CÁC PHƯƠNG PHÁP

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HIỆN ĐẠI
 CHÀO CÔ VÀ TẤT
CẢ CÁC BẠN
Thành viên nhóm 5:
1. Bạch Vũ Hoàng
2. Bùi Phương Linh
3. Diệp Trần Việt Khoa
4. Đặng Quốc Cường

2
PHƯƠNG PHÁP LAI
PHÂN TỬ
 NỘI DUNG
I. CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
1. Lai trong pha lỏng
2. Lai trong pha rắn
3. Lai tại chỗ

III. TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ 3 PHƯƠNG PHÁP LAI

4
CƠ SỞ CỦA SỰ LAI
PHÂN TỬ
I
 1. Khái niệm về ‘’ nhiệt độ nóng chảy ‘’ của
DNA

- Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun

lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng
chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do
sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch.

6
 2. Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ
nóng chảy” của DNA

- Ảnh hưởng của các thành phần base trong

phân tử DNA
- Ảnh hưởng của độ dài đoạn DNA
- Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch
- Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

7
 3. Khái niệm về lai phân tử

- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động
của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ
xuống đột ngột.
- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch
đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau
khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ từ cộng với điều kiện
thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại.
-> Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular
hybridization).
8
 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử

- Nồng độ DNA và thời gian phản ứng

- Nhiệt độ
- Độ dài của trình tự
- Lực ion

9
CÁC PHƯƠNG PHÁP
LAI PHÂN TỬ
II
 “
Các phương pháp lai phân tử rất đa
dạng, cơ bản có thể chia thành 3
nhóm lớn :
- Lai trong pha lỏng
- Lai trên pha rắn
- Lai tại chỗ

11
 1. Lai trong pha lỏng
a. Nguyên tắc:
- Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi
trường lỏng là 1 dung dịch đệm.
- Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp
nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường
thấp hơn Tm ít nhất vài độ.

12
b. Phân tích định lượng các phân tử lai:
- Có 3 phương pháp thường dùng
+ Phương pháp dùng quang phổ kế
+ Phương pháp dùng Nuclease S1
+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

13
 DNA mạch đôi
hấp thu ánh sáng
yếu hơn DNA
PHƯƠNG mạch đơn
PHÁP
DÙNG
QUANG
Hiệu ứng siêu sắc
PHỔ KẾ

14
 Là 1 enzyme có
khả năng thủy giải
PHƯƠNG các nucleic acid
mạch đơn
PHÁP
DÙNG
Sản phẩm:
NUCLEASE oligonucleotides
S1 hoặc nhóm
nucleotides 5’
phosphoryl

15
 Là những tinh
thể phosphate
PHƯƠNG
calci
PHÁP SẮC
KÍ TRÊN
HYDROXY
LAPATITE Sử dụng các mồi
đánh dấu để lai
với DNA, RNA
hoặc các Protein

16
c. Các ứng dụng của phương pháp lai trong dung dịch:
- Tính được tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài gần nhau.
- Phân tích các trình tự lặp lại.
- So sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại.
* Ưu và nhược điểm của lai trong pha lỏng:
- Ưu điểm: hiệu quả của quá trình lai cao, quá trình phân tích và định
lượng các phân tử lai chính xác.
- Nhược điểm: quy trình làm phức tạp, khó thực hiện; khó tách các phân
tử lai ra khỏi quá trình; có thể xảy ra sự tái bắt cặp giữa hai mạch của
cùng một phân tử.

17
 2. Lai trên pha rắn
a. Nguyên tắc:
- Cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng.
- Điểm khác biệt là 1 trong 2 trình tự bổ sung
(trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên
một giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon).

18
 * Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lai trên pha rắn:
- Ưu điểm: + Thao tác dễ dàng.
+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử.
+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân tử.
- Nhược điểm: + Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác.
+ Hiệu quả thấp.
+ Vận tốc lai trên pha rắn < 10 lần so với vận tốc lai
trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị
che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung.

19
 b. Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn:
- Lai trên pha rắn có rất nhiều ứng dụng, hiện nay có 4 phương
pháp cơ bản đó là:
+ Southern blot
+ Northern blot
+ Western blot
+ Dot (slot) blot
- Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là phương
pháp Southern, Northern và Dot blot.
20
 * SOUTHERN BLOT:

Mục đích
Phương pháp này dùng để định vị những
trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những
DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid,
phage,…

21
Sơ đồ lai Southern blot.
 Các bước thực hiện Sounthern blot

22
 * NORTHERN BLOT:

Mục đích :
nhằm xác định kích thước
và hàm lượng của 1 mRNA
đặc trưng trong 1 hỗn hợp
RNA.

