọc
phân tử là tình huống trong đó độ linh động điện di và sự di chuyển của dung dịch được
xác định chủ yếu thông qua độ nhớt và kích thước lỗ rỗng, kết quả là sự di chuyển của
các đại phân tử trong hệ thống sẽ cơ bản được xác định bởi khối lượng phân tử của
chúng.

Rất nhiều tác nhân dạng gel đã được sử dụng trong hệ thống điện di, trong đó gel
agarose (polymer polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng
dụng với những đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v. Gel polyacrylamide là một
trong những tác nhân hữu ích và linh hoạt nhất sử dụng trong phân tách điện di bởi vì
nó dễ dàng giải quyết một loạt các protein và acid nucleic (bảng 4-1 và 4-2 hướng dẫn
cách chuẩn bị gel SDS-PAGE và gel polyacrylamide cho mẫu acid nucleic có khối lượng
phân tử nhỏ).

Gel polyacrylamide được hình thành từ quá trình polymer hóa acryamide (đơn phân tử)
và N,N&-methylene-bis-acrylamide (liên kết chéo) (Hình 5).

Hình 5: Cấu hình gel polyacrylamide.

Acrylamide đơn phân tử và dạng liên kết chéo tự bản thân nó tồn tại ở trạng thái bền
hoặc được trộn ở trong dung dịch, nhưng polymer dễ dàng xuất hiện trong hệ thống tạo
gốc tự do. Các nhà hóa sinh sử dụng các nguồn gốc tự do hóa học hoặc hóa quang để
tạo ra quá trình polymer hóa. Đối với phương pháp hóa học (phương pháp được sử dụng
phổ biến nhất) chất khởi tạo gốc tự do là amoni persulfate (APS) được thêm vào cùng
với chất xúc tác N,N,N&,N&-tetramethylethylenediamine (TEMED). Hai thành phần nêu
trên cùng với đơn phân tử, thành phần liên kết chéo và hệ đệm phù hợp sẽ tạo thành
gốc tự do thích hợp để tạo ra sự polymer hóa. Đối với quá trình quang hóa (ít được sử
dụng hơn), amoni persulfate được thay thế bởi thành phần nhạy ánh sáng (ví dụ
riboflavin) để tạo ra gốc tự do khi nó bị chiếu bằng tia cực tím. Có thể thay đổi để tạo
ra loại gel sử dụng phù hợp với từng ứng dụng. Nếu ứng dụng yêu cầu lỗ có kích thước
lớn bạn có thể giảm lượng đơn phân tử hoặc (và) liên kết chéo trong dung dịch, ngược
lại có thể tăng nồng độ của đơn phân tử hoặc liên kết chéo (hoặc cả hai) để giảm kích
thước lỗ.

Yêu cầu về kích thước lỗ cho từng quá trình phân tách điện di cụ thể sẽ phụ thuộc vào
kích cỡ khác nhau của hợp chất mà bạn sẽ xử lý. Ví dụ, nếu bạn muốn xử lý hai protein
cỡ nhỏ có kích thước 8000 Da và 6000 Da thì bạn cần phải có loại gel với kích thước lỗ
nhỏ (15 đến 20% acrylamide) nhưng loại gel này sẽ không cho độ phân giải đối với hai
protein lớn hơn với kích thước 150000 Da và 130000 Da, trong trường hợp này ta phải
sử dụng loại gel có kích thước lỗ lớn hơn (với nồng độ acrylamide từ 7.5 đến 10%).
Bảng 1 chỉ ra phạm vi phân tách protein hiệu quả của gel với các phần trăm acrylamide
khác nhau.

