Họ và tên: Lê Đức Sơn

Mã SV: 16000615
Lớp: K61 CNSH
Ca thực hành: Thứ 6 , 9h30-11h
BÁO CÁO THỰC HÀNH NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Bài 1: Quy trình hoạt hóa màng
1. Mục đích
- Gắn các đầu dò đặc hiệu lên màng. Đây là bước đầu tiên cho phép màng lai có thể tạo cặp
bổ sung với sản phẩm PCR đặc hiệu.
2. Cơ sở lý thuyết
- Đầu dò oligonucleotide allele đặc hiệu là một đoạn oligonucleotide dài 15-21 nucleotides và
được thiết kế bổ sung đặc hiệu với một allele ở trong hệ gen.

Cấu trúc của oligonucleotide amino-linker và spacer arm.

- Cấu trúc của một đầu dò:

● Đầu 5’- NH2: Giúp đầu dò có thể liên kết với gốc COO- trên màng lai.
● Vùng Spacer Arm gồm 12 gốc Carbon: tăng tính linh hoạt của đầu dò, giúp cho việc
“tìm kiếm” những đoạn DNA đặc hiệu trong dung dịch lai tốt hơn.
● Vùng oligo: là vùng có trình tự nucleotides được thiết kế để lai đặc hiệu với sản phẩm
PCR. Tính đặc hiệu cao đến mức sai khác một nucleotide cũng ảnh hưởng lớn tới khả
năng bắt cặp. Nhờ vậy mà kỹ thuật lai điểm ngược này có thể phát hiện những allen
đột biến dù chỉ một nucleotide.
- Màng được sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngược là màng nylon Biodyne C tích điện âm (do
các gốc COO-).
- Các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC thành dạng O-acylurea. Dạng chất
trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide bền
vững.
 3. Hóa chất, dụng cụ
chất cụ

- Dụng dịch NaHCO3 0.5M pH8.4 - Panh kẹp, đĩa nhựa.

- Dung dịch HCl 0.1N - Đồng hồ bấm giờ.
- Dung dịch hoạt hóa màng EDC 16% - Pipet 1000, pipet 10
- Đầu dò Cd 41/42 N 0.5µM - Đầu côn loại 1000µl, 10µl
- Đầu dò Cd41/42M 7.5µM - Túi zip
- Đối chứng dương P+ 0.5µM - Bút, kéo
- Đối chứng âm P- 1µM - Đá
- Nước cất.

4. Cách tiến hành

- Đánh dấu chiều của màng bằng cách cắt chéo góc trên
bên trái. Lấy bút chấm các điểm trên màng lai để chia
khu vực cho từng đầu dò (xem ảnh bên).
Chú ý: không được chạm trực tiếp vào giữa màng lai
vì có thể sẽ làm “bẩn” màng, khiến cho quá trình gắn
đầu dò lên màng là không tốt.
- Để màng vào trong đĩa nhựa, thêm khoảng 1.5ml HCl
0.1N. Đậy nắp và lắc nhẹ, ủ 3’ ở nhiệt độ phòng.
- Dùng pipet 1000 hút bỏ dung dịch HCl, sau đó thêm
vào khoảng 2ml nước cất để rửa màng (để ngâm
khoảng 30s).
- Thêm vào đĩa nhựa 2ml dung dịch EDC, ủ 15’ ở nhiệt độ phòng. Trong lúc ủ có thể lắc nhẹ
đĩa để dung dịch EDC được phủ đều trên bề mặt màng.
- Rửa màng với nước và để đến khô ở nhiệt độ phòng.
Chú ý: màng cần được khô hoàn toàn rồi mới tiến hành nhỏ (dot) đầu dò lên. Nếu màng chưa khô,
đầu dò khi nhỏ lên có thể loang ra không đều, dẫn tới các nốt bị xấu.
- Dot 1µl đầu dò và đối chứng lên màng theo đúng vị trí đã định sẵn. Khi thao tác, ta cần đẩy
dung dịch đầu dò ra, tạo thành giọt nhỏ hình tròn trên đầu pipet. Sau đó chấm vuông góc
 lên màng lai. Nhờ vào lực mao dẫn mà dung dịch đầu dò sẽ được thấm xuống và tỏa đều ra
xung quanh, tạo thành hình tròn.
- Để khô màng 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ủ màng với 1.5ml NaOH 0.1N trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Để màng khô hoàn toàn, sau đó cho vào túi zip và bảo quản ở 4oC để tránh ẩm.
5. Giải thích
- Dung dịch HCl tạo tính acid cho màng, giúp các gốc COO- trên màng dễ dàng tương tác với
EDC.
- Tác dụng của EDC:

Quá trình liên kết đồng hóa trị giữa đầu dò amino và gốc carboxyl.

