Trao đổi trực tuyến tại:

http://www.mientayvn.com/Y_online.html
GIẢI TRÌNH TỰ DNA
DNA SEQUENCING
TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết

quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong
đoạn DNA đó.
Vd:
5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC
CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG
TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA
GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA
GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG
CTTAATAGAACAANAAA3’
2. HAI PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Phương pháp hoá học giải trình tự DNA

của Maxam & Guilbert (1977)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

Walter Gilbert

Phương pháp enzyme giải trình tự của

Frederick Sanger (1977)
Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC
1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32P).

2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide
trên đoạn DNA
3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4
hàng của một gel polyacrylamide biến tính

Autoradiography
2.2. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM
Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo
sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong
ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men
polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ
bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ
dài khác nhau.

dNTP ddNTP
 Mồi đƣợc đánh dấu

Bốn phản ứng polymer hoá Tỉ lệ dNTP và ddNTP

xảy ra trong 4 ống riêng biệt = 100 : 1
 MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P35

A C G
T
T
3’
C
G
C
A
G
T
C
C
T
A
G
C
T
Sequence 5’ to 3’ T
A
C G
G C
G
G G
C G 5’
G Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng
T
xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel
sẽ hiện trên phim.
ĐÁNH DẤU ddNTP

1. Gắn ddNTP ngẫu

nhiên, khi xẩy ra,
p/ứng ngừng.
2. Vì nhiều copy của Sequence-specific
DNA đích được tạo primer

đồng thời, nên các

sản phẩm DNA
được tổng hợp mới
của tất cả các kích
thước đều hiện diện
với tận cùng là các
ddNTP
 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

1. Dùng gel polyacrylamide biến

tính, có độ phân giải cao, có
thể phân biệt các đoạn DNA
khác nhau chỉ 1 nucleotid.
2. Gel polyacrylamide thường
chứa urea (tác nhân làm biến
tính DNA)
 3. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Bƣớc 1: Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR

On to sequencing….

Sản phẩm PCR tinh sạch

PCR + nước
+ DNA đích
+ Taq polymerase
+ Mồi và dNTPs Đo nồng độ DNA bằng máy
+ PCR buffer, etc…. hay ước lượng qua điện di
 Bƣớc 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự
(cycle sequencing reaction)

denaturation

Product
extension
Primer annealing

PCR machine Tủa sản phẩm giải trình tự

loại bỏ chất đánh dấu thừa
 Bƣớc 3: Điện di trên máy giải trình tự

1. Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.

2. Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích
thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực
phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser
và bộ phận detector.
3. Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh
quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.
4. Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’
đến 3’, từ trái sang phải.


Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes

Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…
 4. HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ

1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh

2. Chất lượng và nồng độ DNA đích
3. Mồi đặc hiện với nồng độ thích hợp
4. Sản phẩm PCR phải tinh sạch
5. Phải xác định đúng hàm lượng mồi và sản phẩm
PCR tinh sạch cho p/ứng chu kỳ giải trình tự
Hệ thống giải trình tự Trugene
Siemens Medical Solutions Diagnostics
CEQ 8000 (Beckman Coulter)
CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG

ABI 3130 ABI 3130 XL

4 Cappilaries 16 Cappilaries
ABI 3730
 5. PYROSEQUENCING
Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s.

Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence

=pyrophosphate

= pyrophosphate

Giải trình tự bằng phƣơng pháp tổng hợp, không điện di

~500 MB on one plate, in just a few hours.
 PYROSEQUENCING

Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase,

ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, và cơ chất là APS
(adenosine 5’phosphosulphat) và luciferin
Step 2: 4 dNTP được đưa vào phản ứng. DNA
polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA tiếp theo
primer nếu nó bổ xung với DNA đích. Mỗi khi 1 dNTP gắn
vào, sẽ phóng thích 1 pyrophosphat (PPi)
 PYROSEQUENCING

Step 3: ATP sulfurylase

xúc tác chuyển PPi
thành ATP với sự có mặt
của APS (adenosin
5’phosphosulphat).
ATP tạo thành cung cấp
năng lượng cho luciferin
thành oxyluciferin nhờ
enzym luciferase, ánh
sáng được nhìn thấy tỉ lệ
với số ATP tiêu thụ.
Step 4: Apyrase, enzym phá
PYROSEQUENCING
các dNTP và ATP không sử
dụng.
Step 5: 4 dNTP khác được
đưa vào phản ứng.

Ứng dụng
pyrosequencing:
- Genotype virus và vi khuẩn
Đặc biệt là loại mới, nguy
hiểm.
- Phát hiện đột biến
Kháng thuốc
- Định danh vi khuẩn, nấm
- Phân tích SNP-Single
nucleotide polymorphisms
 Pyrosequencing technology

Polymerase Apyrase
(DNA)n + dNTP (DNA)n-1 + PPi dNTP dNTP + dNMP + phosphate

ATP Apyrase ADP + AMP + phosphate

STEP 1: Hybridization of sequencing primer to ssDNA
Incorporation dNTP with release of PPi

STEP 3: Degradation of unincorporated dNTP’s and excess

ATP by apyrase. After degradation the next dNTP
is added

light
Sulfurylase

APS +Ppi ATP

Luciferin oxyluciferin

Luciferase Time

ATP Light

STEP 2: Conversion of to ATP by sulfurylase

Released ATP drives conversion of STEP 4: The complementary DNA strand is build up as the
luciferin to oxyluciferin by enzym luciferase. process continues. The sequence is determined from
which produces light that is detected by the CCD the signal peaks in the pyrogram
and results in a pyrogram
6. ỨNG DỤNG CỦA GIẢI TRÌNH TỰ DNA

6.1. Giải trình tự bộ gen ngƣời

HGP (10/1990): Viện quốc gia Y tế Hoa kỳ (3 tỉ USD)
- 6/2000: Crag Venter và Francis Collins
97% bộ gen người được giải mã
- 4/2003 (kỷ niệm 50 năm mô hình DNA của W-C)
Hoàn tất giải mã bộ gen người
- Bước vào kỷ nguyên Post-genomic và Proteomic
- Giá thành 2001: 1us / 1bp,
10 đến 15 năm nữa: 0,01 us/ 1bp
6.2. Định danh VSV: VK kỵ khí: giải trình tự một
đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 16S
6.3. Định danh nấm: giải trình tự một đoạn đặc hiệu
cho giống và loài ở gen 28S rDNA
6.3. Xác định genotype của các VR, VSV…
HCV: genotype 1 (1a, 1b), 2 (2a, 2b, 2c)….
HPV: high-risk, low-risk…
6.4. Phát hiện các đột biến, đột biến kháng thuốc
 HBV kháng lamivudine: Lamivudin ức chế virus và
làm giảm tình trạng viêm. Đột biến thường xảy ra
trong vùng YMDD (tyrosine, methionine, aspartate,
aspartate) của protein polymerase của virus.
 Lao kháng thuốc Rifampicine, INH…
Sau khi xác định trình tự một đoạn DNA quan tâm, so
sánh với ngân hàng dữ liệu gene của NCBI
(National Center Biotechnology Information)
….
 MỘT SỐ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ MỚI

Genome Analyzer Iix - Illumina Genome Sequencer FLX System

1 million high-quality reads per run and

read lengths of 400 bases