Bảng 1:   Hiệu quả phân tách của gel polyacrylamide ở các nồng độ khác nhau đối với
việc sử dụng SDS-PAGE

Điện di (Phần 2)
BioMedia

Xem bài Điện di (Phần 1)

Điện di trên gel polyacrylamide – Natri dodecyl sulfate (SDS-PAGE). Hệ thống điện di
trên gel natri dodecyl sulfate (Sodium Dodecyl Sulfate – SDS) được sử dụng để xác định
số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc
phân tách protein. Ban đầu quá trình chuẩn bị protein được xử lý với một lượng dư thiol
hòa tan (thường là 2-mercaptoethanol) và SDS. Dưới những điều kiện này, thiol làm
giảm tất cả các liên kết disulfide (-S-S-) có mặt bên trong hoặc ở giữa các đơn vị
peptide, trong khi SDS (chất tẩy rửa ion hoặc biến tính) liên kết với tất cả các khu vực
của protein và phá vỡ hầu hết các liên kết không phải liên kết cộng hóa trị giữa các
phân tử và tương tác của nội phân tử protein. Hai thành phần này dẫn đến kết quả là
toàn bộ protein trong mẫu bị biến tính, tháo cuộn và tính anion cao (điện tích âm) của
chuỗi polypeptide (Hình 1).

Hình 1. Gián đoạn protein với sự dư thừa thiol và SDS

Chuỗi anion polypeptide sau đó được điện di trong gel polyacrylamide bão hòa với SDS
và hệ đệm mang dòng thích hợp. SDS dư thừa được đưa vào trong gel nhằm duy trì
trạng thái biến tính của protein trong quá trình phân tách điện di. Polypeptide được phủ
SDS (xấp xỉ 1 phân tử SDS trên 2 acid amino) tạo ra tỷ lệ điện tích trên khối lượng xấp
xỉ như nhau cho tất cả các protein. Tại thời điểm này, điện tích nội tại trong chuỗi
polypeptide riêng lẻ (có nghĩa là không có mặt SDS) là không đáng kể so với điện tích
âm của chúng khi có mặt SDS. Ma sát xuất hiện khi các phân tử di chuyển qua đệm
polyacrylamide, bây giờ sẽ là yếu tố chính ảnh hưởng đến độ linh động của phân tử.
Ngoài ra sự ma sát của các phân tử trong quá trình phân tách cũng bị chi phối bởi kích
thước lỗ rỗng của ma trận polyacrylamide, polypeptide lớn sẽ chịu ma sát lớn hơn các
polypeptide nhỏ khi đi qua ma trận polyacrylamide với kích thước đã xác định (các
polypeptide cỡ nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn loại cỡ lớn). Tóm lại điện di SDS-PAGE cho
phép phân tách protein dựa theo kích thước của chúng.

Nguyên tắc cơ bản của dạng SDS-PAGE thông dụng nhất được minh họa bằng cách mô
tả từng bước sự di chuyển của protein trong gel. Quan sát trong hình 2, SDS-PAGE sử
dụng hai hệ đệm/ các thành phần gel polyacrylamide trong một phiến duy nhất, được
gọi là gel cô “stacking gel” và gel tách (hoặc gel phân giải) “running (resolving) gel”.
Mẫu protein đầu tiên được đưa vào giếng đã cho  gel cô sau khi chúng được trộn với bộ
đệm nhớt (30% glycerol) có chứa SDS và thiod. Sau khi mẫu đã được nạp, điện áp sẽ
được cấp cho hệ thống (với dòng đi qua gel cỡ 3 đến 4 V/cm 2) giữa hai bể phân tách
của đệm glycine với pH 8.3.

Hình 2. Sự chuyển động protein trong gel cô và gel tách 

Hãy nhớ rằng dòng ion phải tuân theo nguyên lý của phương trình sau:

(*) Độ linh động của phân tử =  

cụ thể là giá trị điện tích lớn sẽ làm tăng tính linh động, trong khi đó kích thước lớn sẽ
làm tăng độ ma sát và làm giảm tính linh động. Glycine có điện tích trung bình vào
khoảng -0.1 tính cho một phân tử tại pH 8.3 (đệm tách/ đệm glycine) và hầu như
không có điện tích âm tại pH 6.8 (pH gel cô). Ngược lại protein được phủ SDS trong hệ
thống sẽ mang điện tích âm cao đó là bản chất độc lập của pH trong hệ thống. Tại nồng
độ pH yếu trong gel cô, anion glycine bị mất điện tích âm và độ linh động của nó sẽ bị
giảm xuống. Ngược lại, ion clorua di chuyển nhanh, sẽ chạy trước các protein vì nó có
kích thước nhỏ (ma sát thấp) và có đủ điện tích âm (không bị mất như trường hợp
trên). Các protein tích điện âm trong hệ thống có hệ số ma sát lớn do đó chúng di
chuyển chậm hơn so với clorua nhưng nhanh hơn các anion glycine gần như không tích
điện. Kết quả của độ linh động của các anion này làm cho protein được tích lũy ở phần
trước của glycine (Hình 2-b) và sau đó được dồn tập trung tạo thành các băng hẹp tại
ranh giới của gel cô và gel tách (Hình 2-c), trong khi đó ion clorua nhanh chóng di
chuyển từ trong gel cô vào gel tách.