Chúng có tác dụng như một chất xúc tác. Ban đầu liên kết với các gốc COO- trên màng và
làm thay đổi điện tích của nhóm này. Nhờ vậy mà các gốc COO- có thể dễ dàng liên
kết với phân tử amin bậc 1 có trên đầu dò.
- Dung dịch NaOH có tác dụng loại bỏ các gốc COO- thừa đã được hoạt hóa nhưng không
được gắn với đầu dò. Nếu không loại bỏ những những gốc hoạt hóa này thì chúng sẽ rất dễ
phản ứng với bất kỳ tác nhân nào có trong dung dịch, làm giảm độ nhạy của kỹ thuật lai.
- Đối chứng dương P+:
+ Đây là những oligonucleotide ngắn, có gắn với biotin.
+ Kiểm tra quá trình gắn mồi vào màng.
+ Kiểm tra cơ chất có hoạt động hay không.
+ Nếu những điều kiện trên là tốt, khi lai màng P+ sẽ lên màu xanh.
- Đối chứng âm P-:
+ Đây là những đoạn oligonucleotide ngắn không có biotin nhưng có khả năng tương tác
với vùng bảo thủ của chỗ nối intron-exon trong sản phẩm PCR.
+ Kiểm tra xem mồi có tương tác được với sản phẩm PCR hay không.
+ Nếu sự tương tác này là tốt, đối chứng âm sẽ cho màu xanh sau khi lai màng.
- Nồng độ đầu dò đưa lên màng (đơn vị: µM ; thể tích đưa lên màng: 1µl/đầu dò).
+ Cd41/42N: 0.5
+ Cd41/42M: 7.5
+ P+ : 0.5
+ P-: 1

6. Trả lời câu hỏi cuối bài

Câu 1: Tại sao phải dùng cả mồi đột biến và mồi thường biến. Nêu lý do các mồi có nồng độ
khác nhau?
Sử dụng cả mồi đột biến và mồi thường biến là để xác định xem trong mẫu bệnh phẩm
có chứa đồng thời cả allen đột biến và allen gây bệnh hay không. Điều này sẽ giúp xác
định kiểu gen của người đó là bình thường, đồng hợp đột biến hay di hợp.
- Nếu chỉ mồi N (normal) bắt màu thì người này là bình thường.
- Nếu chỉ mồi M (mutant) bắt màu thì người này là đồng hợp bệnh.
- Nếu cả 2 mồi đều lên màu tức là người này dị hợp về allen đột biến đó.
Lý do các mồi có nồng độ khác nhau:
- Dù rằng mồi bắt cặp rất đặc hiệu, dù chỉ khác nhau một nucleotide cũng đã ảnh
hưởng đến việc mồi và sản phẩm PCR có bắt cặp được hay không.
- Tuy nhiên, điều này không có nghĩa là không hề có sự bắt cặp nhầm. Và để tối ưu
quá trình bắt cặp này, nồng độ mỗi mồi phải được điều chỉnh để có thể tương tác đặc
hiệu với sản phẩm PCR.

Câu 2: Tìm vị trí đột biến trong bài trên gene beta-globin của hồng cầu người ?
 Vị trí của các đầu dò trên trình tự gene HBB ở người.

Tên đầu dò Trình tự 5’-3’

CD17 N NH2-C12-GTGGGGCAAGGTGAACGTG
CD17 M (A=>T) NH2-C12-GTGGGGCTAGGTGAACGTG
CD26 N NH2-C12-CAGGGCCTCACCACCA
CD26 M NH2-C12-TTGGTGGTAAGGCCCT
CD41/42 N NH2-C12-CCCAGAGGTTCTTTGAGTCC
CD41/42 M (-TCTT) NH2-C12-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG

Nhận xét:
- Những vị trí khác biệt giữa 2 loại đầu dò được bôi màu đỏ.
- Vị trí Cd17 xảy ra đột biến điểm thay thế nucleotide A thành T.
- Vị trí Cd41/42 xảy ra đột biến mất 4 nucleotides TCTT.
- Theo như trong tài liệu thực hành, vị trí Cd26 sẽ xảy ra đột biến điểm thay thế 1 nucleotide.
Tuy nhiên trình tự đầu dò bình thường và đầu dò đột biến khác nhau rất nhiều. Thậm chí
còn không tìm ra vị trí của đầu dò Cd26 N trên gen HBB.
- Nghi ngờ đã cho sai trình tự đầu dò Cd26 N.
 Bài 2: Quy trình đánh dấu biotin
1. Mục đích
- Đánh dấu đoạn DNA có chứa đột biến mà ta cần xác định.
- Việc đánh dấu này là nhờ vào phản ứng PCR cùng với sự tham gia của các nucleotides
dUTP có gắn chất phát huỳnh quang biotin.
2. Cơ sở lý thuyết
- Về bản chất, đây vẫn là phương pháp PCR thông thường. Chỉ khác ở chỗ phản ứng PCR
đánh dấu Biotin sẽ được bổ sung thêm một loại nucleotide tự do khác có gắn biotin trên
phân tử bazơnitơ.
- Cấu trúc của nucleotide dUTP có gắn biotin:
+ Phần cấu trúc điển hình của một dUTP: 3 gốc phosphate, đường ribose, bazơ nito uridine.
+ Gốc biotin ở cuối.
+ Phần “đuôi” gồm 11 gốc carbon, nối phân tử biton với gốc bazonito uridine. Bởi lẽ phân
tử biotin có cấu trúc khá cồng kềnh, và để DNA polymerase có thể bám được với
dUTP thì cần phải có cầu nối, đảm bảo tính linh hoạt.

