CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC PHẨM (210119)

Vi sinh thực phẩm

phân tử (tt)
GV: Nguyễn Mạnh Cường
Email: nnguyenccuong@gmail.com

WELCOME TO
CLASS – Week 9!!!
 DNA sequencing – Giải trình tự DNA

i. Sanger sequencing

• Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp

mạch bổ sung cho trình tự cần xác
định nhờ hoạt động của enzyme
DNA Polymerase. Với việc sử
dụng thêm dideoxynucleotide
(ddNTP) và các deoxynucleotide
(dNTP) thông thường.
 DNA sequencing – Giải trình tự DNA
i. Sanger sequencing
• Fred Sanger (1975)
• Giống và khác với PCR
Ø Nhiệt độ chu kỳ là như nhau (90°C →55°C →72°C)
Ø Các thành phần phản ứng
• GIỐNG – dNTPs, Taq, PCR buffer, MgCl2, mẫu DNA
• KHÁC – chỉ dùng 1 primer, ddNTPs, Sanger tạo ra những DNA mới với chiều dài
không tương đồng nhau.
• dNTPs được kết hợp và cho phép một sợi DNA mới được tạo ra bởi
Taq.
• ddNTP được kết hợp để kết thúc quá trình tổng hợp chuỗi DNA mới.
DNA sequencing
i. Sanger sequencing
• Mỗi ddNTP có 1 màu nhuộm huỳnh quang riêng
• ddATP = xanh lá
• ddTTP = đỏ
• ddCTP = xanh dương
• ddGTP = đen / vàng
• Mỗi đoạn DNA được đánh dấu bằng ddNTP sẽ cung cấp cho nó
một tín hiệu huỳnh quang.
• Các mảnh được phân tách dựa trên kích thước - khi chúng di
chuyển qua gel, máy dò laser sẽ đọc tín hiệu huỳnh quang.
• Có 2 pp chính trong sanger sequencing:
u 1. Sanger thủ công: h"ps://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ
u 2. Sanger tự động: h"ps://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/how-does-sanger-sequencing-work/
DNA sequencing
i. Sanger sequencing

• Trong giải trình tự Sanger thủ công,

các oligonucleotides từ mỗi loại
ddNTP sau phản ứng PCR được chạy
trong bốn làn riêng biệt của gel
polyacrylamide.

• Trong giải trình tự Sanger tự động, tất

cả các đoạn oligonucleotides được
chạy trong môi trường điện di capillary
gel trong máy giải trình tự.
DNA sequencing
i. Sanger sequencing

Step 1: Chạy PCR kết thúc chuỗi (chain termination PCR)

• PCR kết thúc chuỗi có nguyên lý làm việc giống PCR nhưng khác
biệt với sự góp mặt của ddNTPs.
• Trong PCR kết thúc chuỗi, người dùng trộn một ít các ddNTPs
kết thúc chuỗi với các dNTPs. ddNTPs thiếu nhóm 3'-OH cần
thiết để hình thành liên kết phosphodiester; do đó, khi DNA
polymerase kết hợp với ddNTPs một cách ngẫu nhiên, quá trình
annealing sẽ chấm dứt.

Video minh hoạ:

https://www.biointeractive.org/classroom-resources/sanger-sequencing
DNA sequencing
i. Sanger sequencing

• Trong giải trình tự Sanger thủ công, bốn phản ứng PCR được
thiết lập, mỗi phản ứng chỉ có một loại ddNTP duy nhất (ddATP,
ddTTP, ddGTP và ddCTP) được trộn vào.

• Trong giải trình tự Sanger tự động, tất cả ddNTP được trộn

trong một môi trường duy nhất.
DNA sequencing
i. Sanger sequencing

Step 2: chạy điện di phân tách DNA.

