Realtime PCR

Ths NGUYỄN THỊ TRÚC ANH - BỘ MÔN XÉT NGHIỆM

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TPHCM
2020-12-27 1
anh.annie.nguyen@gmail.com
 MỤC TIÊU BÀI GIẢNG
Sau khi học xong 4 tiết lý thuyết, CNXN năm 4 có thể:
1. Trình bày nguyên tắc hoạt động của Real-time PCR
2. So sánh sự khác và giống nhau giữa PCR và Real-time
PCR
3. Trình bày tính chất của đoạn dò trong Real-time PCR
4. Thiết kế mồi cho phản ứng Real-time PCR
5. Trình bày và giải thích các bước trong quy trình Real-
time PCR
6. Phân tích kết quả Real-time PCR
7. Ứng dụng Real-time PCR trong chẩn đoán, điều trị.
 Nội dung chính
1. Giới thiệu realtime PCR
2. Nguyên tắc hoạt động realtime PCR
3. Quy trình realtime PCR – Thiết kế primer
4. Phân tích kết quả realtime PCR
5. Ứng dụng realtime PCR trong y học

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 2
 1. Giới thiệu realtime PCR
Nhắc lại về PCR

PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại đoạn DNA đích nhờ
đoạn mồi đặc hiệu và phát hiện sản phẩm PCR bằng
phương pháp điện di với độ nhạy và đặc hiệu cao
 1. Giới thiệu realtime PCR
Realtime PCR là gì?

Realtime PCR là một kỹ thuật chuyên biệt cho phép kết quả phản ứng
PCR được hiển thị “trong thời gian thực” (realtime) ở mỗi chu kỳ khi
phản ứng diễn ra.
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
• Dựa trên việc phát hiện và đo lượng phẩm nhuộm màu
(EvaGreen, Syber Green…) hoặc mật độ quang của đoạn dò
huỳnh quang (Taqman probe, Beacon probe, Scorpion probe)
• Thiết lập đường tương quan tuyến tính giữa lượng sản
phẩm PCR tạo thành và mật độ quang thu được
• Phần mềm phân tích, tính nồng độ mạch khuôn ban đầu
• Thời gian tăng tỉ lệ nghịch với số lượng mẫu DNA ban đầu

Nồng độ khác nhau cho kết quả

điểm cuối tương tự trong khi số
copies trong từng chu kỳ chạy
khác nhau!

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gm
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Thành phần của realtime PCR mix

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 6
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR

Taqman probe

SYBR Green I phát huỳnh quang với sự hiện diện của DNA khuếch đại
Chúng liên kết với DNA sợi kép và phát ra ánh sáng khi được chiếu sáng với một bước sóng cụ thể.

Beacon probe

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 7
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Taqman probe
- 1 đoạn oligonucleotide sợi đơn dài khoảng 24-30bp có trình tự
bắt cặp bổ sung với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích với
đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (Reporter) và đầu 3’ có
gắn chất hấp thụ huỳnh quang (Quencher)
- Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease có khả năng
cắt bỏ probe khi probe bắt cặp với sợi khuôn và cần đầu 3’
của mồi trong giai đoạn kéo dài bổ sung
- Khi sản phẩm khuếch đại
đặc hiệu thì có sự bắt cặp
lên sp khuếch đại và làm
phát huỳnh quang khi
nhận được nguồn sáng
kích thích
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Taqman probe
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
SYBR Green I
- Màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có hiện diện của sợi
đôi DNA
- Ái lực này là do khả năng chèn màu vào sợi đôi DNA và làm
cho sợi đôi DNA phát ra được ánh sáng huỳnh quang khi
nhận được nguồn sáng kích thích
- Sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với sản phẩm
realtime PCR được tạo thành

https://www.researchgate.net/publication/264782414
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Kết quả so sánh tín hiệu nhân bản
từ các phẩm nhuộm khác nhau