23 Sơ đồ lai Northern blot

 Các bước thực hiện Northern blot

Bước 1: tách chiết và biến tính

Bước 2: thẩm tích
Bước 3: lai với mẫu dò (probe) có đánh dấu phóng xạ
Bước 4: phóng xạ tự chụp

24
* WESTERN BLOT:

Là quá trình proteinprotein

kết hợp đặc hiệu với nhau.
Thường sử dụng Antibody
protein có gắn phóng xạ
hoặc gắn lưu huỳnh để phát
hiện protein

Mục đích : dùng để phát

hiện protein

25 Sơ đồ lai WESTERN BLOT

26
 Southern blot

ĐIỂM KHÁC
NHAU CỦA 3 Northern blot
PHƯƠNG PHÁP

Western blot

27
 Southern Blot Northern Blot
Trích DNA từ tế bào Trích RNA từ tế bào
Cắt với enzyme giới hạn Làm biến tính với
formaldehyde
Chạy trên gel (dùng agarose) Chạy trên gel (dùng agarose)
DNA mang gene X có tính phóng xạ DNA mang gene X có tính
phóng xạ
Làm biến tính DNA
Chuyển lên màng nitrocellulose (bằng hoạt Chuyển lên màng
động mao dẫn) nitrocellulose (bằng hoạt động
mao dẫn)
Tắc nghẽn với DNA dư protein dư Tắc nghẽn với RNA dư
Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu Lai với mẫu dò DNA được
đánh dấu
Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết (dưới Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa
sự kiểm soát nghiêm ngặt) được liên kết (dưới sự kiểm
soát nghiêm ngặt)
Phóng xạ tự ghi Phóng xạ tự ghi
28
Western Blot
Trích protein từ tế bào
Làm biến tính SDS
Chạy trên gel (dùng polyacrylamide)
Kháng thể chống lại protein X đã được
đánh dấu phóng xạ hay enzyme
Chuyển lên màng nitrocellulose thường
di chạy điện di
Tắc nghẽn với protein dư
Lai với mẫu dò kháng thể được đánh
dấu
Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên
kết
Phóng xạ tự ghi hay thể hiện rõ với chất
nền có màu
 * DOT VÀ SLOT BLOT:

- Cho phép định lượng tương đối một DNA hay RNA đặc trưng
trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra.
- Kỹ thuật Dot (dot là khe) đơn giản hơn nhiều so với các phương
pháp khác vì:+ Không cần giai đoạn cắt bởi những enzyme cắt giới
hạn.
+ Không cần chạy điện di.
- Kỹ thuật Dot được dùng trong nghiên cứu những đoạn DNA
ngắn.

29
 3. Lai tại chỗ
a. Nguyên tắc:
- Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai Southern blot.
- Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể) để lai với
ADN, ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết.
* Ứng đụng: Định vị gen trên NST, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu
một RNA chuyên biệt trong tế bào và mô

Lai trên nhiễm sắc thể

Cách phương pháp
Lai trên khuẩn lạc
thực hiện
Lai trên tế bào và mô
30
 * LAI TRÊN NGHIỄM SẮC
THỂ
Các NST ở giai đoạn trung kì được xử
lí bằng các kỹ thuật tế bào học trên
lame. 

NST cố định trên lame được đem lai

với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.

Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ

phủ lên lame mô ̣t huyền dịch
(emulsion) nhạy cảm với tia xạ

Sau mô ̣t thời gian cho tia xạ tác động lên

huyền dịch. Lame được quan sát dưới
kính hiển vi, kết quả thể hiện thành
những hạt nằm trong lớp huyền dịch
ngay trên vị trí có phân tử lai.
31
 * LAI TRÊN KHUẨN LẠC

 Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai.
 Màng lai sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính
DNA
 Cố định DNA trên màng và tiến hành các phương pháp lai như các phương pháp
lai pha rắn khác.
 Kết quả phép này xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp petri ban đầu. Dòng
này sẽ được thu nhận và phân tích