• Trong điện di trên gel, nucleotides mang điện tích âm sẽ di
chuyển về phía điện cực dương ở phía đối diện của gel.
• Tốc độ di chuyển của các oligonucleotides sẽ chỉ được xác định
bởi kích thước. Kích thước càng càng nhỏ thì ma sát càng ít khi
di chuyển qua gel và di chuyển càng nhanh.
• Kết quả: các oligonucleotides sẽ được sắp xếp từ nhỏ nhất đến
lớn nhất, đọc gel từ dưới lên trên.
DNA sequencing
i. Sanger sequencing

Step 3: Phân tích gel và xác định trình tự DNA

• Bước cuối cùng đọc gel để xác định trình tự của DNA đầu vào.
Polyacrylamine gel cho phép phân biệt các DNA / proteins /
oligosaccharides chỉ hơn kém nhau 1 bp, điều mà agarose gel
ko làm được.
DNA sequencing

i. Sanger sequencing

• Trong giải trình tự Sanger thủ công, cần

phải đọc kết quả ở tất cả bốn làn của gel
theo từ tự từ dưới lên trên để xác định
trình tự đoạn nucleotides cần tìm.
Ø Ví dụ: nếu vệt dấu DNA nhỏ nhất ở làn
ddGTP thì nucleotide đầu tiên từ đầu 5 'của
trình tự ban đầu phải là Guanin (G).

• Trong giải trình tự Sanger tự động, một

máy tính sẽ đọc thứ tự của các vệt DNA
trong gel theo thứ tự từ dưới lên. Tia laser
kích thích các thẻ huỳnh quang trong mỗi
dải và máy tính sẽ phát hiện ra những ánh
sáng khác nhau để chuyển về dạng sắc
ký đồ.
DNA sequencing
i. Sanger sequencing
Hạn chế của pp giải trình tự Sanger:
• Cần có gel để phân tách các oligonucleotides sau khi chạy
PCR.
• Thông lượng thấp Tốn nhiều thời gian hơn các pp hiện đại.
• PP chuẩn bị mẫu khó được tự động hoá.
• Giá thành cao.
DNA sequencing
ii. Giải trình tự DNA thế hệ
tiếp theo (NGS)
Giới thiệu:
• Nguyên tắc hoạt động cơ bản của NGS và Sanger là giống nhau.
• Giải trình tự NGS và Sanger đều cần sự tham gia của các ddNTPs và
quá trình điện di ở gel capillary.
• Sự khác biệt quan trọng giữa Sanger và NGS là số lượng giải trình tự
các DNA cùng lúc.
Ø Sanger chỉ có thể giải trình tự một đoạn DNA duy nhất trong 1 lần chạy.
Ø NGS giải trình tự nhiều đoạn DNA đồng thời trong 1 lần chạy.
• NGS cũng có độ nhạy cao hơn giúp phát hiện các đột biến trên DNA
mẫu và phát hiện biến thể trên loài.
DNA sequencing

ii. NGS

• 4 công nghệ NGS phổ biến hiện nay:

1. Giải trình tự Illumina (Solexa)
2. Công nghệ giải trình tự Pyrosequencing 454
3. Ion Torrent: Giải trình tự Proton/PGM
4. Công nghệ giải trình tự SOLiD
ii. NGS

