Mục Lục

01.KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?................................................................................................1

02.NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR......................................................................1
03.CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM..............................3
04.ỨNG DỤNG.......................................................................................................................5
05.ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM....................................................................................................5

Giới thiệu kỹ thuật PCR

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đây là một phản ứng nhân bản
DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Bài viết này nhằm giới thiệu các thông tin quan trọng về kỹ
thuật PCR cũng như các vấn đề thường gặp khi sử dụng kỹ thuật này.

01.KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn
ra trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix). Trong PCR mix
sẽ chứa các thành phần:
 1) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối
ưu ở 72 oC.
 2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng
hợp ra các bản sao DNA.
 3) DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì
đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
 4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20
nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.
 5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động
hiệu quả.
 6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho
phản ứng nhân bản diễn ra.
Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt (Thermo
cycler), ở Việt Nam thì thường gọi luôn là máy PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy
PCR sẽ thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quá trình nhân bản DNA được diễn ra (xem video).
https://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU&t=3s
02.NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ (Hình 1):
 1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá
vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
 2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp
bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
 3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng
dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Hình 1. Chu trình nhiệt

của một quy trình PCR
Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại
liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 2 30 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ
này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhìn thấy bằng
mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV (Hình 2).
 Hình
2. Ảnh chụp sản phẩm PCR (giếng 1~7) dưới ánh đèn UV
trên gel agarose nhuộm bằng Ethidium Bromide

03.CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM

1) PCR đơn mồi (Simplex PCR): Đây là kiểu PCR cổ điển nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc
hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất.
2) PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây là kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để
khuếch đại các trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix phản ứng. Để thiết kế được
phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các
cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau. Ngoài ra, cũng
phải đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất khó xảy
ra nên thông thường multiplex PCR được sử dụng ở các tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng
trình tự đích đủ lớn sẽ không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.
 Hình 4. Sơ đồ một quy
trình Nested PCR
3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài (outer primer) và cặp mồi
bên trong (nested primer). Cặp mồi bên ngoài sẽ tham gia PCR lần 1 trước để làm tăng số
lượng DNA chứa trình tự đích, kế đến là cặp mồi bên trong sẽ tham gia PCR lần 2 để phát
hiện trình tự đích (Hình 4). Kỹ thuật này sử dụng khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích
(nested primer) có độ nhạy kém.
4) RT-PCR: Là quy trình sử dụng khi trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng
enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR, giai đoạn này gọi
là giai đoạn RT. Kỹ thuật RT-PCR có 2 loại (Hình 5):

Hình 5. Sơ đồ của quy

trình RT-PCR 1 bước và RT-PCR 2 bước
 - RT-PCR 2 bước: Bước ủ RT thực hiện ở 1 ống nghiệm riêng, cDNA tạo thành sẽ
được chuyển vào ống nghiệm chứa PCR mix để thực hiện PCR.
 - RT-PCR 1 bước: Cả 2 bước RT và PCR đều thực hiện trong 1 ống nghiệm duy
nhất, mix ban đầu sẽ chứa cả các thành phần cho RT lẫn cho PCR.
̀ 5) qPCR (Real time PCR)
 qPCR là quá trình khuếch đại (sao chép) một đoạn DNA xác định lên hàng trăm nghìn
lần, đủ để phân tích. Trước đó, các mẫu xét nghiệm được xử lý bằng hóa chất để tách
chiết DNA từ mẫu đó.

● Hai phương pháp phổ biến để phát hiện các sản phẩm trong qPCR là sử dụng:

• Thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu xen kẽ với bất kỳ ADN sợi kép.

• Đầu dò đặc hiệu gồm oligonucleotide được dán nhãn bằng máy phóng huỳnh quang.

04.ỨNG DỤNG

Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay
một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu
bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng thông qua xét nghiệm PCR.
 Trong công nghệ sinh học
PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã
trình tự ADN, xác định huyết thống…
 Trong y học
- Chẩn đoán bệnh ung thư: tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC
trong ung thư đại tràng,...
- Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người: HLA, human lymphocyte antigen,
…
- Phát hiện các bệnh di truyền.
 Trong Vi sinh học
– Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus, các vi khuẩn...
Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M.tuberculosis.
– Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước
đó: Lao nuôi cấy thất bại, viêm màng não mủ mất đầu…).
PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Điển hình là độc tố ruột không chịu
nhiệt của khuẩn Escherichia coli.
PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn: vi khuẩn sinh ESBL,
vi khuẩn kháng thuốc MRSA,…
 Trong lĩnh vực ký sinh trùng
Người ta dùng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lỵ amíp, Leishmania,Echinococcus,
Microsporidia, Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma gondii…

05.ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM

 Ưu điểm
 Độ chính xác cao và thời gian có kết quả chỉ trong vài giờ.
 Ít có khả năng mang lại kết quả âm tính giả so với các phương pháp khác.
 Đưa ra định lượng virus ngay tại thời điểm xét nghiệm để các bác sĩ có thể tiên lượng
được diễn tiến của bệnh và đưa ra đánh giá điều trị.
 Nhược điểm
 Yêu cầu kỹ thuật và điều kiện thiết bị cao.
 Độ chính xác của xét nghiệm phụ thuộc vào người thực hiện xét nghiệm, máy móc
thiết bị và khâu quản lý chất lượng.
 Chi phí cao.