CÔNG NGHỆ GEN

GV: PGS.TS. Hoàng Anh Hoàng

SĐT: 0906 318 412
Email: hoang.a.hoang@hcmut.edu.vn

TpHCM, năm học 2023 - 2024

1
I. Giới thiệu chung về môn học

2
• Đánh giá:
- Thí nghiệm: 30%
- Kiểm tra giữa kỳ (tự luận): 10%
- Tiểu luận: 10%
- Thi cuối kỳ (tự luận): 50%

3
• Tài liệu học tập
• Slide bài giảng
• [1] Old, R.W. & Primrose, S.B. Principles of Gene Manipulation. Blackwell
Scientific Publication, 2008.
• [2] Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (2001) Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3rd ed., Volume 1, 2 and 3. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
• [3] Newton, C.R. & Graham, A.PCR. Oxford: BIOS Scientific Publishers Limited,
1994.
• [4] Bernard R., Glick, Jack J. Pasternak. Molecular Biotechnology – Principles and
Application of Recombinant DNA. American Society of Microbiology,
Washington, DC, 2010.
• [5] Watson JD, Baker TA, Bell SP, et al. (2014)– Molecular Biology of the Gene.
Pearson Education, Inc., 7th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• [6] Gerstein AS- Molecular Biology Problem Solver (A laboratory Guide). Wiley-
Liss, Inc., 2001.
• [7] Gellissen G (2005) Production of recombinant proteins. Willey-VCH Press.
• Website: http://libgen.is/
• Nguồn: Internet
4
Tìm tài liệu tham khảo trên libgen.is

5
Nội dung chính môn học
• Chương 1: Thu nhận acid nucleic
• Chương 2: Phương pháp PCR và điện di
• Chương 3: Các vector và sự tạo dòng
• Chương 4: Các phương pháp lai phân tử
• Chương 5: Xác định trình tự nucleic acid
• Chương 6: Chuyển gen ở vi sinh vật
• Chương 7: Chuyển gen ở thực vật và động vật
• Chương 8: Công nghệ protein tái tổ hợp và các
phương pháp phát hiện chẩn đoán
• Tiểu luận: Ứng dụng của công nghệ gen
6
 Chương 1
Thu nhận acid nucleic

7
I. Tổng quan
II. Các phương pháp thu nhận nucleic acid
III. Định lượng và độ tinh sạch của nucleic acid

8
I. Tổng quan
Nhắc lại về acid nucleic

• Vật liệu di truyền: prokaryote, eukaryote, virus

- prokaryote, eukaryote: DNA
- virus: DNA hoặc RNA
• Đơn phân của acid nucleic

9
I. Tổng quan
Tại sao phải thu nhận nucleic acid?
• Trong phát hiện và chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
các bệnh do virus, vi khuẩn, vi nấm,…
• Chẩn đoán ung thư
đột biến trong gene  nguy cơ bị ung thư
• Trong xét nghiệm

• Trong đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm – môi trường

• Trong nghiên cứu phát triển

10
I. Tổng quan
Thu nhận acid nucleic
• Thành (vách) tế bào: tế bào động vật v.s. tế bào thực
vật, vi khuẩn
• Màng tế bào: prokaryote v.s. eukaryote
• Các thành phần của tế bào: acid nucleic, protein, lipid,
ion,….

11
I. Tổng quan
Thu nhận acid nucleic
• Nucleic acids: DNA (hoặc RNA), plasmids

• Các loại nucleic acids có các đặc điểm hóa sinh

tương đối giống nhau (dù có cấu trúc không gian
khác nhau).
 Các phương pháp thu nhận áp dụng cho DNA
hay RNA là tương tự nhau...

Câu hỏi thảo luận: Muốn loại bỏ RNA khỏi hỗn hợp
nucleic acids DNA-RNA thì ta phải làm thế nào?
12
I. Tổng quan
Thu nhận acid nucleic
• Các bước chính
1. Ly giải tế bào
2. Phân tách nucleic acid với các thành phần khác
của tế bào
3. Thu nhận, tinh sạch nucleic acid

13
I. Tổng quan
Phân loại phương pháp

• Dựa trên thể lỏng (Solution-based DNA extraction method)

- Dung môi hữu cơ (Phương pháp phenol-chloroform)
- Enzyme (Phương pháp Proteinase K)

• Dựa trên thể rắn (Solid-based DNA extraction method)