1. Giải trình tự Illumina (Solexa)

• Giải trình tự Illumina hoạt động bằng cách xác định đồng thời
các DNA nucleotides và thêm chúng vào chuỗi axit nucleic.
Công nghệ này có thể phân tích được các trình tự của một
đoạn nucleotide lặp lại liên tục, đồng thời giúp cho thư viện
DNA được mã hóa và tách riêng trong toàn bộ quá trình phân
tích kết quả.
• Gặp hạn chế về chiều dài đọc của DNA (tối đa 250bp với độ
chính xác tối đa 99%).
• Khá tốn kém về thời gian, khi mất tới 23 giờ để phân tích hệ
gen người.
ii. NGS
2. Công nghệ giải trình tự
Pyrosequencing 454
• Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự tổng hợp”, dựa
trên việc phát hiện thành phần Pyrophosphate (PPi) được giải
phóng dẫn đến sự phát quang của các phản ứng hoá học.
• Công nghệ giải trình tự pyrosequencing 454 có tính nhạy cao
hơn phương pháp truyền thống, độ chính xác lên tới 99,9% với
các đoạn 200 base và 99% với các đoạn 400 base.
• Thời gian: khoảng 10 giờ.
ii. NGS
2. Công nghệ giải trình tự
Pyrosequencing 454
• Hệ thống giải trình tự được số lượng 400-600 triệu bp cùng lúc.
Ø Giúp tiết kiệm đáng kể chi phí hơn so với khi sử dụng phương pháp
Sanger để giải trình tự một số lượng lớn DNA.
• Tuy nhiên, pyrosequencing 454 vẫn tốn kém hơn so với vài
công nghệ NGS khác. Và hạn chế lớn nhất của pyrosequencing
454 là việc khó phân tích chính xác của một loại axit nucleic lặp
lại liên tục từ 6 nucleotide trở lên.
ii. NGS
3. Ion Torrent: Giải trình tự
Proton/PGM
• Sử dụng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng bán dẫn,
giải trình tự Ion Torrent đo tín hiệu điện do ion H+ được giải phóng ra
trong quá trình tổng hợp DNA.
• Với việc sử dụng công nghệ bán dẫn chứ không phải quang học để
đo tín hiệu, Ion Torrent có thể giải trình tự nhanh chóng, đồng thời
giúp hệ thống máy móc trở nên gọn nhẹ.
• Công nghệ này chỉ mất từ 2-3 tiếng đồng hồ để phân tích hệ gen
người, bên cạnh đó, cũng tiêu tốn ít chi phí hóa chất nhất trong 4
công nghệ.
• Hạn chế lớn nhất mà Ion Torrent gặp phải chính là về chiều dài đọc
(khoảng 100-250bp, đảm bảo chính xác tối đa 99% ở base thứ 250).
ii. NGS

4. Công nghệ giải trình tự SOLiD

• Công nghệ giải trình tự SOLiD được thiết kế dựa trên nguyên lý
ghép nối, toàn bộ genome được cắt thành các đoạn ADN ngắn, sau
đó từng đoạn được gắn với các adaptor (như primer trong PCR).
• Quá trình giải trình tự được thực hiện thông qua các oligonucleotide
được đánh dấu huỳnh quang.
• Dữ liệu xuất ra của hệ thống có thể lên tới 60 Gb với khoảng hơn 1
tỷ đoạn được đọc sau mỗi lượt chạy. Kích thước và độ tin cậy của
mỗi đoạn ADN được đánh giá là tương đương so với hệ thống của
Illumina, trong khi đó chi phí thiết bị của công nghệ SOLiD thấp hơn
đáng kể so với các hệ thống khác cùng thế hệ.
 Giải mã trình tự bộ gene (genome
sequencing)
• PP xác định trình tự của toàn bộ gen (nhiễm sắc thể) của một
loài sinh vật
Ø Virus = 10 nghìn nucleotide (10 Kbp)
Ø Vi khuẩn = 4 triệu nucleotide (4 Mbp)
Ø Con người = 3 tỷ nucleotide (3 Gbp)
• 1 vài phương pháp phổ biến: giải trình tự Shotgun, wgMLST.
Genome sequencing

i. Giải trình tự Shotgun

• Nguyên lý: Giải trình tự shotgun chia nhỏ các chuỗi DNA một cách
ngẫu nhiên thành nhiều mảnh nhỏ và sau đó tập hợp lại trình tự
bằng cách tìm kiếm các vùng trùng nhau (qua phần mềm)
• Giải trình tự bằng shotgun ban đầu được Fred Sanger sử dụng để
giải trình tự các bộ gen nhỏ như của virus và vi khuẩn.
Ø Phổ biến hơn đối với giải mã gene ĐV và con người → số lượng lớn và
phức tạp.
• Giải trình tự bộ gen shotgun bỏ qua các bước tạo DNA nhân bản
giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.
• Những mảnh vỡ DNA thường có kích thước từ 2-20 kilobase (2.000-
20.000 bp) đến 200-300 kilobase (200.000-300.000 bp).
Genome sequencing

