Machine Translated by Google
Chương 4
Phản ứng chuỗi polymerase định lượng
L. Overbergh, S. Vig, F. Coun và C. Mathieu KU
Leuven, Leuven, Bỉ
4.1 LỊCH SỬ PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật dựa trên
sự khuếch đại theo cấp số nhân của axit nucleic bằng
polymerase Thermus Aquas (Taq) chịu nhiệt. Phương pháp này
sử dụng một cặp mồi oligonucleotide tổng hợp, mỗi mồi lai
với một chuỗi DNA sợi đôi (DSDNA) mục tiêu quan tâm, với
cặp mồi trải dài trên một vùng sẽ được khuếch đại theo cấp
số nhân. Các mồi được ủ hoạt động như một chất nền cho Taq
DNA polymerase, tạo ra chuỗi DNA bổ sung thông qua việc bổ
sung tuần tự các deoxynucleotide (dNTP), đã được thêm vào
hỗn hợp phản ứng (Hình 4.1). Về mặt thực nghiệm, quy trình
này thường bao gồm ba bước:
1. bước biến tính ở 94 hoặc 95C, 2.
ủ mồi với chuỗi DNA sợi đơn (ssDNA) ở 55e65C, và 3. kéo
dài mồi ở 72C.
Bằng cách lặp lại các bước này nhiều lần, thường là 30
đến 40 chu kỳ, chuỗi đích DNA thu được sẽ được khuếch đại
theo cấp số nhân, tạo ra hàng tỷ bản sao của cái gọi là
“bộ khuếch đại”. Dựa trên nguyên tắc đơn giản này, phản
ứng khuếch đại PCR cổ điển sẽ bao gồm ba giai đoạn (Hình
4.2):
1. Khuếch đại theo cấp số nhân: Ở mỗi chu kỳ, lượng sản
phẩm tăng gấp đôi (giả sử hiệu suất phản ứng 100%).
Phản ứng rất nhạy cảm và cụ thể.
2. Pha tuyến tính (san bằng): Phản ứng chậm lại do hoạt
động của Taq DNA polymerase giảm và việc tiêu thụ các
thuốc thử như dNTP và mồi.
3. Giai đoạn ổn định: Phản ứng đã kết thúc và không còn
axit nucleic nào được tổng hợp do cạn kiệt thuốc thử
và Taq DNA polymerase.
Chẩn đoán phân tử. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-802971-8.00004-3 Bản
quyền © 2017 Elsevier Ltd. Mọi quyền được bảo lưu.
Kỹ thuật này được Kary Mullis mô tả lần đầu tiên vào
những năm 1980 (Faloona và cộng sự, 1986), nhờ đó ông đã
nhận được giải Nobel năm 1993. PCR điểm cuối cổ điển này
là phản ứng có/không vì nó đo sự hình thành sản phẩm DNA
sau một quá trình số chu kỳ cố định, nghĩa là ở giai đoạn
ổn định của phản ứng, do đó tạo ra thông tin định tính về
sự hiện diện hay vắng mặt của một gen hoặc mRNA nhất định,
nhưng không tiết lộ bất kỳ thông tin nào về số lượng DNA hoặc RNA.
Kỹ thuật PCR này đã trở thành một trong những công cụ có
ảnh hưởng nhất trong khoa học sinh học và y tế (Guyer và
Koshland, 1989).
Trong những năm qua, nhiều cải tiến và ứng dụng cho
PCR điểm cuối cổ điển này đã được mô tả, bao gồm PCR bán
định lượng và PCR cạnh tranh định lượng, trước khi PCR
thời gian thực ra đời. Phương pháp thích ứng đầu tiên đo
lường sự tích lũy sản phẩm PCR trong giai đoạn hàm mũ của
phản ứng, dẫn đến dữ liệu bán định lượng. Phương pháp này
đòi hỏi phải dừng phản ứng PCR sau một số chu kỳ được xác
định bằng thực nghiệm. Hơn nữa, các mẫu từ một thiết lập
thử nghiệm duy nhất chỉ có thể được phân tích trong phạm
vi tuyến tính tương đối nhỏ. Ngoài ra, PCR cạnh tranh đã
được phát triển, mang lại dữ liệu định lượng. Tuy nhiên,
phương pháp này cần được tối ưu hóa rộng rãi vì nó đòi hỏi
sự đồng khuếch đại của cơ chế kiểm soát cDNA hoặc RNA bên
trong; loại thứ hai được sử dụng cụ thể trong các ứng dụng
PCR định lượng phiên mã ngược (qPCR; xem sau) (đối thủ
cạnh tranh) với mẫu chưa biết trong cùng một ống. Trong
trường hợp này, việc định lượng được thực hiện bằng cách
chuẩn độ một lượng mẫu đích chưa biết dựa trên một loạt
pha loãng của các lượng đã biết của chất chuẩn. Kiểm soát
nội bộ bao gồm DNA hoặc RNA mục tiêu đã được sửa đổi một
chút. Do đó, một bộ mồi được thiết kế để hỗ trợ mục tiêu
và đối thủ cạnh tranh, với cùng hiệu quả, mặc dù chúng có
thể được phân biệt với nhau, ví dụ, bằng sự khác biệt về
chiều dài hoặc các vị trí hạn chế.
41
Machine Translated by Google

HÌNH 4.1 Nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase (PCR). PCR là một kỹ thuật dựa trên sự khuếch đại theo cấp số nhân của axit nucleic. Phương pháp này
sử dụng một cặp mồi oligonucleotide tổng hợp, mỗi mồi lai với một chuỗi DSDNA mục tiêu quan tâm, với cặp mồi trải dài trên một vùng sẽ được khuếch
đại theo cấp số nhân bởi Taq DNA polymerase, tạo ra chuỗi DNA bổ sung. Quá trình này thường bao gồm ba bước: (1) biến tính ở 94 hoặc 95C; (2) ủ
mồi ở 55e65C; và (3) kéo dài mồi ở 72C. Bằng cách lặp lại các bước này nhiều lần, thường là 30 đến 40 chu kỳ, chuỗi DNA mục tiêu thu được sẽ được
khuếch đại theo cấp số nhân, tạo ra hàng tỷ bản sao của bộ khuếch đại.