14
II. Các phương pháp thu nhận

15
II.1. Phương pháp Phenol-chloroform
• Bước 1: Ly giải tế bào

SDS: Sodium dodecyl sulphate (detergent) ly giải màng tế bào,

màng nhân (nếu có)
Mixed micelle
Plasma membrane
(phospholipid bilayer) Detergent molecules

SDS

Phenol-chloroform: biến tính protein

Tris: tương tác với lipopolysaccharides của vách tế bào
: ổn định pH
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid): ức chế DNase
16
II.1. Phương pháp Phenol-chloroform
Bước 2: Phân tách nucleic acid với các
thành phần khác của tế bào

Lớp trên

Hỗn hợp sau ly giải Ly tâm Thu lớp trên

Lớp giữa
Lớp dưới

Lặp lại 1 – 3 lần

Lớp trên: các phân tử hòa tan (gồm cả nucleic acids)

Lớp dưới: Dung môi hữu cơ
Lớp giữa: Protein biến tính và các thành phần khác
II.1. Phương pháp Phenol-chloroform
Bước 3: Kết tủa thu nucleic acid
Before After

Dịch nổi 70% EtOH

Ly tâm Rửa Ly tâm Khô

Kết tủa

Hòa tan kết tủa

(H2O, TE, etc.)
Thêm alcohol và muối để
kết tủa nucleic acids

Nucleic acid được bảo quản trong đệm TE (Tris-EDTA Buffer); -20 oC
II.2. Phương pháp sử dụng enzyme

• Đệm ly giải gồm Tris, EDTA, SDS, và enzyme

proteinase K (thay cho phenol, chloroform).
• Mẫu được ủ với proteinase K giúp biến tính protein
có trong mẫu

19
II.3. Phương pháp dựa trên thể rắn
(s/d cột silica)
• Silica tích điện dương
• Các bước chính:
- Ly giải tế bào và gắn nucleic acid lên màng silica
- Rửa
- Rửa giải thu sản phẩm

20
Ly giải tế bào và gắn nucleic acid lên
màng silica
• Đệm ly giải chứa:
- các muối hoạt động bề mặt cao
- Proteinase K
• Quá trình gắn
nucleic acids được gắn lên màng bởi lực ion cao

21
 Quá trình rửa (Wash)

• Sau ly tâm chỉ DNA hoặc RNA được giữ lại trên
màng, còn các thành phần khác như protein,
polysaccharides,... sẽ bị rửa trôi
• Dung dịch rửa lần một thường có một lượng nhỏ
muối hoạt động bề mặt nhằm loại bỏ protein.
• Tiếp đó sẽ là bước rửa ethanol để loại bỏ muối

22
Quá trình rửa giải (Elution)
• Sử dụng đệm TE (Tris – EDTA): pH ~ 8

23
So sánh các phương pháp

Cost
+
+++
+++++

24
III. Định lượng và độ tinh sạch của
nucleic acid

25
Định lượng nucleic acid

Định luật Beer-Lambert

Độ hấp thụ quang của một dung dịch đối với một chùm sáng đơn sắc
tỉ lệ thuận với độ dày truyền quang và nồng độ chất tan trong dung dịch.

A: là độ hấp thụ quang của mẫu, không có thứ nguyên

l: là độ dày truyền quang (cm)
c: là nồng độ mẫu (µg/mL)
Ɛ: độ hấp thụ quang riêng (mL/µg•cm)
Ɛ = 0.02 đối với dsDNA
Ɛ = 0.025 đối với RNA

[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)

[RNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
26
Độ tinh sạch của nucleic acid
Nucleic acid hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm; protein hấp thụ
mạnh ở bước sóng 280 nm; các tạp nhiễm khác hấp thụ mạnh ở
bước sóng 230 nm;

Tỉ lệ A260/A280
~1.8: DNA tinh sạch
~2.0: RNA tinh sạch
<1.8: tạp nhiễm protein hoặc phenol,…

Tỉ lệ A260/A230
~2.0 – 2.2: nucleic acid tinh sạch
<2.0: tạp nhiễm phenol, alcohol, hoặc carbohydrates
Kết luận

• Nắm được vai trò của việc thu nhận nucleic acid từ
tế bào
• Các phương pháp thu nhận cơ bản; ưu nhược điểm
của từng phương pháp
• Hiểu được phương pháp định lượng và độ tinh
sạch của nucleic acid thu nhận.

28