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 11
Fig. 1. Real-time PCR chemistries: (a) SYBR green detection. SYBR green binds to all double-
stranded DNA and emits a fluorescent signal. In its unbound state, SYBR green does not
fluoresce. Template amplification is therefore measured in each cycle by the corresponding
increase in fluorescence. (b) TaqMan (50 nuclease) assay using TaqMans probes. During
annealing, the TaqMan probe and primers bind to the template. When the TaqMan probe is
intact, energy is transferred between the quencher and the reporter; as a result, no
fluorescent signal is detected. As the new strand is synthesized by Taq polymerase, the 50
exonuclease activity of the enzyme cleaves the labelled 50 nucleotide of the probe, releasing
the reporter from the probe. Once it is no longer in close proximity, the fluorescent signal
from the probe is detected and template amplification is recorded by the corresponding
increase in fluorescence. FEMS Microbiol Ecol 67 (2009) 6–20
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Beacon probe

20-25 nt

4-6 nt

https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/technical-
Chem Soc Rev. 2015 May 21; 44(10): 3036–3055 article/genomics/qpcr/molecular-beacons
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Beacon probe
MOLECULAR BEACONS APPLICATIONS
•SNP detection
•Allele discrimination BENEFITS OF USING MOLECULAR
•Pathogen detection BEACONS
•Multiplexing •Probe preserved during the reaction
•Viral load quantification •Increased specificity
•Gene expression analysis ADD LOCKED NUCLEIC ACID TO
•Gene copy determination YOUR PROBE
•Endpoint genotyping •Increase thermal stability and
•in vitro quantification or detection hybridization specificity
•Obtain greater accuracy in SNP (Short
Nucleotide polymorphism) detection,
allele discrimination and in
vitro quantification or detection
•Achieve easier and more sensitive
probe designs for problematic target
sequences
Figure 4. Dyes (SYBR Green, A) and probes (TaqMan, B; Molecular Beacon, C; Scorpions, D)
employed in real‐time PCR assays. Adapted with permission from Rocha et al.

Guidelines for Successful Quantitative Gene Expression in Real-Time qPCR Assays http://dx.doi.org/10.5772/658505
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Realtime PCR dùng đèn Tungsten

Thiết bị realtime PCR sử

dụng nguồn sáng là đèn
tungsten và dùng kính
lọc để chiếu ánh sáng có
độ dài bước sóng nhất
định lrn các tube phản
ứng
- IQ, My IQ, IQ5 (Biorad)
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Realtime PCR dùng sợi quang học
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Realtime PCR dùng đèn LED

Thiết bị realtime PCR sử

dụng đèn LED làm nguồn
sáng kích thích
- CFX (Biorad)
- Light-cycler (Roche)
- Rotor Gene (Corbett
Research)
- QuantStudio 5 Realtime
PCR (ThermoFisher
Scientific)
 2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR
Máy realtime PCR

Máy luân nhiệt có khả năng đọc 5

kênh màu khác nhau (FAM, HEX, Cy3,
Texas Red, Cy5)
2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com
2. Nguyên tắc hoạt động của realtime PCR

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com
3. Quy trình REALTIME PCR
 3. Quy trình realtime PCR

Phần mềm realtime PCR chuyển đổi tín hiệu huỳnh quang trong từng
giếng thành dữ liệu có ý nghĩa.

1. Thiết lập PCR protocol.

2. Thiết lập bố cục plate (tấm giếng).
3. Thu thập dữ liệu.
4. Phân tích dữ liệu

1
PRIMER DESIGNING TOOL
 http://www.idtdna.com/scitools/applications/primerquest/

Homo sapiens anterior gradient 2 homolog (Xenepus laevis)

528 bp mRNA
 4. Phân tích kết quả realtime PCR

2
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Phân tích melting curve trong realtime PCR
Sản phẩm đặc hiệu
Sản phẩm đặc hiệu

Sản phẩm
không đặc hiệu Phản ứng có 2
Phản ứng có 1
sản phẩm
sản phẩm

Sản phẩm đặc hiệu

Sản phẩm
không đặc
hiệu

• Melting curve: 650C - 950C, mỗi lần tăng 0.20C và duy tru trong
5-10 giây
• Các amplicon khác nhau sẽ có các đỉnh tan chảy khác nhau
• Primer-Dimers sẽ có 1 đỉnh tan chảy rất khác nhau
2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 26
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Chu kỳ ngưỡng trong realtime PCR