HÌNH 4.2 Sơ đồ khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) điển hình. Phản ứng PCR bao gồm ba giai đoạn: pha hàm mũ, pha tuyến tính và pha ổn
định. Trong biểu đồ khuếch đại PCR cổ điển, số chu kỳ được vẽ theo tín hiệu DRn (sự khác biệt giữa huỳnh quang được phát hiện tại một điểm nhất
định của phản ứng và huỳnh quang ban đầu hoặc phát xạ huỳnh quang của đường cơ sở), được thể hiện ở pha tuyến tính ( A) hoặc ở pha logarit (B).
Ngưỡng được chọn dựa trên sự thay đổi của đường cơ sở. Chu kỳ ngưỡng là điểm mà huỳnh quang được phát hiện vượt qua ngưỡng đã cho này.
Machine Translated by Google
(Clementi và cộng sự, 1994). Phương pháp này cung cấp một chiến
lược để định lượng chính xác, nhưng việc xây dựng các tiêu
chuẩn nội bộ đòi hỏi nhiều kỹ thuật phức tạp và tốn nhiều công sức. định lượng RNA, đã được giới thiệu gần như cùng thời điểm với
Để phát hiện các sản phẩm PCR bằng một trong hai phương
pháp này, có thể sử dụng một số kỹ thuật phát hiện, tất cả đều
yêu cầu các thao tác hậu PCR quá mức. Phương pháp được sử dụng
phổ biến nhất là điện di trên gel agarose với nhuộm ethidium
bromide hoặc SYBR Green, đánh dấu và phân tích huỳnh quang bằng
gel polyacrylamide, đánh dấu phóng xạ, và phương pháp làm mờ
hoặc phát hiện phương Nam bằng phương pháp tạo ảnh lân quang.
Hạn chế lớn khi sử dụng các hệ thống phát hiện cổ điển này là
sử dụng các hóa chất độc hại và nguy cơ ô nhiễm trong phòng thí
nghiệm. Hơn nữa, tất cả các thao tác sau PCR này đều rất tốn
thời gian.
Sự phát triển của một quy trình mới vào đầu những năm 1990
để phân tích và định lượng DNA hoặc RNA, dựa trên PCR thời gian
thực động học huỳnh quang, cho phép định lượng sản phẩm PCR
trong thời gian thực (Higuchi et al., 1993; Gibson và cộng sự,
1996; Heid và cộng sự, 1996). Kỹ thuật nhạy và chính xác này
cho phép định lượng sản phẩm PCR trong giai đoạn hàm mũ của
phản ứng PCR. Điều này hoàn toàn trái ngược với các xét nghiệm
điểm cuối cổ điển, vì chúng được thiết kế để cung cấp thông
tin nhanh như chính quá trình khuếch đại, do đó không yêu cầu
thao tác sau PCR. Sự phát triển của kỹ thuật thời gian thực này
(ngày nay thường được gọi là qPCR) một lần nữa lại có tác động
mang tính cách mạng đối với sinh học phân tử.
Thật vậy, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu
và chẩn đoán, với vô số nhà nghiên cứu góp phần vào sự tăng
trưởng theo cấp số nhân của việc sử dụng PCR trong nhiều ứng
dụng, chẳng hạn như DNA-, RNA- (mRNA mã hóa, snRNA không mã
hóa và microRNA), hoặc gần đây hơn là các ứng dụng dựa trên
pro tein- (xét nghiệm thắt gần miễn dịch hoặc qPCR). Ngày nay,
qPCR được công nhận là tiêu chuẩn vàng trong phân tích định
lượng axit nucleic vì độ nhạy và khả năng tái sản xuất cao,
phạm vi rộng.
HÌNH 4.3 Các ấn phẩm về phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực. Các từ khóa “thời gian thực”, “thời gian thực” hoặc “thời gian thực” và “PCR”' (A)
hoặc “thời gian thực”, “thời gian thực” hoặc “thời gian thực” và “PCR phiên mã ngược” đã được nhập vào công cụ tìm kiếm PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
pubmed). Số lượng trích dẫn theo năm được hiển thị. (A) ấn phẩm qPCR; (B) Các ấn phẩm RT-qPCR.
Chương PCR định lượng | 4 43
phạm vi năng động, dễ sử dụng và chi phí tương đối thấp.
QPCR phiên mã ngược (RT-qPCR), một kỹ thuật khác cho phép đo
qPCR. Bước sau bao gồm một bước bổ sung, cụ thể là chuyển đổi
RNA thành DNA bổ sung bằng phản ứng sao chép ngược enzyme. Kỹ
thuật RT-qPCR cũng tuân theo mức tăng trưởng theo cấp số nhân
tương tự theo thời gian, mặc dù ở mức độ thấp hơn (Hình 4.3A và
B).
4.2 NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE
THỜI GIAN THỰC
Khoảng 10 năm sau khi kỹ thuật PCR điểm cuối cổ điển ra đời,
sự ra đời của đầu dò oligonucleotide nhãn kép đã dẫn đến việc
phát minh ra qPCR.
Trong những năm qua, kỹ thuật mang tính cách mạng mới này đã
giới thiệu các loại phương pháp phát hiện khác nhau, tất cả đều
được sử dụng ngày nay: đầu dò thủy phân, thuốc nhuộm xen kẽ,
đầu dò hybridization, kết hợp primeeprobe và axit nucleic biến
tính.
4.2.1 Phản ứng chuỗi polymerase định
lượng sử dụng đầu dò thủy phân
PCR thời gian thực lần đầu tiên được mô tả bằng cách sử dụng
đầu dò thủy phân (Heid và cộng sự, 1996; Gibson và cộng sự,
1996), thường được gọi là hệ thống TaqMan. Kỹ thuật này dựa
trên sự kết hợp của hai quá trình quan trọng: thứ nhất, xây
dựng các đầu dò oligonucleotide có nhãn kép, còn được gọi là
đầu dò thủy phân hoặc TaqMan, phát ra tín hiệu huỳnh quang khi
phân tách, dựa trên nguyên lý truyền năng lượng cộng hưởng
huỳnh quang (FRET), một cơ chế cho phép truyền năng lượng giữa
hai phân tử nhạy sáng thông qua liên kết lưỡng cực không bức xạ
(Stryer, 1978; Cardullo và cộng sự, 1988); và thứ hai, việc
phát hiện ra rằng
Machine Translated by Google
44 Chẩn đoán phân tử
Taq DNA polymerase sở hữu, bên cạnh hoạt tính polymerase
30 -> 50 của nó, còn có hoạt tính exonuclease 50 -> 30 ,
có thể được khai thác để làm suy giảm đầu dò đánh dấu huỳnh
quang (Holland et al., 1991). Đầu dò oligonucleotide được
sử dụng trong xét nghiệm này không thể kéo dài được ở đầu
30 của nó và được dán nhãn kép bằng chất fluorochrome báo
cáo, ví dụ, FAM (6-carboxyfluorescein) và chất khử chất
fluorochrome, ví dụ, TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine).
Nó được thiết kế để gắn vào trình tự mục tiêu bên trong
mồi trong giai đoạn gắn mồi và kéo dài của phản ứng PCR. Ở
dạng tự do, nguyên vẹn, không thể đo được sự phát xạ huỳnh
quang vì sự phát xạ huỳnh quang của thuốc nhuộm báo cáo
được hấp thụ bởi thuốc nhuộm dập tắt. Tuy nhiên, khi ủ
đầu dò với một trong các chuỗi mục tiêu, đầu dò sẽ bị suy
giảm do hoạt động exonuclease 50 -> 30 của Taq polymerase.
Do đó, thuốc nhuộm báo cáo và chất khử chất khử bị tách ra
và sự phát xạ thuốc nhuộm báo cáo không còn được chuyển
sang thuốc nhuộm tôi (không còn FRET nữa), dẫn đến sự gia
tăng phát xạ huỳnh quang của chất báo cáo (ví dụ, đối với
FAM ở bước sóng 518 nm).
Quá trình này xảy ra trong mọi chu kỳ và không ảnh hưởng
đến sự tích lũy theo cấp số nhân của sản phẩm PCR. Sự gia
tăng huỳnh quang được đo theo chu kỳ và tương quan trực
tiếp với lượng sản phẩm PCR được hình thành (Gibson và cộng
sự, 1996; Heid và cộng sự, 1996) (Hình 4.4).
Hiện có các loại thuốc nhuộm báo cáo khác ngoài thuốc
nhuộm báo cáo huỳnh quang FAM được sử dụng phổ biến. Chúng
bao gồm TET (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), JOE (2,7,-
dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein), HEX
(hexacholoro-6-carboxyfluorescein), VIC, Texas Red hoặc
Cy5. Việc lựa chọn các loại thuốc nhuộm báo cáo khác nhau,
với sự trùng lặp nhỏ trong quang phổ phát xạ huỳnh quang,
giúp có thể thực hiện các phản ứng PCR đa kênh, do đó
khuếch đại đồng thời các mục tiêu DNA khác nhau. Tương tự,
có sự lựa chọn giữa các loại thuốc nhuộm khử chất khử khác
nhau. Thuốc nhuộm khử chất khử được sử dụng phổ biến nhất
là TAMRA. DABCYL (4-(4Ά-dimethylaminophenylazol) axit
benzoic) cũng có thể được sử dụng làm thuốc nhuộm khử chất
khử, nhưng việc sử dụng nó phổ biến hơn nhiều trong các
đầu dò đèn hiệu phân tử (xem phần sau). Ưu điểm của việc
sử dụng DABCYL là khả năng phát huỳnh quang tự động giảm so vớimethylidene)
TAMRA. Ngoài]-1-metyl-quinolinium
HÌNH 4.4 Đầu dò thủy phân hoặc TaqMan. Đầu dò TaqMan được dán nhãn kép bị phân cắt bởi hoạt động exonuclease 50 của Taq DNA polymerase
trong bước mở rộng của phản ứng chuỗi polymerase. Chất huỳnh quang báo cáo (R) và chất khử chất khử (Q) được tách ra, dẫn đến sự gia tăng
phát xạ huỳnh quang.
fluorochromes chất khử màu tối đã có sẵn, được sử dụng
thường xuyên hơn các chất khử chất khử cổ điển. Chúng hấp
thụ năng lượng phát ra từ thuốc nhuộm phóng xạ và giải
phóng nó dưới dạng nhiệt chứ không phải dưới dạng huỳnh
quang. Điều này dẫn đến tín hiệu nền thấp hơn và do đó độ
nhạy cao hơn.
Một thiết kế đầu dò khác được đặc biệt quan tâm là đầu
dò liên kết rãnh nhỏ (MGB). Giống như đầu dò Taq Man, đây
là những đầu dò thủy phân có phân tử liên kết rãnh nhỏ gắn
vào phần cuối của đầu dò, dẫn đến ái lực cao hơn với vùng
mục tiêu DNA bổ sung, cho phép xây dựng các thiết kế đầu
dò ngắn hơn với độ đặc hiệu cao hơn. Chúng nhạy hơn, đặc
biệt là với các cặp bazơ không khớp đơn, và do đó phù hợp
lý tưởng cho việc phát hiện đa hình thái nucleotide đơn
(SNP) và phân biệt alen (Kutyavin và cộng sự, 2000).
4.2.2 Phản ứng chuỗi polymerase
định lượng sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ DNA
Kỹ thuật qPCR được sử dụng rộng rãi thứ hai dựa trên việc
phát hiện và định lượng các sản phẩm PCR bằng cách sử dụng
thuốc nhuộm xen kẽ DNA huỳnh quang. Nguyên lý của kỹ thuật
này lần đầu tiên được mô tả bởi Higuchi (Higuchi và cộng
sự, 1993), người đã theo dõi sự gia tăng huỳnh quang
ethidium bromide bằng cách sử dụng máy ảnh thiết bị tích
điện kép, một phương pháp được gọi là PCR động học. Ngay
sau đó, SYBR Green I (N0 ,N0 -dimetyl-N-[4-[(E)-(3-metyl-1,3-
benzothiazol-2-ylidene)metyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2 -
yl]-N-propylpropane-1,3-diamine), một loại thuốc nhuộm
cyanine không đối xứng ít độc hơn ethidium bromide, được
sử dụng rộng rãi làm thuốc nhuộm kết hợp với dsDNA (Zipper
và cộng sự, 2004). Trong khi đó, nhiều loại thuốc nhuộm
cyanine bất đối xứng khác đã có sẵn, chẳng hạn như SYBR
Green Save, EvaGreen, SYBR Gold, SYTO, BEBO (4- [(3-methyl-6-
(benzothiazol-2-yl)-2, 3-dihydro-(benzo-1,3- thiazole)-2-
metylidene)]-1-metyl-pyridinium iodua)
(Bengtsson và cộng sự, 2003), và BOXTO (4-[6-(benzoxazole
2-yl-(3-methyl-)-2,3-dihydro-(benzo-1,3-thiazole)-2-
ra, một số clorua) (Ahmad,
Machine Translated by Google

Chương PCR định lượng | 4 45

HÌNH 4.5 Thuốc nhuộm xen kẽ DNA. Thuốc nhuộm xen kẽ DNA kết hợp vào rãnh nhỏ của DSDNA. Trong dung dịch không có ánh sáng huỳnh quang phát ra (vòng tròn màu
xanh lá cây), nhưng khi kết hợp với DSDNA thuốc nhuộm sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang (ngôi sao màu xanh lá cây).

