Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

Công nghệ vi sinh trong y học

Ngọc Hoàng Trinh

Machine Translated by Google

NỘI DUNG

TUẦN BÀI HỌC NỘI DUNG

(TUẦN) (TIẾT) (NỘI DŨNG )

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

07 3.1 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và ứng dụng

03 08 3.2 Giải trình tự pyro

09 3.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.1 PCR và ứng dụng

PCR (Phản ứng chuỗi Polymerase)

PCR là một phản ứng hóa học in vitro đơn giản cho phép tổng hợp số lượng vô
hạn của chuỗi axit nucleic mục tiêu.

PCR bao gồm DNA mục tiêu, hai mồi, DNA polymerase bền nhiệt ,
hỗn hợp dNTP, MgCl2, KCl và dung dịch đệm Tris-HCl

Hai mồi nằm cạnh chuỗi DNA sợi đôi (dsDNA) cần được khuếch đại và bổ sung cho
các chuỗi đối diện của mục tiêu.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

PCR
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

PCR

Vào cuối mỗi chu kỳ, về mặt lý thuyết sản phẩm PCR được nhân đôi

Sau n chu kỳ PCR, trình tự đích có thể được khuếch đại gấp 2 lần

• Lý tưởng nhất là sau 20 chu kỳ PCR đạt được mức khuếch đại gấp 106 lần

• Lý tưởng nhất là sau 30 chu kỳ PCR đạt được mức khuếch đại gấp 109 lần

Tổng mức khuếch đại được mô tả tốt nhất bằng biểu thức (1+e)n

Trong đó e là hiệu suất khuếch đại (0 e 1)

n là tổng số chu kỳ
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.1 PCR và ứng dụng

PCR phiên mã ngược (RT-PCR)

RT-PCR được phát triển để khuếch đại RNA

mục tiêu.

Trong quá trình này, cDNA đầu tiên được tạo ra từ

Mục tiêu RNA bằng cách sao chép ngược và sau đó cDNA
được khuếch đại bằng PCR
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.1 PCR và ứng dụng

PCR lồng nhau

Nested PCR được phát triển để tăng cả độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR

Nó sử dụng hai cặp mồi khuếch đại và hai vòng PCR.

• Một cặp mồi được sử dụng trong đợt PCR đầu tiên trong 15 đến 30 chu kỳ

• Các sản phẩm của vòng khuếch đại đầu tiên sau đó được đưa vào vòng
khuếch đại thứ hai với bộ mồi thứ hai, chúng gắn vào một trình tự bên
trong trình tự được khuếch đại bởi bộ mồi thứ nhất.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

PCR lồng nhau

Độ nhạy tăng lên do tổng số chu kỳ cao và độ đặc hiệu tăng lên do quá trình ủ của
bộ mồi thứ hai thành các chuỗi chỉ tìm thấy trong các sản phẩm ở vòng đầu tiên,
do đó xác minh được danh tính của sản phẩm ở vòng đầu tiên

Nhược điểm chính của Nested PCR là tỷ

lệ ô nhiễm cao có thể xảy ra trong quá
trình chuyển sản phẩm ở vòng đầu tiên
sang ống thứ hai cho vòng khuếch đại
thứ hai.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.1 PCR và ứng dụng

PCR thời gian thực (đồng nhất, động học)

Thuật ngữ “real-time PCR” mô tả các phương pháp trong đó các bước khuếch đại
và phát hiện mục tiêu diễn ra đồng thời trong cùng một ống

Những phương pháp này yêu cầu máy chu trình nhiệt đặc biệt có quang học chính
xác có thể theo dõi sự phát huỳnh quang từ các giếng mẫu.

Phần mềm máy tính hỗ trợ máy chu trình nhiệt theo dõi dữ liệu trong suốt quá
trình PCR ở mỗi chu kỳ và tạo ra biểu đồ khuếch đại cho từng phản ứng (động học)
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

PCR thời gian thực (đồng nhất, động học)

Hình Sơ đồ khuếch đại PCR thời gian thực với các thuật ngữ và chữ viết tắt thường được sử dụng.
CT, ngưỡng chu kỳ;
Rn, tín hiệu huỳnh quang chuẩn hóa từ thuốc nhuộm phóng viên
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

PCR thời gian thực (đồng nhất, động học)

Sản phẩm PCR được phát hiện khi nó được tạo ra bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang
ưu tiên liên kết với dsDNA.