Cấu trúc của nucleotide dUTP-11-Biotin.

Cấu trúc của các bazơnitơ.

 Cấu trúc phân tử biotin-11-dCTP (trái) và biotin-11-dATP (phải).

3. Hóa chất và dụng cụ

chất cụ

- Hệ genome được tách chiết từ hồng - Ống eppendrof 200µl

cầu người mang bệnh thiếu máu. - Pipet 10
- Mồi ASO-β-F 1µM - Máy PCR
- Mồi ASO-β-R 1µM
- dNTPs 2mM mỗi loại
- Dream Taq polymerase (5U/µl)
- Đệm Dream Taq polymerase 10X
- Biotin-11-dUTP 1mM

4. Cách tiến hành

Bài thực hành này sinh viên không phải làm. Tuy nhiên ta vẫn cần phải biết các phản
ứng PCR đã làm cũng như thành phần cho từng phản ứng.
Phản ứng đánh dấu Phản ứng không đánh dấu

Thành phần Thể tích (µl) Thành phần hể tích (µl)

Buffer Dream 3.0 Buffer Dream 1.5

C,G)TP 1mM 2.0 s 2mM 0.5

1mM 1.2

n-11-dUTP 1mM 0.8

 β-F 1µM 6 β-F 1µM 3

ASO-β-R 1µM 6 β-R 1µM 3

m Taq (5U/µl) 0.2 m Taq (5U/µl) 0.1

tổng số 40-50 ng tổng số 40-50 ng

Tổng 30 Tổng 15

5. Giải thích
Nồng độ dTTP lớn hơn Biotin-11-dUTP là để hạn chế việc biotin được gắn quá nhiều, dẫn
tới bắt cặp với lượng lớn enzyme alkaline-phosphatase. Khi đưa cơ chất vào sẽ lên
màu xanh quá đậm. Tỷ lệ dTTp/dUTP-biotin là 3/2.
6. Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR ?
Thành phần Vai trò

oãng nồng độ các dung dịch về nồng độ cuối tối ưu nhất cho phản ứng
Nước
PCR.

ng dịch đệm thích hợp cho phản ứng, đặc biệt là cho hoạt động của taq
Buffer Dream
polymerase. Vai trò chính của nó là ổn định pH của môi trường.

ucleotide tự do:
- d(A,C,G)TP cấp các nucleotide tự do cho phản ứng tổng hợp sợi DNA mới.
- dTTP

cấp nucleotide tự do có gắn phóng xạ. Cần thiết cho việc đánh dấu biotin
Biotin-11-dUTP
sản phẩm PCR.

Mồi à mồi xuôi và mồi ngược. Chúng sẽ gắn vào vị trí đặc hiệu trên đoạn DNA
- ASO-β-F khuôn và làm vị trí khởi đầu cho taq polymerase gắn các nucleotide tự
- ASO-β-R do vào.
 me bền nhiệt có khả năng gắn các nucleotide tự do vào đầu 3’OH của mồi.
Dream Taq
Nhờ vậy tổng hợp được đoạn DNA mới.

DNA tổng số n cho phản ứng PCR.

Câu 2: Tại sao biotin lại được gắn vào các đoạn DNA được tổng hợp lên ?
- Biotin được dùng để đánh dấu sản phẩm PCR. Nhờ vậy, ta có thể dễ dàng phát hiện được vị
trí của những đoạn DNA này.
- Ở bài này, sản phẩm PCR sau đó sẽ được lai với màng. Do vậy, nhờ việc đánh dấu biotin, ta
có thể biết được đầu dò và sản phẩm PCR có lai được với nhau hay không.
Câu 3: Tại sao phải có hai phản ứng, một đánh dấu và một không đánh dấu biotin?
- Khi làm thí nghiệm, phải luôn có dối chứng để kiểm tra các bước làm hay toàn bộ thí
nghiệm có xảy ra đúng như mong đợi hay không.
- Ở đây, mẫu không đánh dấu có vai trò như một mẫu đối chứng âm, giúp kiểm tra xem có
thực sự những nucleotide gắn biotin đã được gắn vào sản phẩm PCR hay không. Và việc
điện di kiểm tra là điều chắc chắn phải làm.
Câu 4: Kết quả kỳ vọng ?
- Những đoạn DNA có gắn biotin sẽ có khối lượng lớn hơn đoạn DNA cùng kích thước
nhưng không gắn biotin. Do vậy, khi điện di, mẫu có gắn biotin sẽ chạy chậm hơn so với
băng DNA của mẫu không gắn biotin.
- Đồng thời, tỉ lệ gắn của nucleotide-biotin vào mỗi sợi DNA là khác nhau. Do vậy khi điện
di, tuy cùng 1 sản phẩm PCR những có thể tạo thành nhiều băng khác nhau.