HÌNH 4.6 Phân tích đường cong nóng chảy sau phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khi sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ DNA. Bằng cách tăng dần nhiệt độ sau phản ứng
khuếch đại PCR từ 60C lên 95C, độ huỳnh quang của thuốc nhuộm giảm nhanh khi DSDNA tan chảy thành chủng ssDNA (A). Đạo hàm âm đầu tiên của huỳnh quang (trục
y) được vẽ theo nhiệt độ (trục x) (B và C). Trong trường hợp khuếch đại DNA cụ thể, quan sát thấy một đỉnh đơn (đỉnh một) (B), trong khi trong trường hợp hình
thành mồi-dimer, quan sát thấy đỉnh thứ hai ở nhiệt độ thấp hơn (đỉnh hai) (C). Tm, nhiệt độ nóng chảy.
Machine Translated by Google

46 Chẩn đoán phân tử

2007). Tất cả các thuốc nhuộm này kết hợp vào rãnh nhỏ của DSDNA, 4.2.3 Phản ứng chuỗi polymerase
nhờ đó khả năng phát huỳnh quang của nó được tăng cường đáng kể.
định lượng sử dụng đầu dò lai
Trong quá trình phản ứng PCR, lượng mục tiêu sợi đôi sẽ tăng
theo cấp số nhân, song song với đó là sự gia tăng trong việc Phân tích PCR định lượng với các đầu dò lai sử dụng hai đầu dò

kết hợp thuốc nhuộm và phát xạ huỳnh quang. Trong mỗi chu kỳ, sự theo trình tự cụ thể đặt cạnh nhau, còn được gọi là HybProbes.

phát huỳnh quang sẽ tăng dần trong giai đoạn kéo dài của phản Sự phát triển của hệ thống này lần đầu tiên được mô tả vào giữa
những năm 1980 (Heller và Morrison, 1985).
ứng và sẽ ở mức thấp hoặc không có trong giai đoạn biến tính
(Hình 4.5). Mỗi đầu dò có một thiết bị phóng huỳnh quang duy nhất; cái đầu

Những nhược điểm khác nhau đã được báo cáo khi sử dụng SYBR Green tiên là fluorophore cho ở đầu 30 và cái còn lại là fluorophore

I, trái ngược với các thuốc nhuộm xen kẽ DNA khác, chẳng hạn như nhận ở đầu 50 . Các trình tự của hai mẫu dò được thiết kế để gắn

ức chế khuếch đại PCR theo cách phụ thuộc vào nồng độ, ảnh hưởng các trình tự mục tiêu ở rất gần nhau (tức là trong phạm vi 1e5

đến nhiệt độ nóng chảy DNA và liên kết ưu tiên với các chuỗi DNA nucleotide), theo cách sắp xếp từ đầu đến đuôi, đưa hai thuốc

cụ thể ( Gudnason và cộng sự, 2007). Mặc dù vậy, SYBR Green I nhuộm đến rất gần nhau. Miễn là đầu dò ở dạng tự do, không liên

vẫn là thuốc nhuộm xen kẽ được sử dụng rộng rãi nhất. kết thì tín hiệu huỳnh quang từ thuốc nhuộm phóng viên sẽ không
được phát hiện. Tuy nhiên, trong giai đoạn ủ của phản ứng PCR,
các đầu dò gắn với trình tự mục tiêu và hai chất huỳnh quang

Ưu điểm lớn nhất của việc sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ so với tiến đến gần nhau.

việc sử dụng đầu dò hoặc mồi có nhãn huỳnh quang là chúng có thể
được sử dụng với bất kỳ cặp mồi nào cho bất kỳ mục tiêu nào. Do Điều này sẽ dẫn đến sự phát xạ ánh sáng từ chất fluorochrome cho,

đó, phương pháp này có thể dễ dàng được sử dụng cho các xét ánh sáng này sẽ kích thích chất fluorochrome nhận, một quá trình

nghiệm PCR ghép kênh. Hơn nữa, nó là một loại vật liệu gốc rẻ được gọi là truyền năng lượng cộng hưởng. Thuốc nhuộm ở một trong

hơn và đòi hỏi ít kiến thức chuyên môn hơn so với thiết kế đầu các đầu dò truyền năng lượng, cho phép đầu dò còn lại làm tiêu

dò có nhãn huỳnh quang. Do đó, độ đặc hiệu bị giảm đi do nguy cơ tan huỳnh quang ở bước sóng khác. Lượng huỳnh quang phát ra có

khuếch đại các sản phẩm PCR không đặc hiệu hoặc các chất làm mờ thể được đo trong giai đoạn ủ của phản ứng PCR và tỷ lệ thuận

mồi. Sau khi kết thúc phản ứng PCR, phân tích đường cong nóng với lượng DNA mục tiêu được tạo ra trong quá trình PCR (Bernard

chảy phải được thực hiện để phân biệt giữa các sản phẩm PCR đặc và Wittwer, 2000) (Hình 4.7). Các đầu dò cầu nối Hy thường được

hiệu và không đặc hiệu (Ririe et al., 1997). Bằng cách này, phần chế tạo với FAM là fluorophore 30 nhà tài trợ và một loạt các

huỳnh quang có nguồn gốc từ mục tiêu cụ thể có thể được phân fluorophores nhận khác nhau thường được sử dụng (ví dụ: ROX,

biệt với phần huỳnh quang có nguồn gốc từ các chất làm mờ mồi Cy5, LC Red640, LC Red705) làm fluorophore chấp nhận 50 .

hoặc các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Phân tích này được
thực hiện bằng cách tăng dần nhiệt độ từ 60C lên 95C, trong đó
sự phát xạ huỳnh quang được theo dõi liên tục. Sự phát xạ huỳnh Một dạng đầu dò lai khác là đèn hiệu phân tử, chứa cấu trúc

quang sẽ cao ở nhiệt độ thấp (khi tất cả các sản phẩm PCR đều là thân và vòng ở dạng nguyên vẹn, không bị ràng buộc. Chúng được

sợi đôi) và nó sẽ giảm đáng kể xung quanh nhiệt độ nóng chảy của dán nhãn kép, với một rophore fluo liên kết với một đầu của phân

sản phẩm PCR. Cơ sở lý luận đằng sau việc phân tích đường cong tử và một chất khử liên kết với đầu kia (Tyagi và Kramer, 1996).

nóng chảy này dựa trên thực tế là các sản phẩm PCR có độ dài và/ Sự phản xạ huỳnh quang bị dập tắt khi đầu dò ở trong cấu trúc

hoặc hàm lượng guanine-cytosine khác nhau sẽ có nhiệt độ nóng giống như chiếc kẹp tóc do khoảng cách giữa chất khử và chất

chảy khác nhau, điều này sẽ tạo ra các đỉnh khác biệt khi vẽ đồ huỳnh quang, dẫn đến sự hấp thụ hoàn toàn bất kỳ photon nào phát

thị đạo hàm âm đầu tiên của huỳnh quang so với nhiệt độ. ra bởi chất huỳnh quang. Khi trình tự đầu dò trong vòng lặp gắn
với trình tự mục tiêu bổ sung, sự thay đổi về hình dạng cho phép
hình thành cấu trúc tuyến tính trong đó sự truyền năng lượng
huỳnh quang không còn xảy ra nữa, dẫn đến sự gia tăng phát xạ

Do chiều dài ngắn hơn nên các dimer mồi sẽ có nhiệt độ nóng chảy huỳnh quang (Hình 4.8) . Đèn hiệu phân tử đặc biệt thích hợp để

thấp hơn so với sản phẩm PCR cụ thể. Do đó, điều này sẽ dẫn đến xác định đột biến điểm. Chúng có thể phân biệt các mục tiêu chỉ

đỉnh huỳnh quang ở nhiệt độ thấp hơn khi vẽ đồ thị đạo hàm âm khác nhau bởi một nucleotide duy nhất và chúng đặc biệt hơn đáng

đầu tiên của huỳnh quang so với nhiệt độ. Mặt khác, một sản phẩm kể so với các đầu dò thủy phân thông thường có chiều dài tương

PCR, chẳng hạn như làm nhiễm bẩn DNA bộ gen, sẽ có nhiệt độ nóng đương.

chảy cao hơn, nhiệt độ này một lần nữa sẽ được phản ánh trong
đạo hàm âm đầu tiên của huỳnh quang so với nhiệt độ (Hình 4.6) .
Các ví dụ khác về đầu dò lai đã được phát triển là HyBeacon,
MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense, Yin-Yang hoặc đầu dò dịch
chuyển.
Machine Translated by Google

Chương PCR định lượng | 4 47

HÌNH 4.7 Đầu dò lai. Hai đầu dò được sử dụng: một đầu mang fluorophore nhận và đầu kia mang fluorophore cho. Khi cả hai chất phát huỳnh quang
được đưa đến gần nhau, tức là khi đầu dò gắn với trình tự mục tiêu, chất cho có thể kích thích chất nhận thông qua việc truyền năng lượng cộng
hưởng huỳnh quang và sự phát huỳnh quang sẽ xảy ra.

HÌNH 4.8 Đèn hiệu phân tử. Đèn hiệu phân tử là đầu dò hình kẹp tóc. Chất huỳnh quang và chất khử chất ở gần nhau khi đầu dò ở trạng thái tự do,
không bị ràng buộc. Khi đầu dò gắn vào chuỗi mục tiêu bổ sung, hình dạng của nó sẽ thay đổi. Chất khử và chất huỳnh quang được tách ra, gây ra sự
phát huỳnh quang.

4.2.4 Phản ứng chuỗi polymerase định lượng sử Đuôi vòng gốc được tách ra khỏi mồi bằng bộ chặn PCR

dụng đầu dò mồi
Một biến thể của đầu dò lai cổ điển sử dụng tổ hợp
mồi/đầu dò có nhãn huỳnh quang. Trong trường hợp này,
đầu dò lai có nhãn 50 được thiết kế để gắn vào chuỗi
PCR gần với một trong các mồi PCR, có huỳnh quang ở
đầu 30 . Phương pháp này yêu cầu mồi có nhãn huỳnh
quang phải được đặt gần đầu dò, thường trong phạm vi
năm cặp bazơ, để cho phép truyền năng lượng cộng hưởng
đầy đủ với đầu dò bổ sung (Von Ahsen và cộng sự, 2000).
Trong loại này, nhiều loại hệ thống thăm dò mồi khác
nhau đã được phát triển, chẳng hạn như đầu dò
Scorpions, Amplifluor hoặc hệ thống Sunrise, LUX,
Cyclicons, ResonSense và Angler (Lee và cộng sự, 2002),
tất cả đều sử dụng hai oligonucleotide : mồi và phân
tử huỳnh quang, kết hợp chức năng mồi và thăm dò. Hai
sự phát triển lâu đời nhất trong nhóm này là hệ thống
Scorpion (Whitcombe và cộng sự, 1999) và đầu dò
Amplifluor (Nazarenko và cộng sự, 1997). Trong các kết
hợp mồi/thăm dò này, trình tự mồi được liên kết với
trình tự thăm dò cụ thể được giữ ở dạng vòng kẹp tóc.
để ngăn Taq DNA polymerase khuếch đại trình tự vòng
gốc. Cấu hình này đưa chất huỳnh quang đến gần chất
khử chất khử và tránh phát huỳnh quang. Ngay sau khi
xảy ra quá trình ủ giữa mồi/đầu dò và mục tiêu, kẹp
tóc sẽ được mở ra, chất huỳnh quang và chất khử chất
khử được tách ra, dẫn đến sự gia tăng phát xạ huỳnh
quang (Hình 4.9). Trong trường hợp đầu dò LUX, cũng có
cấu trúc kẹp tóc, đầu 30 đóng vai trò như một lớp sơn
lót, chứa một loại thuốc nhuộm huỳnh quang báo cáo duy
nhất (Nazarenko và cộng sự, 2002) nhưng không cần có
sự hiện diện của chất khử chất khử bên trong. Bọ cạp
khác với đèn hiệu phân tử và thiết bị thăm dò thủy
phân ở chỗ cấu trúc của chúng thúc đẩy cơ chế thăm dò
không phân tử. Điều này dẫn đến tín hiệu huỳnh quang
mạnh hơn, đặc biệt trong điều kiện chu kỳ nhanh (Thelwell và cộng sự,
4.2.5 Phản ứng chuỗi polymerase thời gian
thực sử dụng axit nucleic biến tính Trong tất cả
các thiết kế xét nghiệm khác nhau được mô tả trước đó,
các mồi hoặc mẫu dò được đánh dấu được tổng hợp dựa trên
Machine Translated by Google