2
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Chu kỳ ngưỡng trong realtime PCR

2
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Chu kỳ ngưỡng trong realtime PCR
Loạt mẫu pha loãng cho kết quả là một biểu đồ nhân bản với
những đường tín hiệu cách đều nhau, mẫu loãng hơn cần
nhiều chu kỳ hơn…

20 Xác định được giá trị “ngưỡng” là một bước cực kỳ quan trọng
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Chu kỳ ngưỡng trong realtime PCR
Loạt mẫu pha loãng cho kết quả là một biểu đồ nhân bản với
những đường tín hiệu cách đều nhau, mẫu loãng hơn cần
nhiều chu kỳ hơn…

threshold = 300

20 Xác định được giá trị “ngưỡng” là một bước cực kỳ quan trọng
 4. Phân tích kết quả realtime PCR
Thiết lập standard curve trong realtime PCR

A) Amplification profile of the

qPCR reactions of a dilution
series of total DNA

B) The standard curve resulting

from the threshold (Ct) values
of each triplicate plotted against
the logarithm of the relative
concentration of the sample

2020-12-27 anh.annie.ng
4. Phân tích kết quả realtime PCR
 Hệ thống dUTP-UNG
Uracil N-glycosylase (UNG) là một loại enzyme được sử dụng
để loại bỏ ngoại nhiễm trong PCR/real-time PCR.
Cách thức hoạt động:
1) Trong suốt quá trình PCR, hỗn hợp phản ứng có dUTP thay
thế cho dTTP, nên sản phẩm có các dUTP trong cấu trúc.
2) Phản ứng cứ theo chu trình thường qui, nhưng cần 2 phút ở
50°C cho UNG hoạt động. Bước này xảy ra trước khi enzyme
Taq được hoạt hóa và chu trình luân nhiệt bắt đầu.
3) Nếu phản ứng PCR lần sau, nhiễm những sản phẩm PCR
của lần trước, thì UNG sẽ phân hủy những sản phẩm nhiễm
này tại các dUTP.

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 27
 Chứng âm (NC), chứng dương (PC),
chứng nội tại (IC)

• Chứng âm: kiểm tra độ sạch của nguyên liệu

• Chướng dương: kiểm tra hiệu quả hoạt động của hỗn
hợp phản ứng trong cùng 1 lô sản xuất (lot sản phẩm)
• Chứng nội: giúp kiểm soát độc lập hoạt động của từng
hỗn hợp kết hợp

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 29
https://slideplayer.com/slide/16157447/
2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 30
2 31
2
Patient

IC
2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 35
(a) Typical amplification plots obtained by real-time PCR for 7-point series concentration
of HPV-16 E6/7 plasmid DNA. The x axis denotes the cycle number and y axis the
fluorescence intensity over the background

Comparison of standard curves for the crossing points plotted against the HPV-16 E2 and E6/7
concentrations. The x axis denotes the cycle number and y axis the series concentration of
HPV-16 plasmid DNA

2 34
 Patient

PC

IC

2
 5. Ứng dụng realtime PCR

• Biểu hiện gene

• Nhân bản để phát hiện DNA đích
• Phát hiện SNP, phân biệt Allele, Genotyping, Haplotyping
• Đánh giá sự methyl hóa DNA Methylation và Apoptosis
• Phát hiện và định lượng hàm lượng virus, pathogen, GMO.
• Chẩn đoán lâm sàng (Ung thư, đáp ứng điều trị)
………

2020-12-27 anh.annie.nguyen@gmail.com 37
 Tài liệu tham khảo
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4431697/pdf/nihm
s685861.pdf

https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-
documents/technical-article/genomics/qpcr/molecular-beacons

Chem Soc Rev. 2015 May 21; 44(10): 3036–3055

https://www.bio-rad.com/featured/en/sybr-green-for-qpcr.html

FEMS Microbiol Ecol 67 (2009) 6–20

Guidelines for Successful Quantitative Gene Expression in Real-Time

qPCR Assays
https://www.researchgate.net/publication/312016374