Câu 5: Xác định độ dài đoạn PCR ở gene beta-globin được nhân lên bởi hai mồi.
Vị trí của cặp mồi ASO trên gene HBB. Mồi ASO-F: màu xanh lá ; mồi ASO-R: màu đỏ.
Mồi ASO-F, kích thước: 20 nucleotides.
Trình tự trên gene 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’
Trình tự mồi 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’
Mồi ASO-R, kích thước: 23 nucleotides.
3’-AAC GGG TAT TGT CGT AGT CCT CA-3’
Trình tự trên gene
5’-TTG CCC ATA ACA GCA TCT GGA GT-3’
Trình tự mồi 5’-GTT GGC CTA AAC GCA TCA GGA GT-3’

Nhận xét:
- Độ dài đoạn DNA được khuếch đại: 159bp.
- Những vị trí không bắt cặp giữa mồi và khuôn được bôi màu đỏ.
- Mồi ASO-R có đến 5 nucleotides không bắt cặp. Điều này có thể là để điều chỉnh cho Tm
của 2 mồi ASO-F và ASO-R không bị chênh nhau quá nhiều, giúp việc chuẩn điều kiện
PCR là tốt hơn. Năm nucleotides không bắt cặp này nằm gần đầu 5’ của mồi nên cũng
không ảnh hưởng nhiều tới khả năng khuếch đại của taq polymerase.
 Bài 3: Phản ứng ARMS-PCR
1. Mục đích
- Xác định đột biến điểm trên gene beta-globin ở người thông qua phương pháp ARMS-PCR.
- Nhờ vào mồi đặc hiệu cho allen bình thường và allen đột biến, ta có thể biết được kiểu gen
của mẫu bệnh phẩm này là bình thường, đồng hợp đột biến hay dị hợp.
- So sánh kết quả PCR với kết quả lai màng để biết quá trình thí nghiệm có bị sai, phương
pháp nào là tốt hơn.
2. Cơ sở lý thuyết
- Phương pháp này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’của mồi
bắt cặp bổ sung với nucleotide trên sợi khuôn. Nếu không thì DNA polymerase sẽ không
thể tổng hợp được.
- Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide ở đầu 3’ của mồi phải mang tính đặc hiệu.
- Khi bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai tại một trong 5 nucleotide cuối cùng của mồi làm tăng
tính đặc hiệu của sản phảm.
3. Hóa chất và dụng cụ
chất cụ

- DNA tổng số được tách chiết từ hồng - Ống eppendrof 200µl

cầu người mang bệnh thiếu máu. - Pipet 10
- Mồi 95 NF 10µM - Máy PCR
- Mồi Control R 10µM
- Mồi 41/42 NF 10µM
- Mồi 41/42 MR 10µM
- dNTPs 2mM mỗi loại A,T,G,C
- Gotaq Master Mix 2X

4. Cách tiến hành

Ta sẽ tiến hành thực hiện 3 phản ứng PCR, một với mồi đột biến và 2 phản ứng với mồi
bình thường. Trong đó, một phản ứng với mồi bình thường sẽ được dùng để làm đối
chứng âm.
Ta chọn đối chứng âm chứa mồi bình thường là do lo sợ bị nhiễm DNA mang allen lành
từ môi trường xung quanh. Do hầu hết mọi người đều không bị bệnh β-Thalassemia nên
 mỗi cơ thể đều sẽ có ít nhất một allen bình thường. Vì vậy, rất dễ bị nhiễm DNA mang
allen lành và làm cho kết quả PCR là không chính xác.

Phản ứng với mồi bình thường (2 phản ứng)

Thành phần phản ứng (µl) Nồng độ cuối Master mix x2

4 8

q Master Mix 2X 7.5 1X 15

F 10µM 0.3 0.2µM 0.6

NF 10µM 0.4 0.26µM 0.8

ol R 10µM 0.8 0.53µM 1.6

T108
2 30-40ng
0ng)

Tổng 15 26

Sau đó, chia hỗn hợp master mix ra 2 ống phản ứng và thêm vào các thành phần như trong sau:
Mẫu Đối chứng âm (-) Mẫu N
Thể tích ban đầu 13 13
Thêm vào phản ứng
Nước Không thêm nước
2µl nước.
Thêm vào phản ứng
DNA Không thêm DNA
2µl DNA T108
Tổng 15 15
Đơn vị: µl.
Phản ứng với mồi đột biến (mẫu M)
Thành phần Thể tích (µl) ồng độ cuối

3.5
 q Master Mix 2X 7.5 1X

F 10µM 1.0 0.66µM

MR 10µM 0.4 0.26µM

ol R 10µM 0.6 0.4µM

T108
2.0 30-40ng
0ng)

Tổng 15

Điều kiện cho phản ứng PCR:

- Mồi bình thường:
Nhiệt độ (oC) 4 4 8 2 2 0

Thời gian s s 0s

40 chu kỳ

- Mồi đột biến:

Nhiệt độ (oC) 4 4 8 2 0

Thời gian s 7s 0s

30 chu kỳ
5. Vấn đề gặp phải
Sau khi pha xong mastermix, do giữ ống phản ứng quá chặt nên đã vô tình bóp thủng
ống, dẫn tới thất thoát thể tích. Vì vậy, khi chia ra thì một phản ứng đủ 13µl, một phản
ứng bị thiếu khoảng 3µl. Bọn em quyết định để phản ứng N+ bị thiếu, còn đối chứng âm
thì có đầy đủ thể tích. Phản ứng của mồi đột biến thì đủ 15µl.
6. Giải thích
Sự khác biệt về nồng độ mồi giữa các phản ứng là để tối ưu điều kiện cho PCR. Cặp mồi
95NF/Control R được thiết kế để khuếch đại vùng chứa các đột biến được nghiên cứu
(Cd17, Cd26, Cd41/42). Và do vậy, băng DNA này lại được sử dụng làm khuôn cho các
 mồi bên trong. Lưu ý, mỗi mồi bên trong lại sử dụng lượng khuôn IC khác nhau cho quá
trình tổng hợp DNA của nó.
Tùy vào nồng độ mồi mà băng IC có thể được tạo ra nhiều hay ít. Nếu băng DNA nội
kiểm quá nhiều sẽ không đủ nguyên liệu cho sự tổng hợp của các đoạn DNA bên trong.
Do vậy cần tối ưu nồng độ các mồi cho phản ứng PCR đạt hiệu quả cao.
7. Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Nêu vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR
Thành phần Vai trò

H2O Pha loãng nồng độ các dung dịch về nồng độ cuối tối ưu nhất cho phản ứng
PCR.
Hỗn hợp này có đầy đủ các thành phần cho phản ứng PCR như enzyme taq
polymerase, dNTPs, MgCl2, buffer. Các thành phần này đều đã được đưa về
aq Master Mix nồng độ tối ưu cho phản ứng. Đặc biệt, Gotaq Master Mix có chứa sẵn 2 dye
màu trong đó (vàng và xanh), giúp cho việc điện di sản phẩm PCR dễ dàng
hơn.
Đây là các mồi dùng để khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu, cho phép xác định
Mồi:
allen đột biến và allen bình thường.
- 95 NF
- Cặp mồi nội kiểm (IC) 95NF / Control R xác định sự có mặt của gen
- 41/42 NF
beta-globin trong DNA tổng số.
- 41/42 MR
- Cặp mồi 41/42NF / Control R xác định allen bình thường.
- Control R
- Cặp mồi 95NF / 41/42MR xác định allen đột biến.

DNA T108 Mẫu DNA tổng số T108, đại diện cho mẫu bệnh phẩm của một người.

Câu 2: Kết quả kỳ vọng

- Đối chứng âm (N-) không bị nhiễm.
- Vì lý do thể tích của mẫu N+ bị thiếu nên khả năng cao là sẽ không lên băng DNA. Tuy
nhiên, em cho rằng nếu đã có đủ các thành phần, dù thể tích bị thiếu thì phản ứng vẫn xảy
ra, chỉ khác ở độ đậm nhạt của băng DNA. Do vậy, em vẫn mong sản phẩm PCR sẽ lên
băng.
- Băng DNA của cặp mồi nội kiểm lên đẹp ở cả 2 mẫu N+ và M+.
- Một trong 2 băng DNA, hoặc allen đột biến hoặc allen bình thường phải lên. Khi đó, ta mới
có thể xác định được kiểu gen của người bệnh.
- Nếu băng IC hoặc băng DNA đột biến của cả 2 mẫu N+ và M+ không lên tức là phản ứng
PCR có vấn đề.
- Vì đã tối ưu nồng độ mồi nên các băng DNA nếu lên phải có độ đậm như nhau.

Câu 3: Xác định độ dài đoạn PCR ở gene beta-globin được nhân lên bởi 2 mồi.
- Cặp mồi nội kiểm 95NF/Control R: 700bp.
- Cặp mồi xác định allen bình thường của vị trí Cd41/42: 41/42NF/Control R - 355bp.
- Cặp mồi xác định allen đột biến của vị trí Cd41/42: 95NF/41/42MR - 405bp.

Vị trí các mồi trên gen beta-globin và kích thước sản phẩm PCR tương ứng của chúng.
Bài 4: Điện di các sản phẩm ARMS-PCR trên gel agarose.
1. Mục đích
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của bài thực hành số 3 (ARMS-PCR).
- Dựa vào kết quả điện di, ta có thể biết được PCR tốt hay không, kiểu gen của người bệnh là
bình thường, đồng hợp đột biến hay dị hơp.
2. Cơ sở lý thuyết
- Các acid nucleic (DNA và RNA) có chứa gốc phosphate trong phân tử nên sẽ tích điện âm
ở pH trung tính hoặc kiềm.
- Do sự tích điện này, những phân tử DNA và RNA sẽ di chuyển về phía cực dương trong
điện trường của dòng điện một chiều.
- Tốc độ di chuyển của phẩn tử sẽ phụ thuộc vào:
● Kích thước phân tử: phân tử nhỏ di chuyển nhanh hơn phân tử lớn.
● Cấu trúc phân tử: phân tử có cấu hình gọn di chuyển nhanh hơn phân tử có
cấu hình cồng kềnh.
 ● Nồng độ gel: gel agarose khi đông lại tạo thành cấu trúc mạng lưới, giúp phân
tách các DNA có kích thước lớn, từ 100bp-vài chục kb. Nồng độ gel càng lớn,
khả năng phân tách càng tốt.
- Để quan sát băng DNA, ta có thể sử dụng một số thuốc nhuộm như ethidium bromide, red
safe, sybr safe…Đây là những chất có khẳ năng liên kết với mạch đôi của phân tử DNA và
phát huỳnh quang khi được kích thích bằng ánh sáng tia tử ngoại (tia UV). Với EtBr, ta phải
nhuộm gel sau khi điện di. Còn với Red safe hay Sybr safe, ta sẽ trộn sẵn vào trong gel
agarose khi pha.
3. Hóa chất và dụng cụ
chất cụ