Khi các anion đi vào trong gel cô thì nồng độ cao của hệ đệm pH 8.8 và nồng độ cao
của acrylamide (làm giảm kích thước lỗ) trong gel sẽ kích hoạt hai quá trình. Đầu tiên
là nồng độ pH cao của hệ  đệm sẽ truyền điện tích âm cho các ion glycine (các ion này
di chuyển rất chậm trong hệ đệm pH 6.8 trong gel cô), vì chúng có khối lượng nhỏ và
giờ đây điện tích đã được tăng lên nên các anion glycine nhanh chóng bắt kịp các
protein cũng đang chuyển động trong hệ thống. Tỷ lệ điện tích trên khối lượng trở nên
bằng nhau trên các protein do sự xuất hiện của SDS trong hệ thống (xem phần trên) do
đó sự di chuyển của các protein lúc này sẽ chỉ phụ thuộc vào kích thước của chúng.

Hình 3 chỉ ra độ linh động tương đối của chuỗi anion polypeptide tuân theo hàm logarit
khối lượng phân tử của nó. Nếu một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử đã biết
được đưa vào mẫu trong quá trình phân tách điện di thì độ linh động tương đối của nó
có thể được xác định và được vẽ dưới dạng đồ thị hàm log của khối lượng phân tử và độ
linh động tương đối. Khối lượng phân tử của chuỗi polypeptide có thể được ước tính
bằng cách thay các giá trị độ linh động đo đạc được của polypeptide chưa xác định vào
đồ thị chuẩn thu được từ quá trình phân tích các polypeptide có khối lượng đã biết.

Hình 3. Mối quan hệ giữa trọng lượng phân tử và chuyển động của protein trong gel
SDS-PAGE

Có hai phương pháp quan hóa thông dụng nhất thường được sử dụng để quan sát sự
phân tách của protein trong SDS-PAGE. Sự lựa chọn giữa hai phương pháp chủ yếu dựa
vào độ nhạy được yêu cầu trong ứng dụng. Phương pháp thứ nhất liên quan đến việc
làm bão hòa gel trong dung dịch acid axetic, methanol và nước có chứa thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue R-250. Methanol và acid axetic trong dung dịch có tác dụng cố
định protein trong chất nền gel còn Coomassie Brilliant Blue liên kết với các protein
trong gel. Tương tác giữa thuốc nhuộm Coomassive và protein chủ yếu thông qua lượng
dư của arginine mặc dù các tương tác yếu với tryptophan, tyrosine, phenylalanine,
histidine và lysine cũng liên quan đến quá trình này. Tiếp đó gel sẽ bị làm mất màu với
một dung dịch acid axetic/dung dịch methanol không có chứa thuốc nhuộm (để loại bỏ
thuốc nhuộm từ các phần không chứa protein của gel), protein lúc này xuất hiện dưới
dạng một băng màu xanh đậm trên gel polyacrylamide. Khi được thực hiên đúng cách
phương pháp này đủ nhạy để phát hiện băng protein chỉ bao gồm một lựơng
polypeptide rất nhỏ cỡ 0.1 đến 0.5%g. Một phương pháp nhuộm khác là nhuộm bạc,
đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện 10 ng protein có trong một băng
gel crylamide đơn. Nhuộm bạc được bắt đầu cách làm bão hòa gel với dung dịch bạc
nitrat, tiếp theo một chất khử sẽ được thêm vào để làm giảm ion Ag + và kết tủa thành
kim loại bạc trên protein trong gel và làm cho các băng protein màu đen xuất hiện trên
gel. Nhuộm bạc là một kỹ thuật rất khó do đó nó chỉ được thực hiện khi hiển thị với độ
nhạy cực cao.