48 Chẩn đoán phân tử

HÌNH 4.9 Bọ cạp. Bọ cạp là mồi/đầu dò huỳnh quang được dán nhãn kép, sợi đơn có cấu trúc hình kẹp tóc. Mồi/đầu dò chứa fluorophore 50 đầu
và thuốc nhuộm khử chất khử bên trong liên kết trực tiếp với đầu 50 của mồi phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua chất chặn PCR. Ở dạng
không liên kết, không xảy ra hiện tượng phát huỳnh quang. Khi liên kết với trình tự mục tiêu, hình dạng kẹp tóc mở ra và vùng vòng của đầu
dò lai nội phân tử với trình tự mục tiêu mới được tổng hợp. Điều này dẫn đến sự phát xạ huỳnh quang vì chất fluorophore và chất khử chất khử
được tách ra.

axit nucleic cổ điển. Đối với các ứng dụng cụ thể, chất
tương tự tổng hợp cũng được sử dụng. Đây là trường hợp
của các đầu dò axit nucleic bị khóa (LNA). LNA là một
phân tử RNA được biến đổi về mặt hóa học trong đó phần
ribose có thêm một cầu nối nối oxy 20 và carbon 40 (Hình
4.10A). Việc sửa đổi như vậy làm tăng đáng kể ái lực lai
của mẫu dò với DNA hoặc RNA. Do khả năng này, các đầu dò
rất ngắn có thể được thiết kế, mang lại hiệu quả liên kết
rất cao với DNA bổ sung của chúng, khiến chúng đặc biệt
thích hợp để phát hiện SNP hoặc định lượng miRNA (Bonetta,
2005).
Một ví dụ về đầu dò LNA là các đầu dò phân tử cực nhỏ
đèn hiệu, là các đầu dò ngắn hơn so với đèn hiệu phân tử
cổ điển được mô tả trước đó (Catrina và cộng sự, 2012).
Những phát triển gần đây hơn sử dụng axit nucleic biến
đổi về mặt hóa học bao gồm axit nucleic peptide (PNA).
PNA là các polyme được tổng hợp nhân tạo bao gồm một
khung gồm các đơn vị N-(2-aminoethyl)- glycine lặp lại
được liên kết bằng liên kết peptide (Nielsen và cộng sự,
1991) (Hình 4.10B). Đầu dò là một phân tử không tích điện
do không có nhóm phốt phát. Do đó, nó kết nối nhanh hơn
và liên kết với ái lực cao hơn nhiều với DNA hoặc RNA,
tạo thành các chuỗi song công mạnh hơn so với các chuỗi
song công DNA/DNA. Đối với các đầu dò LNA, điều này làm cho

HÌNH 4.10 Cấu trúc của axit nucleic bị khóa (LNA) và axit nucleic peptide (PNA). Cấu trúc hóa học của đầu dò LNA (A) và PNA (B).
Machine Translated by Google
có thể thiết kế đầu dò ngắn hơn với độ đặc hiệu rất cao.
Một ví dụ về đầu dò PNA là đầu dò phát sáng, đầu dò PNA được gắn
thuốc nhuộm xyanua không đối xứng.
Khi lai đầu dò, thuốc nhuộm liên kết với DNA mục tiêu, dẫn đến sự
tăng cường đáng kể khả năng phát huỳnh quang của thuốc nhuộm
(Svanvik et al., 2000).
Một ví dụ khác về oligonucleotide biến đổi có đặc tính lai
được cải thiện là Axit Nucleic Zip (ZNA), được thiết kế bằng cách
liên hợp các dẫn xuất mỏ tinh trùng dưới dạng đơn vị cation với
oligonucleotide.
Điều này dẫn đến giảm lực đẩy tĩnh điện do tính chất đa anion của
axit nucleic, do đó làm tăng ái lực của đầu dò với mục tiêu DNA
của nó. Giống như các đầu dò LNA và PNA, chúng rất phù hợp cho
các ứng dụng như phát hiện SNP và miRNA cũng như phát hiện các
mục tiêu có số lượng rất thấp (Moreau và cộng sự, 2009; Paris và
cộng sự, 2010).
Một cách tiếp cận hoàn toàn khác được sử dụng trong công
nghệ Plexor, sử dụng hai bazơ đã được biến đổi là iso guanine và
50 -methylisocytosine. Các bazơ này được biết là tạo thành sự
tương tác cặp bazơ duy nhất khi được tích hợp vào DSDNA, vì chúng
chỉ có thể ghép đôi với nhau. Một mồi PCR được tổng hợp với dư
lượng iso-dC và nhãn huỳnh quang ở đầu 50 . Việc đưa các nucleotide
iso-dG biến đổi dabcyl vào hỗn hợp phản ứng sẽ làm tắt tín hiệu
huỳnh quang khi kết hợp nucleotide này ở vị trí bổ sung với dư
lượng iso-dC ( Gasparic et al., 2008).
4.3 MÁY CHUYỂN NHIỆT THỜI GIAN THỰC
Kể từ khi phát triển qPCR vào giữa những năm 1990, các hệ thống
thiết bị đã trải qua một quá trình phát triển sâu rộng.
Thiết bị đầu tiên có sẵn, 7700 SDS của Hệ thống sinh học ứng dụng,
chiếm gần như toàn bộ diện tích bàn, sử dụng tia laser đắt tiền
làm nguồn sáng và phải đặt trong phòng thí nghiệm có máy lạnh.
Công cụ này không thể tạo ra phân tích thực sự trong thời gian
thực vì dữ liệu chỉ có thể được xem sau khi kết thúc phản ứng
PCR. Khi công nghệ được cải tiến, các hệ thống trở nên sẵn có cho
phép phát hiện sản phẩm PCR ngay từ thời điểm nó được hình thành,
theo thời gian thực thực tế.
Những máy mới hơn này có kích thước nhỏ hơn nhiều và tia laser đã
được thay đổi để sử dụng đèn vonfram-halogen hoặc đèn đi-ốt phát
sáng ít quý giá hơn. Ngay cả các thiết bị có kích thước ba lô di
động cũng đã được phát triển, có thể được sử dụng để phân tích
tại chỗ. Những thiết bị này có thể cho kết quả trong thời gian
phân tích chưa đến 30 phút, một tính năng khá quan trọng, chẳng
hạn như để phát hiện tại chỗ các đợt bùng phát mầm bệnh. Do có
nhiều loại thiết bị được phát triển bởi các công ty khác nhau
nên giá đã giảm đáng kể và các thiết bị này đang trở thành công
cụ tiêu chuẩn cho các phòng thí nghiệm chẩn đoán và phân tử thông
thường.
Chương PCR định lượng | 4 49
Mặc dù tất cả các ứng dụng có thể được thực hiện trên tất cả
các công cụ, nhưng mỗi công cụ đều có những ưu điểm và nhược
điểm riêng. Do đó, việc lựa chọn một máy luân nhiệt thời gian
thực cụ thể phụ thuộc vào ứng dụng cụ thể mà ứng dụng đó đang tập
trung vào. Ví dụ, để định lượng biểu hiện gen, thời gian chạy
không phải là yếu tố quan trọng nhất, mặc dù người ta muốn chọn
một công cụ có thể phân tích đồng thời một số lượng lớn mẫu.
Thật vậy, đối với năng suất mẫu cao, hệ thống 96 giếng hoặc thậm
chí 384 giếng sẽ là lựa chọn thích hợp hơn. Mặt khác, nếu ứng
dụng chính là xác định mầm bệnh chẳng hạn, thì tốc độ là vấn đề
chính và lựa chọn tốt nhất sẽ là máy luân nhiệt nhanh. Hầu hết
các máy xử lý nhiệt đều có thể thực hiện PCR ghép kênh, rất nhạy
và chính xác, đồng thời ngày càng có phần mềm thân thiện với người
dùng.
Sự phát triển nhanh chóng trong việc phát triển các thiết bị này
cho thấy khả năng cạnh tranh và việc sử dụng rộng rãi công nghệ
PCR.
4.4 CÁCH THU THẬP DỮ LIỆU
Khi thực hiện qPCR, khả năng giám sát quá trình khuếch đại của
phản ứng PCR trong thời gian thực sẽ cách mạng hóa cách thu thập
dữ liệu. Thông thường, các phản ứng được đặc trưng bởi thời điểm
trong giai đoạn hàm mũ của chu trình PCR khi khuếch đại sản phẩm
PCR đạt đến mức phát hiện nhất định, trái ngược với phát hiện
điểm cuối, trong đó lượng sản phẩm hình thành được đo sau một số
cố định. của các chu kỳ, thường gặp nhất là ở pha ổn định của phản
ứng. Hơn nữa, việc định lượng dựa trên đặc tính vốn có của phản
ứng PCR, đó là càng bắt đầu với nhiều bản sao DNA đầu vào thì
càng cần ít chu kỳ khuếch đại PCR để tạo ra một số lượng sản phẩm
khuếch đại cụ thể. Cuối cùng, thực tế là sự hình thành các sản
phẩm khuếch đại tương quan tuyến tính với lượng phát huỳnh quang
được khai thác trong xét nghiệm qPCR (Giulietti và cộng sự, 2001).
Trong thực tế, bằng cách sử dụng bất kỳ hóa chất phát hiện đã
phát triển nào trên bất kỳ thiết bị sẵn có nào, mức tăng phát xạ
huỳnh quang có thể được đọc bằng máy dò trình tự trong thời gian
thực trong suốt quá trình phản ứng và là hệ quả trực tiếp của
khuếch đại mục tiêu trong quá trình PCR. . Trong Hình 4.11, một
biểu đồ khuếch đại điển hình được minh họa trong đó các thuật ngữ
và định nghĩa được sử dụng thường xuyên trong qPCR được minh họa.
Trong các chu kỳ đầu tiên của phản ứng PCR, tín hiệu huỳnh quang
có rất ít hoặc không có sự thay đổi. Giai đoạn này là đường cơ sở
của âm mưu khuếch đại. Sự phát huỳnh quang của sản phẩm tại mỗi
thời điểm được đo trong chu trình PCR và được xác định là Rnþ
(Hình 4.11A). Tương tự, Rn là sự phát xạ huỳnh quang của đường
cơ sở. Sự tăng huỳnh quang được tính toán bằng chương trình phần
mềm máy tính và được vẽ trên trục y dưới dạng giá trị DRn, sử
dụng phương trình DRn ¼ Rnþ Rn (Hình 4.11B).
Do đó giá trị này tương quan trực tiếp với sự xuống cấp của đầu dò
Machine Translated by Google

50 Chẩn đoán phân tử

HÌNH 4.11 Sơ đồ khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) của chuỗi pha loãng. Năm điểm pha loãng 10 lần nối tiếp DNA đầu vào được khuếch đại
bằng phản ứng chuỗi polymerase định lượng. (A) Sự phát huỳnh quang của sản phẩm tại mỗi thời điểm được đo trong quá trình đạp xe PCR và được xác
định là Rnþ. (B) Mức tăng huỳnh quang được vẽ trên trục y dưới dạng giá trị DRn, sử dụng phương trình DRn ¼ Rnþ Rn. Một ngưỡng được xác định (đường
màu xanh). Ngưỡng Ct ¼ chu kỳ.