SYBR green I là một trong những loại thuốc nhuộm đã được sử dụng trong ứng dụng này

• Tính đặc hiệu của PCR thời gian thực cũng có thể được tăng lên bằng cách đưa vào FRET
đầu dò trong hỗn hợp phản ứng.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.2 Giải trình tự pyro

Pyroinating là phương pháp giải trình tự DNA dựa trên nguyên tắc "xây dựng
trình tự bằng tổng hợp", trong đó việc giải trình tự được thực hiện bằng cách
phát hiện nucleotide được kết hợp bởi DNA polymerase.

Pyroinating dựa vào việc phát hiện ánh sáng dựa trên phản ứng dây chuyền khi
pyrophosphate được giải phóng. Do đó, cái tên pyrosequencing
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.2 Giải trình tự pyro

"Giải trình tự bằng cách tổng hợp" bao gồm việc lấy một chuỗi DNA đơn lẻ để
giải trình tự và sau đó tổng hợp chuỗi bổ sung của nó bằng enzym.

Phương pháp pyro xa dựa trên việc phát hiện hoạt động của DNA
polymerase với một enzyme phát quang hóa học khác

• Về cơ bản, phương pháp này cho phép giải trình tự một chuỗi DNA bằng cách tổng hợp
chuỗi bổ sung dọc theo nó, mỗi lần một cặp bazơ và phát hiện xem bazơ nào thực sự
được thêm vào ở mỗi bước.

• DNA mẫu là bất động và các dung dịch nucleotide A, C, G và T lần lượt được thêm vào
và loại bỏ khỏi phản ứng. Ánh sáng chỉ được tạo ra khi dung dịch nucleotide bổ sung
cho bazơ chưa ghép đôi đầu tiên của khuôn mẫu.

• Trình tự các dung dịch tạo ra tín hiệu phát quang hóa học cho phép
xác định trình tự của mẫu
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), còn được gọi là giải trình tự thông
lượng cao, là một công nghệ giải trình tự DNA mang tính cách mạng đã làm
thay đổi nghiên cứu về gen và khoa học y sinh.

NGS cho phép giải trình tự nhanh chóng và tiết kiệm chi phí với số lượng lớn
DNA hoặc RNA, cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu về gen, phiên mã, biểu
sinh...
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

Giải trình tự song song: Nền tảng NGS thực hiện giải trình tự song song trên
quy mô lớn, nghĩa là chúng có thể giải trình tự đồng thời hàng triệu đoạn
DNA hoặc phân tử RNA trong một lần chạy.

• Tính chất thông lượng cao này làm giảm đáng kể thời gian và chi phí của
trình tự.

Đọc ngắn: NGS thường tạo ra các chuỗi DNA ngắn (đọc) có chiều dài từ vài
chục đến vài trăm cặp bazơ.

• Dữ liệu tích lũy từ nhiều lần đọc ngắn có thể được tập hợp lại để tái tạo lại
các vùng gen dài hơn.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

Ứng dụng: NGS được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm
genomics (giải trình tự toàn bộ bộ gen, giải trình tự exome), phiên mã (giải
trình tự RNA), biểu sinh học (phân tích methyl hóa DNA), metagenomics (nghiên
cứu về cộng đồng vi sinh vật), v.v.

•
Nó có các ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng, khám phá thuốc, sinh học tiến
hóa và y học cá nhân hóa.
Machine Translated by Google

Chương 3. VI SINH PHÂN TỬ

3.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)

Nền tảng giải trình tự: Một số nền tảng và công nghệ giải trình tự tồn tại
trong lĩnh vực NGS, bao gồm Illumina (sử dụng trình tự theo tổng hợp), Ion
Torrent (đo sự thay đổi độ pH trong quá trình tổng hợp DNA) và Paci ic
Biosciences (đo tổng hợp DNA theo thời gian thực) .
Machine Translated by Google

Hết Chương 3