Đẳng điện hội tụ (Isoelectric Focussing) Đẳng điện hội tụ là một kỹ thuật điện di dùng
để phân tách các đại phân tử dựa trên các điểm đẳng điện của nó (các giá trị pI, pH mà
tại đó chúng không mang điện tích). Đối với SDS-PAGE quá trình này có thể được thực
hiện trong dạng phiến, độ chênh pH được thiết lập trong gel polyacrylamide với sự hỗ
trợ của ampholytes là một loại polymer cỡ nhỏ (~5000 Da) có chứa phân bố ngẫu nhiên
của các nhóm acid và bazơ yếu (vd, carboxyl, imidazole, amin v.v) Gel polyacrylamide
bao gồm những ampholyte này được đưa vào một thiết bị điện di có chứa dung dịch
acid loãng (H+) ở anode và bazơ loãng (OH–) ở cathode trong buồng điện di (Hình 4).
 Hình 4. Các bước của quy trình điện di đẳng điện

Khi điện áp được cấp cho hệ thống, dòng điện chủ yếu sinh ra do sự di chuyển của các
loại ampholyte tích điện xuất hiện ở trong gel. Các ampholyte di chuyển về phía hai cực
phù hợp với phân bố điện tích của chúng; các ampholyte với điểm đẳng điện thấp hơn
(vd, các loại bao gồm số lượng lớn các nhóm carboxyl và có điện tích âm) sẽ di chuyển
về phía anode, trong khi các ampholyte có điểm đẳng điện cao hơn (vd, các ampholyte
có nhiều các nhóm amin hơn và có điện tích dương) sẽ di chuyển về phía cathode. Cuối
cùng, mỗi ampholyte trong hệ thống sẽ tới vị trí có giá trị pH bằng với điểm đẳng điện
của nó trong gel. Khi điều này xảy ra các ampholye lúc này sẽ không có điện tích và
chúng không thể tiếp tục di chuyển trong gel. Kết quả của quá trình này là sau một
khoảng thời gian điện di thích hợp nồng độ của ampholyte sẽ có vai trò như một hệ
đệm cục bộ để thiết lập độ chênh pH ổn định trong gel polyacrylamide. Độ chênh pH
này chính là cơ sở để phân tách đại phân tử có sẵn trong hệ thống (hoặc được đưa vào
hệ thống sau đó).

Protein ở trong hệ thống hoạt động giống với các ampholyte ở chỗ sự di chuyển phụ
thuộc vào điện tích của chúng. Khi các ampholyte thiết lập độ chênh pH trong gel thì
các protein trong hệ thống cũng bắt đầu di chuyển về các cực tương ứng đến khi giá trị
pH của chúng bằng giá trị pH trong gel, tại đây chúng không mang điện tích âm nữa (pI
của protein). Tại điểm này lực tác dụng lên protein gây bởi anode và cathode có giá trị
bằng nhau và protein không còn khả năng di chuyển trong hệ thống. Trong thực tế các
loại protein khác nhau trong gel sẽ hội tụ tại các vị trí cụ thể trong gel thỏa mãn điều
khiện giá trị pH tại ví trí đó bằng giá trị pI của chúng.