- Sản phẩm ARMS-PCR - Bể điện di

- Thang chuẩn DNA 1kb fermentas - Bộ nguồn điện di agarose
- Gel agarose 2% có chứa Sybr safe - Pipet 20, đầu côn 200
- Đệm TBE 1X - Máy UV

4. Cách tiến hành

- Đặt bản gel vào bể điện di có đệm TBE 1X.
- Dùng pipet hút mỗi mẫu 15µl sản phẩm PCR (toàn bộ thể tích) và tra vào giếng.
Chú ý: tra đúng thứ tự các giếng, tránh chọc đầu côn quá sâu gây thủng giếng hoặc để đầu
côn quá nông gây tràn mẫu ra ngoài.
- Bật bộ nguồn và điện di ở 100V cho đến khi thấy dye màu (xanh) chạy đến cuối bản gel.
- Đưa bản gel lên máy UV và quan sát, chụp ảnh.
5. Kết quả và giải thích
 Kết quả điện di sản phẩm ARMS-PCR.
Chú thích:
- Thể tích điện di của mẫu: 15µl/lane.
- Marker: 1kb fermentas.
- Ký hiệu mẫu: + N: mẫu xác định allen bình thường.
+ M: mẫu xác định allen đột biến.
+ V/1: ca thực hành số 5 (thứ 6 9h30-11h); tổ 1.
Nhận xét:
- Kết quả điện di của nhóm em (nhóm 4) được khoanh vùng màu đỏ.
- Băng điện di xấu, nguyên nhân có lẽ do lúc tra giếng đẫ để đầu côn chọc mạnh vào gel, làm
cho bề mặt giếng không còn thẳng mà hơi lõm.
- Băng IC không lên, mẫu M lên một băng DNA, còn mẫu N không lên băng nào. Như vậy
phản ứng PCR đã bị hỏng.
- Về băng DNA của mồi đột biến, mẫu M của tổ 3 và tổ 4 đều lên băng kích thước tương
đồng nhau. Và do tổ 3 có băng IC nên ta chắc chắn, băng DNA này có kích thước 405bp.
- IC không lên những mẫu M lại lên băng. Nghi ngờ do mồi bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đến
hiện tượng dương tính giả - một đặc điểm thường thấy ở ARMS-PCR
Về nguyên nhân PCR bị hỏng:
- Do DNA khuôn: lý do này bị loại bỏ ngay vì tổ 2 cũng sử dụng mẫu DNA T108 và cho kết
quả PCR đẹp. Băng IC chứng tỏ trong mẫu DNA T108 có sự hiện diện của gen beta-globin.
- Do hóa chất:
Tổ 3 và 4 dùng chung hóa chất với nhau, chỉ khác ở DNA khuôn đưa vào. Mẫu M của tổ
4 lên đẹp, chứng tỏ Gotaq, mồi nội kiểm và 41/42MR đều tốt. Tuy nhiên, cả 2 nhóm đều
không lên băng ở mẫu N. Có thể mồi 41/42NF bị hỏng, những khả năng này khá thấp.
- Do thao tác:
Mẫu N bị thiếu thể tích do quá trình pha master mix bị lỗi nên cũng phần nào hiểu được
lý do không lên băng. Còn mẫu M có thể do thao tác nhả pipet không hết, vẫn còn dính hóa
chất ở đầu côn, dẫn đến thành phần phản ứng bị thiếu. Nghi ngờ nhất là mồi Control R bị
thiếu, dẫn đến không lên băng IC.
Kết luận:
- Tuy băng DNA của mẫu M lên đúng kích thước (405bp, qua so sánh với nhóm 4) nhưng
khả năng cao đây là do bắt cặp không đặc hiệu.
- Nội kiểm của mẫu M không lên là do thao tác lấy thiếu mồi Control R.
- Mẫu N không lên là do thành phần phản ứng thiếu bởi quá trình pha master mix bị hỏng.
6. Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Nêu thành phần và tác dụng của các chất có trong dye điện di
Thành phần Tác dụng
- Có tác dụng kéo các sợi DNA xuống đáy giếng, giúp chúng được tập
Chất nặng trung lại, tạo thành một băng khi điện di.
- Chất nặng này thường là Glycerol, ficoll.