(trong trường hợp đầu dò thủy phân hoặc TaqMan) hoặc với sự
kết hợp của thuốc nhuộm (trong trường hợp thuốc nhuộm huỳnh
quang không đối xứng) trong quá trình PCR và do đó hình thành
một sản phẩm PCR cụ thể. Một ngưỡng tùy ý được chọn, dựa
trên độ biến thiên của đường cơ sở, thường được xác định
bằng 10 lần độ lệch chuẩn của đường cơ sở. Tất nhiên, điều
này có thể được thay đổi theo cách thủ công cho từng thử
nghiệm riêng lẻ nếu cần thiết. Sau đó, các giá trị chu kỳ
ngưỡng (Ct) được tính bằng cách xác định điểm tại đó huỳnh
quang vượt quá ngưỡng đã chọn này. Ct là
được báo cáo là số chu kỳ tại thời điểm này. Do đó giá trị
Ct giảm tuyến tính khi tăng số lượng mục tiêu đầu vào. Điều
này được sử dụng như một phép đo định lượng của mục tiêu đầu
vào.
4.5 CÁCH DỮ LIỆU ĐƯỢC ĐỊNH LƯỢNG
Hai phương pháp khác nhau thường được sử dụng để định lượng
kết quả thu được bằng qPCR: phương pháp đường cong tiêu chuẩn
và phương pháp ngưỡng so sánh. Một phương pháp tao nhã thứ ba
Machine Translated by Google
là phương pháp Pfaffl, mặc dù việc sử dụng nó ít phổ biến hơn
(Giulietti và cộng sự, 2001).
4.5.1 Phương pháp đường cong chuẩn
Trong phương pháp đường chuẩn, một mẫu có nồng độ đã biết được sử
dụng để lập chuỗi pha loãng, chuỗi này được sử dụng làm đường
chuẩn. Các mẫu, có thể được sử dụng để tạo ra chuỗi pha loãng, là
dsDNA plasmit đã tinh chế, ARN được phiên mã in vitro, ssDNA tổng
hợp in vitro, hoặc mẫu cDNA bất kỳ biểu hiện gen đích. Nồng độ
của các mẫu DNA hoặc RNA này có thể được đo bằng phương pháp đo
quang phổ ở bước sóng 260 nm và chuyển đổi thành số lượng bản sao
bằng cách sử dụng trọng lượng phân tử của DNA hoặc RNA. Để định
lượng tuyệt đối biểu hiện mRNA, phải sử dụng các tiêu chuẩn tuyệt
đối (ví dụ, RNA phiên mã in vitro). Các tiêu chuẩn tuyệt đối như
vậy mang lại độ chính xác rất cao và thường được sử dụng trong
các phòng thí nghiệm được Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế công
nhận (Saitta et al., 2016). Thông thường, về vấn đề này, một tài
liệu tham khảo tiêu chuẩn được sử dụng để chuẩn hóa các xét nghiệm
giữa các phòng thí nghiệm khác nhau (Hartnell và cộng sự, 2012).
Thông thường hơn, đó là trong các phòng thí nghiệm không được
công nhận, điển hình là các phòng thí nghiệm nghiên cứu, các tiêu
chuẩn plasmid cDNA
HÌNH 4.12 Đường chuẩn. Bảy điểm của chuỗi cDNA pha loãng 10 lần, được thực hiện trong các giếng ba lần, được khuếch đại bằng hệ thống TaqMan. Một đường cong
tiêu chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ các giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) dựa trên số lượng bản sao cDNA đầu vào tương đối.
Chương PCR định lượng | 4 51
được sử dụng để định lượng. Chúng được tạo ra bằng cách nhân bản
một đoạn cDNA thành một vectơ plasmid thích hợp.
Tuy nhiên, đối với việc định lượng biểu hiện mRNA, điều này sẽ
chỉ mang lại kết quả định lượng tương đối, vì những biến đổi về
hiệu quả của bước phiên mã ngược không được kiểm soát.
Khi tạo đường chuẩn bằng các mẫu chuẩn pha loãng 2 lần nối
tiếp, hai điểm liên tiếp sẽ có chênh lệch Ct là 1. Tương tự, giá
trị Ct của mẫu pha loãng 10 lần sẽ chênh lệch 3,3. Tất nhiên,
điều này giả định rằng hiệu suất PCR đạt được 100%. Do đó, độ dốc
của đường chuẩn là thước đo hiệu quả của phản ứng PCR. Đối với
các độ pha loãng 10 lần nối tiếp, lý tưởng nhất là 3,3. Trong
thực tế, các đường cong tiêu chuẩn có độ dốc từ 3,0 đến 3,6 được
coi là chấp nhận được.
Ngoài ra, độ nhạy của phản ứng PCR được phản ánh trên đường cong
chuẩn tại điểm mà tại đó đường chuẩn đi qua trục y (điểm chặn Y).
Thật vậy, giá trị Ct tại thời điểm này càng thấp thì độ nhạy của
phản ứng PCR càng cao (Hình 4.12). Bằng cách vẽ giá trị Ct của
một mẫu chưa biết trên đường cong chuẩn, có thể xác định được số
lượng chuỗi mục tiêu đầu vào trong mẫu. Thông thường, việc tính
toán này được thực hiện tự động bởi chương trình phần mềm của
thiết bị qPCR.
Machine Translated by Google
52 Chẩn đoán phân tử
4.5.2 Phương pháp chu kỳ ngưỡng so sánh
Một phương pháp thay thế được sử dụng để định lượng tương đối là
phương pháp so sánh Ct hoặc phương pháp DDCt (Livak và Schmittgen,
2001). Phương pháp này sử dụng số học cho mulas để tính toán các
mức biểu thức tương đối, so với bộ hiệu chuẩn. Ví dụ: mẫu đối
chứng chưa được xử lý có thể được sử dụng làm chất hiệu chuẩn.
Hơn nữa, giá trị của mục tiêu chưa biết sẽ được chuẩn hóa thành
gen tham chiếu nội sinh (ví dụ: gen giữ nhà, sẽ được thảo luận
sau). Lượng mục tiêu, liên quan đến bộ hiệu chuẩn và được chuẩn
hóa theo gen tham chiếu, được đo bằng phương trình 2DDCt, trong
đó DDCt ¼ DCtsample DCtcalibrator và DCt là Ct của gen mục tiêu
được trừ bởi Ct của gen tham chiếu. Do đó, phương trình biểu thị
biểu hiện chuẩn hóa của gen mục tiêu trong mẫu chưa biết, so với
biểu hiện chuẩn hóa của mẫu hiệu chuẩn. Điều quan trọng là để
phương pháp DDCt có thể được áp dụng, hiệu suất khuếch đại PCR
đối với gen mục tiêu và gen tham chiếu phải xấp xỉ bằng nhau.
Đối với mỗi xét nghiệm qPCR đang được thiết lập, xét nghiệm này
phải được kiểm tra bằng cách xác định mẫu DCt và bộ hiệu chuẩn
DCt thay đổi như thế nào khi pha loãng mẫu. Trong trường hợp
hiệu quả giữa khuếch đại PCR đối với gen mục tiêu và gen tham
chiếu là khác nhau, thì phải thiết kế một bộ kết hợp mồi/đầu dò
mới. Ngoài ra, có thể áp dụng phương pháp đường cong chuẩn hoặc
phương pháp Pfaffl được phát triển gần đây hơn.
4.5.3 Phương pháp Pfaffl
Để thay thế cho phương pháp so sánh Ct, một mô hình toán học khác
đã được MW Pfaffl (Pfaffl, 2001) phát triển. Trong phương pháp
này, hiệu quả PCR của gen mục tiêu và gen tham chiếu được tính
đến. Tỷ lệ biểu hiện tương đối (R) được tính toán dựa trên hiệu
quả của xét nghiệm qPCR (E) và chu kỳ ngưỡng của mẫu chưa biết
(Ct) so với mẫu hiệu chuẩn (ví dụ: mẫu đối chứng không được xử
lý) và được biểu thị so với gen tham chiếu . Điều này được thể
hiện bằng phương trình sau:
DCtðrefÞ
Tỷ lệ ¼ ð1 þ Mục tiêuÞ DCtðtargetÞ . ð1 þ ErefÞ
trong đó Etarget là hiệu suất PCR của gen mục tiêu; Eref là hiệu
quả PCR của gen tham chiếu; DCt(mục tiêu) ¼
Ct(mẫu) Ct(chất hiệu chuẩn) của gen mục tiêu; và DCt(ref) ¼
Ct(sample) Ct(calibrator) của gen tham chiếu.
Tương tự với phương pháp DDCt, DCt là Ct của gen mục tiêu trừ
đi Ct của gen tham chiếu.
Bởi vì phương pháp này tính đến hiệu quả nội tại của từng phản
ứng PCR nên nó có thể được áp dụng cho bất kỳ xét nghiệm khuếch
đại qPCR nào với độ chính xác được nâng cao. Một nhược điểm lớn
là trong phương pháp này người ta không thể sử dụng giá trị trung
bình của các gen tham chiếu khác nhau (xem thêm ở phần sau).
4.6 PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERA ĐA ĐỊNH
LƯỢNG
Multiplex qPCR có thể đề cập đến việc khuếch đại và phát hiện
đồng thời các gen mục tiêu khác nhau trong một ống hoặc sử dụng
nhiều đầu dò phát huỳnh quang để phân biệt các alen khác nhau. Do
đó, thuật ngữ này hơi khó hiểu, vì nó không chỉ là sự mở rộng của
phương pháp ghép kênh cổ điển được biết đến trong PCR thông
thường, mà đơn giản là sự khuếch đại của nhiều mẫu trong một phản
ứng sử dụng các đoạn mồi khác nhau.
Do các phân tích chẩn đoán thường bị hạn chế do nguồn vật
liệu sinh học sẵn có hạn chế và một trong những mục tiêu chính
là giảm thời gian phân tích, PCR ghép kênh được coi là một giải
pháp hấp dẫn, đặc biệt là trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm. Do
đó, những nỗ lực lớn đã được thực hiện nhằm tối ưu hóa bộ dụng cụ
phát hiện chẩn đoán ghép kênh dựa trên khuếch đại axit nucleic.
Một trở ngại cần phải giải quyết xuất phát từ sự hạn chế
số phóng xạ fluorophore khác nhau với độ phân giải quang phổ tốt.
Thiết bị qPCR chứa các bộ lọc được tối ưu hóa để giảm thiểu sự
chồng chéo của quang phổ phát xạ từ các chất huỳnh quang có sẵn
khác nhau. Mặc dù vậy, số lượng fluorophores có thể được kết hợp
và phân biệt rõ ràng vẫn bị hạn chế khi so sánh với độ phân giải
trong PCR ghép kênh thông thường. Những cải tiến trong thiết kế
các dạng đầu dò khác cũng như sự kết hợp mới của fluorophores đã
hỗ trợ rất nhiều cho khả năng phát hiện đồng thời số lượng mục
tiêu lớn hơn. Ngoài ra, sự phát triển trong các công cụ qPCR đã
được cải thiện đáng kể, cho phép ghép kênh lên đến sáu màu khác
nhau. Một cách tiếp cận khác, được sử dụng để phát hiện các bệnh
di truyền ở người, dựa trên sự phân biệt giữa những thay đổi đơn
hoặc nhiều nucleotide (giữa các alen khác nhau) bằng cách sử dụng
sự khác biệt về điểm nóng chảy. Theo cách tiếp cận này, một đầu
dò huỳnh quang duy nhất có thể được sử dụng để phân biệt giữa các
sản phẩm, dựa trên nhiệt độ nóng chảy riêng biệt của chúng, điều
này được phản ánh qua sự khác biệt về độ ổn định nhiệt động của