i. Giải trình tự Shotgun

h"ps://www.biointerac=ve.org/classroom-resources/shotgun-
sequencing
Genome sequencing
ii. Giải trình tự đa vị trí trên bộ
gene (wgMLST)
• wgMLST: Whole genome mul+-locus sequence typing.
Phương pháp:
• Thu thập toàn bộ trình tự bộ gen bằng NGS, sau đó so sánh trình tự
của tất cả các gen (~ 4000 gen) giữa các dòng phân lập
• Tính phân biệt cao hơn so với MLST (chỉ có 7 gen được giải trình
tự).
• Thông tin về các yếu tố kháng kháng sinh, loại huyết thanh và độc
lực có thể được trích xuất cùng một lúc.
Genome sequencing
ii. Giải trình tự đa vị trí trên bộ
gene (wgMLST)
Ưu điểm:
• Các phương pháp có thể được cải tiến.
• Nó tạo ra kết quả ổn định và di động, có thể dễ dàng chia sẻ và so
sánh.
• Dữ liệu có thể được phân tích mà không cần nhân lực chuyên
ngành về tin sinh học.
Hiện đang được sử dụng bởi:
• PulseNet - phân loại mầm bệnh thực phẩm từ bệnh nhân bị bệnh.
• GenomeTrakr - phân loại mầm bệnh lây truyền qua thức ăn và môi
trường.
Genome sequencing
iii. PP nuôi cấy độc lập (Culture-
independent method)
• Giải trình tự DNA của vi khuẩn được chiết xuất trực tiếp từ các
mẫu môi trường, thực phẩm.
Ø Không nuôi cấy vi khuẩn
o Giải quyết vấn đề <1% vi khuẩn trong môi trường không thể phát triển trên môi
trường nuôi cấy.

• Có thể cho biết những vi sinh vật nào hiện diện

Ø So sánh vi khuẩn ở người ốm với người khỏe mạnh (pp để tìm ra các
probiotics mới).
Ø Xác định các vi sinh vật trong thực phẩm (ví dụ: VSV gây hư hỏng
thực phẩm, thực phẩm lên men tự nhiên..)
Genome sequencing
iii. PP nuôi cấy độc lập (Culture-
independent method)
Bước thực hiện:
• DNA được phân lập trực tiếp từ mẫu (ví dụ: thức ăn, chất bẩn,
đại dương, ruột người, ruột mối…)
Ø Ủ qua đêm trong dd peptone (thường với VSV trong thực phẩm tươi).
• Chạy PCR khuếch đại 16s rDNA đã chiết xuất từ mẫu.
Ø Chạy agarose gel để kiểm tra kết quả PCR (tạp nhiễm, DNA mong
muốn…)
Ø Gửi kết quả đi định danh.
• So sánh với cơ sở dữ liệu (BLAST) để xác định từng trình tự
VSV, vi khuẩn.
 Food

Extract DNA

16S rDNA gene PCR

High throughput sequencing

(1000 to >10,000 x 100bp DNA sequence reads)

Compare to database to idenEfy bacteria (OTU)

iii. PP nuôi cấy độc lập

OTU
• Operational taxonomic unit – Đơn vị phân loại hoạt động
• Có thể áp dụng xác định đơn vị từ chi, nhưng tốt hơn nếu nó là
loài → Mục đích cuối cùng là tìm ra chính xác dòng VSV đó
(strain).
Ø Phụ thuộc vào độ dài của trình tự và khu vực
q Khuếch đại và giải trình tự một vùng ngắn hơn trong rDNA 16s

Thiếu in nghiêng
16S rDNA gene - Vùng gene đăc trưng để phân loại VSV
iii. PP nuôi cấy độc lập

Ứng dụng

• Theo dõi vi khuẩn trong quá trình lên men tự nhiên và lên men
bổ sung.
Ø Ví dụ: Phô mai, cocoa, yogurt…
Ø Kiểm tra quá trình hoạt động dựa trên sản phẩm tạo ra.
Ø Xác định các dấu hiệu hư hỏng từ sớm.
Ø Chẩn đoán và cải thiện quy trình.
• Quan sát sự thay đổi của vi khuẩn liên quan đến hư hỏng.
• So sánh sự phân bố theo không gian của vi sinh vật.
• Phân tích thành phần của hệ VSV đường ruột của con người.
iii. PP nuôi cấy độc lập
Phân tích VSV trong 1 loại
phô mai thủ công Irish

• Lactobacillus chiếm phần lớn trong hệ VSV “hard cheese”.