- Làm chỉ thị giúp ta ước lượng tốc độ chạy của mẫu DNA trong bản gel.
- Chất màu này sẽ có một tốc độ chạy tương đương với một băng DNA
kích thước nhất định và ở điều kiện nhất định (tùy vào chất màu là gì).
Chất màu - Dựa vào tốc độ chạy của chất màu, ta có thể suy đoán rằng băng DNA
của mình đang chạy đến phần nào của bản gel và có thể quyết định nên
dừng hay tiếp tục điện di.

Liên kết với các ion kim loại hóa trị 2, đặc biệt là Mg2+. Bởi chúng là những
EDTA cofactor cho các nuclease. Qua đó làm giảm thiểu khả năng DNA bị phân
hủy trong quá trình điện di.
Câu 2: Thang chuẩn (Marker) sử dụng trong điện di là gì, tác dụng?
 Thang chuẩn là tập hợp các đoạn DNA đã biết sẵn kích thước. Dựa vào chúng, ta có thể ước
lượng được kích thước băng DNA của mình. Việc này sẽ giúp xác định băng DNA mà ta vừa
khuếch đại có đúng là băng DNA đặc hiệu hay chỉ là sản phẩm phụ.
 Bài 5: Quy trình lai điểm ngược
1. Mục đích
- Thực hiện lai màng nhằm xác định dạng đột biến trên gen beta-globin.
- Quá trình này là sự tiếp nối của việc hoạt hóa màng ở bài 1 và sử dụng sản phẩm PCR có
đánh dấu biotin ở bài 2.
2. Cơ sở lý thuyết
- Sản phẩm PCR có gắn biotin sẽ được lai với đầu dò đặc hiệu trên màng.
- Dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu và quá trình phát tín hiệu huỳnh quang của biotin, ta có thể xác
định được mẫu bình thường và mẫu đột biến.
3. Hóa chất và dụng cụ
chất cụ

- Dung dịch tiền lai - Panh kẹp

(SSC 6X, SDS 0.1%, Denhartd 5X) - Đĩa nhựa
- Đệm lai - Đồng hồ bấm giờ
- Dung dịch rửa W - Pipet 1000, đầu côn 1000
(SSC 6X, SDS 0,1%) - Tủ sấy
- Dung dịch rửa U1 - Bể ổn nhiệt
(Tris-HCl 0.1M pH7.6 ; NaCl 0.15%) - Đá
- Dung dịch rửa U2
(Tris-HCl 0.1M pH9.5 ; NaCl 0.1M ; MgCl2
0.05M)
- Dung dịch tween 20
- Dung dịch SA-AP
- Cơ chất của enzyme Alkaline Phosphatase

4. Cách tiến hành và ý nghĩa các bước.

STT Bước làm Ý nghĩa
Cho dung dịch tiền lai vào tủ sấy ở nhiệt độ Hòa tan SDS trong dung dịch tiền lai
1
60oC-15’. (SDS tủa ở 4oC trở xuống).
Dung dịch tiền lai là để kiểm soát các
Đặt màng lai vào trong đĩa nhựa, thêm vào
bước rửa nghiêm ngặt. Dung dịch này
2 đĩa 1ml dung dịch tiền lai. Sau đó đặt đĩa vào
sẽ cân bằng, bão hòa và tối ưu điều kiện
trong tủ sấy để ủ 60oC-15’ (trong quá trình ủ
trước khi tiến hành lai.
 có thể lắc đĩa một vài lần để đảm bảo mang
được ủ đều trong dung dịch tiền lai).
Trong khi ủ màng với dung dịch tiền lai, ta
tiến hành biến tính đêm lai ở 95oC-10’. Kết Giai đoạn biến tính ở 95oC là để tách
thúc thời gian thì cắm ngay đệm lai đã biến mạch sợi đôi DNA thành sợi đơn.
3
tính lên đá ủ 5’. Sau đó ủ đá là để ức chế sự hồi tính của
Chú ý: trong dung dịch đệm lai đã có sẵn sản phần tử DNA.
phẩm PCR đánh dấu biotin ở bài 2.
Dùng pipet hút bỏ dung dịch tiền lai, sau đó Tạo điều kiện cho sản phẩm PCR mạch
4 bổ xung dung dịch đệm lai vào đĩa đến ngập đơn lai với đầu dò đặc hiệu
màng. Ủ màng 60oC-60’
Dùng pipet hút bỏ dịch đệm lai. Bổ sung vào
Loại bỏ sản phẩm PCR sợi đơn thừa
5 đĩa 1ml dung dịch rửa W, ủ ở nhiệt độ phòng
không bắt cặp với đầu dò.
5’. Ta sẽ rửa với dung dịch W như vậy 2 lần.
Trong lúc đợi màng ủ với dung dịch W, ta tiến
hành pha dung dịch U1 có chứa tween
(0.05%)
6 Blocking tất cả những yếu tố có khả
Cách pha: lấy 1µl tween (100%) bổ sung vào
năng gắn với enzyme Alkaline
2ml dung dịch U1, ta thu được dung dịch U1
phosphatase (giống với bước tiền lai)
có chứa tween 0.05%.
Blocking màng bằng dung dịch U1 có chứa
7
tween 0.05%, ủ nhiệt độ phòng 15’.
Ủ màng với dung dịch U1 có bổ sung SA-AP
Gắn phức hệ streptavidin-alkaline
với tỉ lệ SA-AP : U1 = 3:10000.
phosphatase vào các gốc biotin trên sản
8 Cách làm: lấy 0,3µl dung dịch SA-AP và bổ
phẩm PCR (lúc này đang được gắn với
sung vào với 1ml dung dịch U1.
màng thông qua đầu dò).
Ủ ở nhiệt độ phòng 30’.
Rửa màng 2 lần với U1, mỗi lần đều ủ ở nhiệt
9 Loại bỏ SA-AP thừa
độ phòng 5’
Tạo môi trường pH thích hợp cho
10 Rửa màng với U2, ủ nhiệt độ phòng 5’.
enzyme Alkaline Phosphatase.
 Cơ chất BCIP sẽ bị enzyme alkaline
Thêm lên màng 500µl cơ chất của enzyme phosphatase loại bỏ nhóm phosphate.
Alkaline Phosphatase, ủ trong tối khoảng Khi đó, dung dịch NBT-BCIP vàng nhạt
11
1h30’. sẽ chuyển sang dạng tủa xanh dương.
Kết quả là màng lai có màu xanh đặc
trưng.
Để loại bỏ cơ chất thừa, giúp cho việc
12 Rửa màng lai với nước
quan sát kết quả lai màng dễ dàng hơn.