32
* LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MÔ

MỤC ĐÍCH:
Trong tế bào và mô, các RNA,
đặc biệt là các mRNA có sự phân
bố không gian xác định. Sự phân
bố không gian này liên quan đến
chức năng điều hòa cũng như
tương tác giữa mRNA với các
thành phần khác của tế bào và
mô. Để nghiên cứu trên mRNA đã
tách chiết và tinh sạch không cho
phép thu nhận các thông tin vừa
kể, người ta dùng phương pháp lai
trên tế bào và mô.
Mô được xử lí bằng phương
pháp mô học (cố định, khử
nước ; tẩm parafin, cắt
thành những lát mỏng từ 7
đến 10 micromet trải trên
lame). Kết quả được đọc
trực tiếp trên lame nhờ kính
hiển vi.

33
 * Ứng dụng:

- Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp này giúp định vị chính xác vị trí và
sự phân bố của một mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức.
- Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, giúp phát hiện đồng thời
mRNA và protein của nó xác định được mối tương qua giữa hoạt động phiên
mã và dịch mã của một gen
- Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần như đồng nhất với nhiều mẫu dò
khác nhau xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA tham gia vào
một quá trình sống.

34
TỔNG KẾT KHÁI QUÁT
VỀ 3 PHƯƠNG PHÁP LAI
III
 * PHÂN BIỆT
Lai trong pha lỏng
- Các trình tự bổ sung (các
mạch đơn) nằm trong môi
trường lỏng là 1 dung dịch
đệm.
Nguyên
-Sự lai phân tử này chỉ xảy
tắc
ra khi các trình tự này gặp
nhau do chuyển động nhiệt
và khi nhiệt độ môi trường
thấp hơn Tm ít nhất vài độ.
- Phương pháp dùng quang
Phương phổ kế.
pháp sử - Phương pháp dùng
dụng phổ Nuclease N1.
biến - Phương pháp sắc kí trên
hydroxylapatite.
36
Lai trên pha rắn
- Giống pha lỏng điểm khác
biệt là 1 trong 2 trình tự bổ
sung (trình tự đích, trình tự
cần tìm) được cố định trên một
giá thể rắn (màng
nitrocellulose hay nylon).
- Vì thế vận tốc lai trên pha
rắn kém gấp 10 lần vận tốc lai
trên pha lỏng
- Southern blot
- Northern blot
- Western blot
- Dot (slot) blot
Lai tại chỗ
-Lai tại chỗ được phát triển từ
phép lai Southern blot.
-Kỹ thuật này sử dụng các mồi
đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc
kháng thể) để lai với ADN,
ARN hoặc với các protein ở
trong các tế bào mà không cần
tách chiết.
- Lai trên khuẩn lạc.
- Lai trên nhiễm sắc thể.
- Lai trên tế bào và mô
 * PHÂN BIỆT
Lai trong pha lỏng
- Tính tỉ lệ % các trình tự giống
nhau ở 2 loài gần nhau.
- Phân tích các trình tự lặp lại
- So sánh kích thước các bộ
Ứng gen không chứa trình tự lặp lại
dụng
37
Lai trên pha rắn
- Lập bản đồ giới hạn của một gen.
- Phát hiện các đa dạng trình tự
(fragment polymorphism) của cùng
một gen ở các chủng hay các cá thể
khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới
hạn của chúng.
- Phát hiện các đột biến mất đoạn,
đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một
gen vì chúng làm thay đổi bản đồ
giới hạn.
Lai tại chỗ
- định vị chính xác vị trí và sự phân
bố của một mRNA trong một nhóm
tế bào chuyên biệt của tổ chức.
- xác định được mối tương qua giữa
hoạt động phiên mã và dịch mã của
một gen
- xác định vị trí, sự phân bố và
tương tác giữa các mRNA tham gia
vào 1 quá trình sống.
 “
Kết luận chung về tầm quan trọng:
- Lai xuyên loài.
- So sánh kích thước các bộ gen không
chứa các trình tự lặp lại.
- Lập bản đồ giới hạn của 1 gen, phát hiện
các đột biến.
- Tìm hiểu sự phân bố của mRNA, ảnh
hưởng đến chức năng, sự điều hòa biểu
hiện và sự tương tác của chúng đến các
thành phần khác của tế bào và mô.

38
 Cảm ơn cô và
các bạn đã lắng
nghe!

39