• Vỏ phô mai (cheese rinds) đa dạng nhất về chủng VSV.
• Những loại phô mai có nồng độ muối cao sẽ ngăn cản sự phát triển của nhiều VSV, đặc biệt là
Pseudomonas.
• Thành phần thảo mộc và gia vị (herbs and spices) trong phô mai cũng ảnh hưởng đến hệ VSV.
Tìm sự khác biệt và giải thích?
 • Các thực phẩm tươi có mức độ đa dạng về
PP nuôi cấy độc lập loại VSV hơn là thực phẩm lên men và thực
phẩm gây hư hỏng.
 Thực hành – Định danh phân tử VSV
Các bước thực hành cơ bản ở Viện Dược Học Howard Hughes:

1. Trích xuất DNA.

2. Khuếch đại gen 16s rDNA bằng PCR.
3. Giải trình tự sản phẩm PCR.
4. So sánh trình tự thành cơ sở dữ liệu để xác định vi khuẩn phù
hợp nhất (sử dụng BLAST).

https://www.biointeractive.org/classroom-resources/bacterial-
identification-virtual-lab
 Chú giải
• Scaffold: là một phần của genome sequence được tái tạo từ
các clones trong kỹ thuật shotgun trên toàn bộ genome tính từ
đầu đến cuối dây DNA. Scaffolds bao gồm tất cả những contigs
và những đoạn hở (gaps). Gaps xảy ra trong quá trình đọc trình
tự của máy từ hai đầu trình tự (two sequenced ends) của ít nhất
một lần trùng lập (overlap) với các kết quả đọc khác giữa hai
contigs khác nhau.
 Chú giải

• Oligos / Oligonucleotides: là những sợi đơn ngắn của DNA hoặc

RNA tổng hợp được dùng làm điểm khởi đầu cho nhiều ứng
dụng sinh học phân tử và sinh học tổng hợp.
• Locus: Đây là thuật ngữ thuộc lĩnh vực di truyền học, chỉ vị trí
của gen trên nhiễm sắc thể. Thuật ngữ này sử dụng để chỉ ra
địa chỉ cụ thể của một gen nào đó trên nhiễm sắc thể mang
DNA chứa gen đó.
 Chú giải
• dNTP: Nucleoside triphosphate là một phân tử có chứa base nitơ liên kết với đường 5
carbon, với ba nhóm phosphat liên kết với đường. Nucleoside triphosphat là một ví dụ về
nucleotide. Chức năng của dNTPs trong PCR là mở rộng sợi DNA đang phát triển với sự
trợ giúp của Taq DNA polymerase.
• ddNTPs: Dideoxynucleotide / Dideoxynucleo,des triphosphates: là chất ức chế kéo dài
chuỗi DNA polymerase, được sử dụng trong phương pháp Sanger để giải trình tự DNA.
Chúng còn được gọi là 2 ', 3’ - Dideoxynucleotide vì cả hai vị trí 2 'và 3' trên ribose đều
thiếu các nhóm hydroxyl và được viết tắt là ddNTP.
• DNA polymerase (DNAP): là enzyme có chức năng tạo ra các phân tử DNA mới bằng
cách lắp ráp các nucleotide, đơn phân của DNA. Các enzyme này gắn nucleotides vào 2
mạch đơn cùng lúc để tạo ra hai phân tử DNA "con" giống hệt nhau từ một phân tử DNA
"mẹ" ban đầu
QUESTIONS?
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………
………………………