Vậy, làm thế nào để xác định quá trình phân tách điện di đã hoàn thành hay chưa? Như
đã nói ở trên, quá trình phân tách kết thúc khi giá trị pI của ampholyte và protein đạt
tới giá trị pH trong gel khi đó chúng không thể di chuyển được nữa. Khi protein và
ampholyte không còn di chuyển thì dòng điện trong hệ thống sẽ giảm xuống một cách
đáng kể. Điện di đẳng điện hội tụ được thực hiện với sự có mặt của ampholyte với nồng
độ rất thấp (2-4%), nên điện áp cao (150V/cm 2) có thể được cấp cho hệ thống mà
không sinh ra lượng nhiệt vượt quá mức cho phép (lượng nhiệt sinh ra do dòng lớn). Vì
phương pháp này được thiết kế để phân tách protein dựa trên nguyên tắc điểm đẳng
điện nên ta phải chú ý tới một vấn đề đó là hệ số ma sát trong việc phân tách các đại
phân tử, nói cách khác kích thước lỗ của gel phải đủ lớn để sao chỗ các đại phân tử có
thể di chuyển tự do tới vị trí điểm đẳng điện của chúng. Nếu kích thước lỗ của chất nền
giới hạn tốc độ di chuyển của các protein có khối lượng phân tử lớn thì điểm đẳng điện
sẽ ảnh hưởng nhiều hơn tới quá trình phân tách. Khi gel polycrylamide được sử dụng
trong quá trình này thì nồng độ acrylamide trong gel không được vượt quá 8%. Nếu
muốn bạn có thể thực hiện điện di đẳng điện hội tụ bằng cách sử dụng phiến chất nền
với vật liệu khác ví dụ agarose hoặc chất nền dạng lỏng trong đó có sử dụng độ chênh
lệch mật độ sucrose làm tác nhân khử đối lưu. Trên thị trường có sẵn ampholte với rất
nhiều dải pH khác nhau phục vụ cho việc phân tách các phân tử theo yêu cầu (vd, pH
3-5, pH 2-10, pH 7-9…). Trước đây, điện di hội tụ đẳng điện thực hiện trong dạng phiến
đã được sử dụng rộng rãi chỉ như một kỹ thuật phân tích. Gần đây thì hệ thống điện di
hội tụ đẳng điện đã được cải tiến cho phép nó có thể được sử dụng trong việc chuẩn bị
vật liệu (preparative) với tỷ lệ xích lớn và không biến tính bằng cách sử dụng môi
trường điện di là chất lỏng có tác nhân khử đối lưu thay cho việc sử dụng phiến gel.

Điện di trên gel Agarose: Điện di trên gel agarose là kỹ thuật được sử dụng để xác
định kích thước của acid nucleic có khối lượng phân tử cao (ADN và ARN). Agarose là
chuỗi polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi galactose và 3,6-galactose khan
(anhydrogalactose) được liên kết thông qua liên kết glycosidic, agarose được tách chiết
từ tảo biển. Polyme agarose có thể chứa tới 100 đơn vị monomer, với khối lượng phân
tử trung bình vào khoảng 10000 Da. Agarose được đúc bằng cách hòa tan bột agarose
trắng trong dung dịch đệm có chứa EDTA và Tris-acetate hoặc Tris-borate (hệ đệm TAE
hoặc TBE tương ứng). Khi hỗn hợp được gia nhiệt tới gần nhiệt độ sôi thì bột agarose
hòa tan trong đệm tạo thành một dung dịch trong suốt. Sau đó dung dịch được làm làm
mát tới nhiệt độ phòng, liên kết hydro trong và giữa các đơn vị polygalactose trong
dung dịch sẽ hình thành nên loại gel rắn với kích thước lỗ tương đối đồng nhất. Quá
trình polyme hóa này không liên quan đến các phản ứng hoá học, không giống như quá
trình xảy ra đối với gel polyacrylamide đã mô tả bên trên.

Cũng giống như đối với gel polyacrylamide, kích thước lỗ của gel agarose cũng có thể
được kiểm soát bằng cách thay đổi phần trăm của agarose hòa tan trong dung dịch. Với
phần trăm agarose cao (3% wt/wt) sẽ thu được gel có kích thước lỗ lớn hơn loại có
nồng độ thấp hơn (0.8% wt/wt). Phần trăm của agarose sẽ quyết định kích thước của
các phân tử khác nhau có thể được xử lý trong quá trình điện di; gel có nồng độ
agarose cao (kích thước lỗ nhỏ) có thể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong
khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn.
Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose với nồng độ agarose khác nhau được liệt
kê trong bảng 3.