các song công mục tiêu đầu dò bổ sung hoàn hảo và không khớp.
Cuối cùng, việc sử dụng kết hợp phép đo huỳnh quang nhiều màu và
phân tích đường cong nóng chảy huỳnh quang có thể làm tăng đáng
kể số lượng mục tiêu có thể được phát hiện đồng thời (Wittwer và
cộng sự, 2001).
Dựa trên các phương pháp tiếp cận riêng biệt hoặc kết hợp
này, việc sử dụng PCR ghép kênh trong bộ dụng cụ chẩn đoán, được
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm phê duyệt, đã tăng lên đáng kể
trong những năm qua và đang trở thành một phương pháp tiêu chuẩn
trong nhiều cơ sở lâm sàng. Những tiến bộ chính so với văn hóa cổ
điển và công nghệ vi mô là độ nhạy và độ đặc hiệu được nâng cao
và giảm thời gian phân tích.
Tuy nhiên, người ta cần lưu ý rằng công nghệ này chỉ giới hạn ở
kiến thức hiện có về bộ gen của vi sinh vật, không thể phân biệt
được giữa sự sống và
Machine Translated by Google
sinh vật chết và những đột biến bất ngờ thường xảy ra ở vi sinh
vật có thể không được phát hiện.
Do đó, sự kết hợp giữa các kỹ thuật chẩn đoán cổ điển kết hợp với
PCR ghép kênh có thể sẽ vẫn là tiêu chuẩn trong hầu hết các cơ sở
chẩn đoán lâm sàng (Gray và Coupland, 2014).
4.7 ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG CHUỖI ĐỊNH LƯỢNG
POLYMERASE VÀ PHẢN ỨNG CHUỖI ĐỊNH LƯỢNG
POLYMERASE NGƯỢC
Phương pháp qPCR được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm
nghiên cứu cơ bản cũng như trong các cơ sở chẩn đoán lâm sàng với
nhiều ứng dụng dựa trên sự khuếch đại DNA (qPCR) hoặc RNA (RT-
qPCR). Loại thứ hai đề cập đến sự khuếch đại enzyme phiên mã ngược
(RT) và PCR kết hợp, được sử dụng để khuếch đại RNA mã hóa hoặc
RNA không mã hóa.
4.7.1 Vi sinh lâm sàng
Ngày càng có nhiều mối quan tâm đến việc sử dụng PCR thời gian
thực để phát hiện mầm bệnh nhằm chẩn đoán nhiễm trùng do virus,
vi khuẩn hoặc nấm (De Crom và cộng sự, 2016; Stappers và cộng sự,
2016). Hầu hết các xét nghiệm được phát triển đều cho phép tăng
tần suất cũng như tốc độ phát hiện mầm bệnh so với các kỹ thuật
nuôi cấy thông thường.
Hơn nữa, việc định lượng tải lượng mầm bệnh là có thể.
Để phát triển xét nghiệm theo thời gian thực, người ta phải tính
đến việc hầu hết các tác nhân lây nhiễm đều có đặc điểm là tỷ lệ
đột biến cao, điều này có thể ảnh hưởng đáng kể đến việc ước tính
tải lượng mầm bệnh. Điều này có thể khắc phục bằng cách thiết kế
mồi ở những vùng được bảo tồn cao. Tất nhiên, theo cách khác, các
biến thể về trình tự có thể cung cấp cơ sở cho việc phát triển các
thử nghiệm dành riêng cho từng loại phụ. Điều quan trọng là phải
cải thiện hơn nữa các xét nghiệm dựa trên PCR thời gian thực về
độ nhạy, hiệu quả trích xuất DNA và đặc biệt là khả năng phát hiện
phạm vi mầm bệnh rộng hơn nhiều bằng công nghệ này (Warhurst et
al., 2015) . Ngoài ra, sự phát triển nhanh chóng về khả năng kháng
thuốc ở vi khuẩn gram âm đòi hỏi các phương pháp mới cho phép
phát hiện nhanh chóng (Endimiani và Jacobs, 2016).
4.7.2 Vi sinh vật công nghiệp và thực phẩm
Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác các mầm bệnh vi khuẩn hoặc
virus trong các mẫu thực phẩm là rất quan trọng để đảm bảo chất
lượng thực phẩm và theo dõi sự bùng phát trong nguồn cung cấp
thực phẩm. Các xét nghiệm PCR thời gian thực đang được tối ưu hóa
thường xuyên hơn để phát hiện các mầm bệnh này, vì chúng
Chương PCR định lượng | 4 53
rút ngắn đáng kể thời gian phân tích so với các phương pháp nhận
dạng huyết thanh và sinh hóa thông thường và vì kỹ thuật này có
thể được áp dụng trực tiếp trên môi trường tiền tăng sinh hoặc các
sản phẩm thực phẩm. Một vấn đề cụ thể khi phân tích mầm bệnh thực
phẩm là thực phẩm thường có nền mẫu phức tạp, đòi hỏi các bước làm
giàu có chọn lọc để khắc phục vấn đề số lượng mầm bệnh thấp. Để
giải quyết vấn đề này, một loại môi trường tăng sinh phổ biến đã
được phát triển, cho phép làm giàu nhiều mầm bệnh (Bailey và Cox,
1992). Một vấn đề nữa phải đối mặt trong trường hợp các phương
pháp phát hiện dựa trên PCR
mầm bệnh thực phẩm là để phân biệt giữa tế bào gây bệnh sống và
chết. Một cách tiếp cận là sử dụng thuốc nhuộm sống/chết liên kết
cộng hóa trị với DNA và ức chế quá trình khuếch đại PCR từ tế bào
chết (Rudi et al., 2002). Ngoài ra, có thể áp dụng sự phát triển
của các xét nghiệm PCR thời gian thực dựa trên mRNA (ngược lại với
các xét nghiệm dựa trên DNA), phương pháp này có ưu điểm là chỉ
báo chính xác về khả năng tồn tại của mầm bệnh (Rijpens và Herman,
2002) . Pro tocol đã được xác nhận để phát hiện Escherichia coli,
Salmonella (Bhagwat, 2003), Listeria (Norton, 2002) và các chủng
viêm gan A (Kim và cộng sự, 2016) trong các mẫu thực phẩm và môi
trường, chỉ kể tên một vài ví dụ .
Một lĩnh vực khác mà PCR thời gian thực được sử dụng là vi sinh
công nghiệp. Một ví dụ là việc sử dụng nó trong việc định lượng
các loại nấm men còn sống trong quá trình lên men rượu vang và
kiểm soát nguy cơ hư hỏng rượu vang (Hierro et al., 2006).
4.7.3 Ung thư lâm sàng
4.7.3.1 Bệnh tồn dư tối thiểu
Việc phát hiện bệnh còn lại tối thiểu (MRD) (tức là phát hiện số
lượng tế bào ác tính rất thấp) có mối tương quan đáng kể với kết
quả lâm sàng ở nhiều khối u ác tính về mặt bệnh học. Do đó, việc
theo dõi MRD rất quan trọng để hướng dẫn điều trị trong môi trường
lâm sàng. Các kỹ thuật dựa trên PCR thời gian thực để phát hiện
MRD đã được phát triển và được chứng minh là nhạy hơn các kỹ thuật
hình thái cổ điển, cho phép phát hiện các tế bào khối u ở lượng
dưới kính hiển vi (Kayser et al., 2015). Tuy nhiên, những thách
thức lớn cản trở việc sử dụng rộng rãi phương pháp này là tính
phức tạp và chi phí cao của các xét nghiệm (Rocha và cộng sự, 2016).
4.7.3.2 Đa hình đơn nucleotide
SNP, hiện diện trong bộ gen của con người, được sử dụng làm dấu
hiệu di truyền để theo dõi kiểu di truyền của các vùng nhiễm sắc
thể từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hơn nữa, chúng còn là một công
cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu các yếu tố di truyền liên quan
đến bệnh tật ở người (Johnson và Todd, 2000; Risch, 2000). Các xét
nghiệm PCR thời gian thực đã được phát triển để phát hiện SNP. Đối
với ứng dụng này, mức độ
Machine Translated by Google
54 Chẩn đoán phân tử
sự phân biệt giữa các alen mục tiêu và không phải mục tiêu là
thách thức quan trọng nhất khi tối ưu hóa kỹ thuật.
Trong phương pháp PCR thời gian thực này, một bộ mồi và hai
đầu dò có nhãn huỳnh quang đặc trưng cho alen được sử dụng, sử
dụng các loại thuốc nhuộm báo cáo khác nhau. Do đó, hai alen
này có thể được phân biệt bằng sự phát xạ huỳnh quang khác
nhau của hai loại thuốc nhuộm báo cáo khác nhau (Livak, 1999).
Ngoài ra, việc phát hiện SNP thường sử dụng đèn hiệu phân tử
(Tyagi và cộng sự, 1998) hoặc đầu dò bọ cạp (Whitcombe và cộng
sự, 1999). Đối với mỗi xét nghiệm SNP riêng lẻ, mức độ phân
biệt phải được kiểm tra bằng thực nghiệm vì nó phụ thuộc vào
sự không phù hợp.
4.7.3.3 Chuyển đoạn nhiễm sắc thể
Sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể, thường diễn ra trong các tế bào
khối u, có thể được sử dụng làm nhựa PCR đặc hiệu cho khối u.
Các đoạn mồi được thiết kế sao cho chúng bám vào các phía đối
diện của điểm dừng trong gen tổng hợp. Những gen tổng hợp này
là mục tiêu thú vị để thiết kế phương pháp PCR. Thật vậy,
chúng liên quan trực tiếp đến quá trình gây ung thư và do đó
ổn định trong suốt quá trình bệnh. Hơn nữa, các vị trí hợp
nhất điểm dừng ở cấp độ DNA khác nhau ở mỗi bệnh nhân nên có
thể áp dụng các chiến lược PCR thời gian thực dành riêng cho
từng bệnh nhân (Summers et al., 2001).
Ngoài ra, PCR thời gian thực có thể được thực hiện trên bản
phiên mã của các gen tổng hợp đặc hiệu cho khối u. Đây là
những bản phiên mã đặc trưng của bệnh nằm trên các điểm dừng
của nhiễm sắc thể, dẫn đến sản phẩm RNA trong khung (Rowley,
1998). Điều thú vị là, những bản phiên mã hợp nhất này có thể
giống hệt nhau ở từng bệnh nhân mặc dù có những điểm dừng khác
nhau, bởi vì những điểm dừng này thường nằm ở các intron. Ưu
điểm của phương pháp này là có thể sử dụng cùng một bộ mồi/đầu
dò để phân tích từng bệnh nhân có cùng bản ghi kết hợp nhưng
chuyển vị điểm dừng khác nhau (Van Der Velden và cộng sự, 2003).
4.7.4 Liệu pháp gen
Mục tiêu chính của liệu pháp gen là chuyển gen điều trị cụ thể
đến cơ quan đích theo cách phụ thuộc vào thời gian và liều
lượng, và quan trọng nhất là tránh chuyển gen đến các cơ quan
không phải mục tiêu, vì điều này có thể dẫn đến tác dụng phụ
độc hại. Trong trường hợp này, gen điều trị được chuyển đến
các tế bào đích thông qua hệ thống vectơ, thường là vectơ
virus (Crystal, 1995). Hai thông số quan trọng phải được phân
tích khi xem xét liệu pháp gen như một hệ thống phân loại
thuốc:
1. ước tính chuyển gen, là mức độ biểu hiện của gen điều trị