5. Giải thích
Khi thêm cơ chất BCIP lên màng, chúng bị enzyme alkaline phosphatase loại bỏ nhóm
phosphate. Kết quả là dung dịch NBT-BCIP màu vàng nhạt bị chuyển sang màu tủa xanh
dương. Nếu tốt, phần tủa màu xanh dương này sẽ chỉ bám trên màng tại những vùng có biotin,
và những vùng đó sẽ là:
- P+: do những đoạn oligo này có gắn với biotin.
- Những vùng có sự bắt cặp với sản phẩm PCR được gắn biotin. Đó là vị trí của P-, đầu dò
với mẫu bình thường N hoặc mẫu đột biến M.

Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngược.
Tuy nhiên, nếu lượng streptavidin-alkaline phosphatase đưa vào quá nhiều, việc rửa trôi những
phức hệ enzyme thừa không liên kết với biotin sẽ là khó khăn hơn. Do vậy, khi ủ với cơ chất,
kể cả những vị trí không gắn biotin trên màng lai cũng sẽ có màu xanh. Kết quả là cả tấm màng
sẽ có màu xanh nhạt thay vì màu trắng vốn có của nó.
6. Phân tích kết quả
 Kết quả phương pháp lai điểm ngược xác định đột biến điểm Cd41/42.
Nhận xét:
- Kết quả lai màng đẹp, các dot tròn, màu xanh lên đẹp, phần nền của màng lai vẫn còn màu
trắng.
- Cả P+ và P- đều lên màu đẹp, như vậy quy trình lai màng là tốt, không xảy ra sai sót gì.
- P+ lên màu đậm nhất do bản thân oligo này đã có sẵn biotin. Còn những mẫu còn lại phải
phụ thuộc vào lượng biotin thông qua số sản phẩm PCR bắt cặp với chúng. Lượng DNA bắt
cặp với đầu dò càng nhiều thì màu lên càng đậm.
- Đầu dò xác định allen bình thường lên màu, allen đột biến không lên.
- Sản phẩm PCR không lên băng IC, vậy nên kết quả là không đáng tin. Còn kết quả lai màng
lại rất tốt, ta hoàn toàn có thể tin tưởng.
- Như vậy mẫu DNA T108 này có kiểu gen bình thường, không chứa đột biến tại vị trí
Cd41/42.

Các phương pháp xác định đột biến điểm

- Lai oligonucleotide đặc hiệu allen.
Nguyên tắc là lai DNA. Các bazơnitơ của hai sợi đơn DNA liên kết với nhau theo nguyên tắc
bổ sung.
+ Southern blot
+ DNA microarray
+ Zinc finger, Cas9-nickase
+ Lai điểm (dot blot): trình tự DNA đích được cố định trên màng nylon, sau đó lai với đầu dò
được đánh dấu.
 + Lai điểm ngược (reverse dot blot): đầu dò được cố định trên màng nylon, sau đó lai với
DNA được đánh dấu.
- Mồi đặc hiệu allen.
Nguyên tắc là mồi PCR bắt cặp hoàn toàn với khuôn sẽ có hiệu quả kéo dài hơn so với mồi
bắt cặp sai.
+ ARMS-PCR
+ Multiples ARMS-PCR
- Giải trình tự.
Nguyên tắc là tổng hợp sợi DNA mới. Trong quá trình tổng hợp, dừa vào tín hiệu đặc trưng
của từng phương pháp mà ta biết được chính xác nucleotide nào vừa được gắn vào.
+ Sanger, illumina, pyrosequencing
+ Massarray