Sau khi dung dịch được đun nóng để hòa tan agarose chúng sẽ được làm lạnh ngay tức
khắc và và được đổ vào khuôn dạng phiến bịt kín một đầu cùng với Teflon hoặc hoặc
lược nhựa. Sau khi quá trình polymer hóa dung dịch kết thúc lược nhựa sẽ được lấy ra
khỏi gel để lại các lỗ gọi là các giếng, và mẫu ADN hoặc ARN sẽ được tra vào các giếng
đó. Gel sau đó sẽ được đưa vào buồng điện di và được để  hoàn toàn trong đệm TAE
hoặc TBE (các đệm được sử dụng để đúc gel). Tiếp theo mẫu acid nucleic sẽ được trộn
với một hệ đệm nhớt (chứa 30% glycerol) có chứa thuốc nhuộm đánh dấu dùng để theo
dõi quá trình điện di. Chất đánh dấu Bromphenol màu xanh sẽ di chuyển bằng vận tốc
di chuyển của 1 phân tử ADN khoảng 500 bp, trong khi xylene cyanole sẽ di chuyển với
vận tốc của một phân tử ADN 4000 bp.

Các mẫu acid nucleic được đưa vào các giếng của gel, mẫu ADN đã biết trước khối
lượng phân tử (số bp) cũng được đưa vào một trong các giếng đó. Mẫu chuẩn này được
sử dụng để xác định kích thước của mẫu acid nucleic chưa biết sau khi kết thúc quá
trình phân tách điện di (xem bên dưới). Nhớ rằng ADN tích điện âm, do đó cathode
(điện cực âm) nên được đặt ở phía gần với khu vực giếng đặt mẫu trong khi anode
(điện cực dương) nên được đặt tại vị trí đối diện. Điện áp có giá trị khoảng 4 đến 6 V/m
sẽ được cấp cho hệ thống (tạo ra dòng (50-70mA), quá trình điện di sẽ tiếp diễn tới khi
chất đánh dấu màu xanh bromophenol chạm tới một đầu của gel. Cần phải chú ý rằng
điện di trên gel agarose không giống với SDS-PAGE ở chỗ là nó không sử dụng gel cô
(stacking gel). Vì acid nucleic trong mẫu có ma sát trên gel lớn hơn so với ma sát trên
hệ đệm có trong giếng, do đó chúng nhanh chóng tập trung tại mặt tiếp giáp giữa gel
và bộ đệm trước khi đi vào trong chất nền.

Làm thế nào để quan sát các acid nucleic sau quá trình điện di? Ethidium
bromide là một chất nhuộm huỳnh quang có khả năng xen vào giữa các bazơ acid
nucleic xếp song song (ví dụ, ADN xoắn kép). Kết thúc quá trình điện di, gel được đặt
trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE có chứa ethidium bromide để chất này khuếch tán
vào trong gel và liên kết với các acid nucleic. Tiếp theo là quá trình tẩy nhuộm ngắn
trong  đệm không chứa ethidium bromide (để loại bỏ ethidium bromide khỏi bề mặt của
gel ở những nơi mà không có acid  nucleic), sau đó gel được soi dưới ánh sáng tia cực
tím (UV – có bước sóng 256-300 nm) làm lộ ra các đoạn acid nucleic có băng huỳnh
quang màu cam hoặc hồng trên gel. Các băng huỳnh quang này được ghi lại bằng việc
chụp ảnh gel trong một buồng tối trong khi gel được chiếu án sang UV. Sử dụng một bộ
lọc để lọc các tia cực tím do đó hầu hết aánh sáng chiếu lên phim là từ ánh sáng huỳnh
quang phát ra từ các băng acid nucleic chứa các liên kết với edithium bromide.

Phương pháp để xác định khối lượng phân tử của một acid nucleic chưa biết hoàn toàn
giống với phương pháp xác định khối lượng phân tử protein trong SDS-PAGE. Đồ thị
hàm log của khối lượng phân tử acid nucleic với kích thước đã biết so với độ linh động
tương đối của chúng được xây dựng sẵn như một hàm chuẩn, từ đó với độ linh động
tương đối trong cùng một loại gel của các đoạn acid nucleic chưa biết ta có thể xác định
được khối lượng phân tử và số lượng cặp bazơ một cách dễ dàng dựa vào đường chuẩn
(một bazơ đơn lẻ có khối lượng trung bình xấp xỉ 320 Da còn một cặp bazơ đơn lẻ có
khối lượng phân tử cỡ 640 Da).