liên quan đến mức độ mô đích theo thời gian; và 2. phân
phối sinh học,
là sự phân phối thuốc đến các cơ quan khác nhau theo các đường
dùng khác nhau.
Các xét nghiệm PCR thời gian thực đã được xác nhận liên
quan đến chuyển gen cũng như phân phối sinh học các vectơ liệu
pháp gen. Thách thức lớn trong việc tối ưu hóa các xét nghiệm
này là độ chính xác của việc định lượng và độ nhạy của xét
nghiệm. Ví dụ, các xét nghiệm PCR thời gian thực sử dụng các
đầu dò lai đã được xác nhận đối với các vec tơ chuyển gen
adenovirus và được chứng minh là có khả năng định lượng, tái
sản xuất và nhạy cảm (Senoo và cộng sự, 2000; Hackett và cộng sự, 2000).
4.7.5 Xác thực các công nghệ liên quan đến “-Omics”
Việc sử dụng rộng
rãi một số kỹ thuật “-omics”, chẳng hạn như mảng vi mô, giải
trình tự thế hệ tiếp theo và công nghệ biểu sinh, dẫn đến một
lượng dữ liệu khổng lồ. Việc xác nhận những kết quả này bằng
một kỹ thuật độc lập sẽ làm tăng đáng kể tính hợp lệ của dữ
liệu đó. qPCR đóng một vai trò quan trọng trong việc xác nhận
như vậy vì độ nhạy phát hiện, độ đặc hiệu của trình tự, dải
động lớn cũng như định lượng có độ chính xác và khả năng tái
tạo cao. Nhược điểm của qPCR (hoặc RT-qPCR trong vấn đề này)
là nó tốn nhiều công sức, tốn thời gian và đắt tiền. Hơn nữa,
một số yếu tố cần được tính đến góp phần vào mối tương quan
giữa kết quả microarray và qPCR.
Do đó thường chỉ một phần nhỏ kết quả được xác nhận (Provenzano
và Mocellin, 2007; Morey và cộng sự, 2006).
4.7.6 Di truyền pháp y
Nhận dạng DNA đã trở thành tiêu chuẩn sử dụng trong các phòng
thí nghiệm pháp y. Các phòng thí nghiệm pháp y đang phải đối
mặt với số lượng yêu cầu phân loại DNA ngày càng tăng, cùng
với đó là lượng DNA giảm dần cho mỗi vụ án hình sự, điều này
đang thúc giục họ phát triển các xét nghiệm qPCR có thể đồng
thời xác định hoặc định lượng một số thông số. Điều quan trọng
để có kết quả qPCR đáng tin cậy, bên cạnh lượng DNA tổng số
hoặc DNA nam giới, là chất lượng của DNA cũng như sự hiện diện
của các yếu tố ức chế trong mẫu. Do đó, những nỗ lực của các
phòng thí nghiệm khác nhau đã dẫn đến sự phát triển xét
nghiệm, trong đó người ta có thể đồng thời phát hiện DNA tổng
số của con người, DNA của nam giới ở người, sự thoái hóa DNA
và sự ức chế PCR (Hudlow và cộng sự, 2008; Ewing và cộng sự, 2016) .
4.8 TIÊU CHÍ ĐỂ TỐI ƯU HÓA XÉT NGHIỆM
CHUỖI POLYMERASE ĐỊNH LƯỢNG
Việc lựa chọn phương pháp thực hiện phản ứng qPCR phụ thuộc
vào ứng dụng cụ thể được hình dung. Ví dụ, một sự khác biệt
quan trọng phải được thực hiện tùy thuộc vào việc người ta
đang xử lý việc đo mức biểu hiện mRNA (RT-qPCR) hay với số
lượng bản sao DNA (qPCR).
Các yếu tố khác như số lượng gen, số lượng
Machine Translated by Google
các mục tiêu, tầm quan trọng của sàng lọc nhanh, phân biệt
đối xử allelic, định lượng chính xác, độ nhạy và chi phí,
cần được xem xét cẩn thận.
Có lẽ một trong những ứng dụng được sử dụng rộng rãi nhất
của qPCR là định lượng biểu hiện mRNA. Việc sử dụng RT-qPCR
đã được xác nhận cho nhiều ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản
và chẩn đoán lâm sàng. Điều này rõ ràng từ sự gia tăng theo
cấp số nhân của các ấn phẩm khi thực hiện tìm kiếm PubMed
bằng cách sử dụng các từ “reverse tran scription” và “real-
time PCR” (Hình 4.3). Mặc dù qPCR được phát triển gần như
cùng lúc với qPCR, nhưng rõ ràng là việc tối ưu hóa các xét
nghiệm RT-qPCR đáng tin cậy phức tạp hơn nhiều so với các
xét nghiệm qPCR.
Thật vậy, kết quả đáng tin cậy phụ thuộc vào chất lượng RNA
tốt (Kirchner và cộng sự, 2014), điều kiện phiên mã ngược
nhất quán (Bustin và cộng sự, 2015), sự vắng mặt của coapli
fying làm nhiễm bẩn DNA bộ gen (Derveaux và cộng sự, 2010),
và khả năng chuẩn hóa thích hợp (Vandesompele và cộng sự,
2002). Phần sau đề cập đến việc điều chỉnh các biến thể thử
nghiệm về hiệu suất khuếch đại PCR và phiên mã ngược riêng
lẻ. Điều này có tầm quan trọng lớn trong xét nghiệm RT
qPCR, vì sự khác biệt về hiệu quả của phản ứng sao chép
ngược sẽ dẫn đến lượng cDNA không tương ứng với lượng RNA
ban đầu.
Hơn nữa, do tính chất hàm mũ của phản ứng PCR, những khác
biệt nhỏ về hiệu suất khuếch đại PCR sẽ dẫn đến những khác
biệt lớn trong sản phẩm PCR.
Hiện nay, phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất để sửa
những biến thể này là chuẩn hóa gen tham chiếu. Về lý thuyết,
một gen tham chiếu lý tưởng phải được biểu hiện ở mức độ
không đổi giữa các mô khác nhau của sinh vật, ở tất cả các
giai đoạn phát triển và không bị ảnh hưởng bởi chính phương
pháp điều trị thử nghiệm. Tuy nhiên, trên thực tế, việc tìm
ra một gen có những đặc điểm này gần như là một nhiệm vụ bất
khả thi. Thật vậy, sự biểu hiện của gen giữ nhà cũng có thể
được điều chỉnh bằng cách xử lý thực nghiệm hoặc có thể phụ
thuộc vào mô. Do đó, điều quan trọng là trước khi thực hiện
từng bộ thí nghiệm cụ thể, cần phải xác nhận một gen tham
chiếu phù hợp. Với mục đích này, người ta có thể kiểm tra
một loạt các gen tham chiếu được sử dụng rộng rãi, chẳng hạn
như b-actin, glyceraldehyd-3-phosphate-dehydrogenase, rRNA,
hypoxanthine guaninephosphoribosyl transferase, protein
ribosome, cyclophilin, ty thể ATP syn thase 6, hoặc
porphobilinogen deaminase . Ngoài ra, các bảng gen tham
chiếu khác nhau có sẵn trên thị trường để thử nghiệm. Điều
quan trọng là người ta phải nhớ rằng các gen tham chiếu có
đặc tính chức năng tương tự có thể có biểu hiện đồng điều
hòa. Do đó, có thể nên chọn các gen tham chiếu từ các lớp
chức năng riêng biệt. Năm 2002, Jo Vandesompele và cộng sự
đã công bố một phương pháp cung cấp hướng dẫn và giải pháp
về cách chọn lọc các gen tham chiếu thích hợp nhất và xác
định số lượng gen tham chiếu tối thiểu.
Chương PCR định lượng | 4 55
cần thiết trong một môi trường thử nghiệm cụ thể. Họ cũng
cung cấp một phương pháp tính toán hệ số chuẩn hóa dựa trên
giá trị trung bình hình học của các gen tham chiếu được chọn
(Vandesompele và cộng sự, 2002).
Bên cạnh RT-qPCR để định lượng mức độ biểu hiện mRNA,
lĩnh vực RT-qPCR đã nhận được thêm mối quan tâm mới với việc
phát hiện ra các RNA không mã hóa, chẳng hạn như microRNA
(Lee và cộng sự, 1993, 2003).
MicroRNA là các RNA nhỏ, không mã hóa gồm các cặp bazơ 20e22,
đóng vai trò trong mạng lưới điều hòa gen bằng cách liên kết
và kìm hãm hoạt động của các mRNA mục tiêu cụ thể. Ngoài ra,
microRNA có thể hiện diện trong dịch tuần hoàn của cơ thể,
nơi chúng có thể đóng vai trò là dấu hiệu sinh học hữu ích
để dự đoán bệnh hoặc theo dõi bệnh (He và Hannon, 2004). Do
kích thước nhỏ, tính tương đồng cao giữa các thành viên
trong họ miRNA khác nhau, không có đặc điểm trình tự chung
như đuôi poly(A) và lượng dịch cơ thể ít, việc định lượng RT
qPCR cho miRNA đòi hỏi sự thích ứng cụ thể liên quan đến
chuẩn bị mẫu, chiết xuất và ổn định microRNA, thiết kế thử
nghiệm và phân tích dữ liệu (Mestdagh và cộng sự, 2014;
Benes và Castoldi, 2010).
Mặc dù về mặt lý thuyết, kỹ thuật qPCR có lẽ là kỹ thuật
đơn giản nhất trong sinh học phân tử, nhưng nhìn chung,
điều này trái ngược phần lớn với cách các thí nghiệm qPCR
nói chung và các thí nghiệm RT-qPCR nói riêng đang được thực
hiện. Trong nỗ lực chính nhằm chuẩn hóa và cải thiện độ tin
cậy của các kết quả được báo cáo trong các ấn phẩm khoa học
dựa trên kỹ thuật phổ biến này, một nhóm chuyên gia quốc tế
trong lĩnh vực qPCR đã xây dựng và công bố hướng dẫn MIQE,
đề cập đến “Thông tin tối thiểu cần thiết cho ấn phẩm”. của
các thí nghiệm qPCR” (Bustin và cộng sự, 2009). Những hướng
dẫn này mô tả thông tin được coi là cần thiết để thực hiện
và diễn giải chính xác các thí nghiệm qPCR. Với điều này,
mục tiêu của các tác giả là đảm bảo tính toàn vẹn của tài
liệu khoa học, thúc đẩy tính nhất quán giữa các phòng thí
nghiệm khác nhau và tăng tính minh bạch trong thực nghiệm.
Chín dòng hướng dẫn riêng biệt được xây dựng, liên quan đến
các mục sau: (1) thiết kế thử nghiệm; (2) thông tin mẫu; (3)
chiết xuất axit nucleic; (4) phản ứng sao chép ngược; (5)
trình tự gen mục tiêu; (6) oligonucleotide; (7) giao thức
qPCR; (8) xác nhận qPCR; và (9) phân tích dữ liệu.
Nhìn chung, nếu những hướng dẫn này được tính đến, người
ta có thể yên tâm rằng quy trình được mô tả là chi tiết và
rõ ràng để tất cả người đọc có thể diễn giải hoặc đánh giá
một cách chính xác và thực hiện (và nếu cần lặp lại) các thí
nghiệm được mô tả. Hơn nữa, việc sử dụng các hướng dẫn này
sẽ khuyến khích thực hành thử nghiệm tốt hơn, cho phép diễn
giải kết quả qPCR một cách đáng tin cậy và rõ ràng hơn. Với
hơn 3000 trích dẫn, hướng dẫn MIQE được công nhận và chấp
nhận rộng rãi, từ đó nâng cao chất lượng của kết quả qPCR
được báo cáo. Nhưng chúng tôi vẫn đang chờ đợi
Machine Translated by Google

56 Chẩn đoán phân tử

việc triển khai các hướng dẫn thậm chí còn mang tính toàn Bhagwat, AA, 2003. Phát hiện đồng thời các chủng Escherichia coli O157: H7, Listeria

cầu hơn, vì điều này sẽ khuyến khích việc kiểm tra chi tiết monocytogenes và Salmonella bằng PCR thời gian thực.

Int. J. Vi sinh thực phẩm. 84, 217e224.

các chi tiết thử nghiệm, phân tích dữ liệu và nguyên tắc báo
Bonetta, L., 2005. Thời điểm quan trọng nhất cho PCR thời gian thực. Nat. Phương pháp 2,
cáo. Do đó, việc triển khai chung là điều kiện tiên quyết
305e312.
quan trọng để phát triển hơn nữa qPCR thành công nghệ định
Bustin, SA, Benes, V., Garson, JA, Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller,
lượng axit nucleic mạnh mẽ, chính xác và đáng tin cậy.
R., Nolan, T., Pfaffl, MW, Shipley, GL, Vandesompele, J. , Wittwer, CT, 2009.

Hướng dẫn MIQE: thông tin tối thiểu để xuất bản các thí nghiệm PCR thời gian thực

4.9 KẾT LUẬN định lượng. Phòng khám. Chem. 55, 611e622.

Sự ra đời của công nghệ qPCR đã đơn giản hóa một cách cách Bustin, S., Dhillon, HS, Kirvell, S., Greenwood, C., Parker, M.,

mạng việc định lượng DNA và RNA. Điều này đã có tác động lớn Shipley, GL, Nolan, T., 2015. Sự biến đổi của bước phiên mã ngược: ý nghĩa thực

đến lĩnh vực nghiên cứu và chẩn đoán phân tử, vì có thể thu tiễn. Phòng khám. Chem. 61, 202e212.

được lượng dữ liệu khổng lồ trong thời gian nghiên cứu rất Cardullo, RA, Agrawal, S., Flores, C., Zamecnik, PC, Wolf, DE, 1988.

ngắn. Chi phí giảm đối với máy chu trình nhiệt cũng như các Phát hiện sự lai hóa axit nucleic bằng cách truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh

quang không bức xạ. Proc. Natl. Học viện. Khoa học. 85, 8790e8794.
thuốc thử cần thiết để áp dụng kỹ thuật này đã hỗ trợ cho
Catrina, IE, Marras, SA, Bratu, DP, 2012. Đèn hiệu phân tử cực nhỏ: Đầu dò tinh tinh
việc sử dụng kỹ thuật này tăng lên nhanh chóng. Thật vậy,
LNA/20 -O-methyl RNA để chụp ảnh các quá trình mRNA động trong tế bào sống. Hóa
việc sử dụng nó tăng theo cấp số nhân kể từ khi phát triển.
chất ACS. Biol. 7, 1586e1595.
Do đó, rõ ràng là kỹ thuật này đã trở thành tiêu chuẩn vàng
Clementi, M., Bagnarelli, P., Manzin, A., Menzo, S., 1994. Phản ứng chuỗi polymerase
để phát hiện và định lượng DNA và RNA trong các phòng thí
cạnh tranh và phân tích hoạt động của virus ở cấp độ phân tử. Genet. Hậu môn.
nghiệm nghiên cứu hoặc chẩn đoán nói chung. Sinh khối. Anh. 11, 1e6.

Crystal, RG, 1995. Chuyển gen sang con người: những bài học ban đầu và những trở ngại

Mặc dù bản thân các xét nghiệm qPCR được đặc trưng bởi độ cho sự thành công. Khoa học 270, 404e410.

chính xác và độ tái lập cao, nhưng độ chính xác của dữ liệu De Crom, SC, Rossen, JW, Van Furth, AM, Obihara, CC, 2016.

thu được phần lớn phụ thuộc vào một số yếu tố khác. Nhiễm Enterovirus và parechovirus ở trẻ em: tổng quan ngắn gọn.

Sẽ là không đủ nếu chỉ mở rộng kiến thức về PCR điểm cuối cổ Euro. J. Pediatr. 175 (8), 1023e1029.

Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J., 2010. Cách thực hiện phân tích biểu
điển để thiết kế và phân tích các thí nghiệm sử dụng qPCR.
hiện gen thành công bằng PCR thời gian thực. Phương pháp 50, 227e230.
Thật vậy, cần có nhiều biện pháp kiểm soát khác để đảm bảo
chắc chắn về độ chính xác của kết quả khi sử dụng xét nghiệm qPCR.
Endimiani, A., Jacobs, MR, 2016. Vai trò đang thay đổi của Phòng thí nghiệm Vi sinh lâm
Những yếu tố này, chẳng hạn như chuẩn bị mẫu, chất lượng của
sàng trong việc xác định tình trạng kháng thuốc ở vi khuẩn Gram âm.
chất chuẩn, lựa chọn gen tham chiếu có liên quan và chuẩn
Lây nhiễm. Dis. Phòng khám. Bắc Am. 30, 323e345.
hóa mẫu, cần được xem xét cẩn thận và tối ưu hóa. Hơn nữa, Ewing, MM, Thompson, JM, Mclaren, RS, Purpero, VM, Thomas, KJ, Dobrowski, PA, Degroot,
điều quan trọng là phải đạt được các tiêu chí được tiêu chuẩn GA, Romsos, EL, Storts, DR, 2016. Đánh giá chất lượng mẫu và định lượng DNA của

hóa và tính đồng nhất quốc tế trong thiết kế thử nghiệm cũng con người: xác nhận sự phát triển của Hệ thống PowerQuant

như phân tích và báo cáo dữ liệu để có thể so sánh dữ liệu

giữa các phòng thí nghiệm khác nhau và diễn giải chính xác Khoa học pháp y. Int. Genet. 23, 166e177.

độ tin cậy của dữ liệu được công bố. Sau này đã được cải Faloona, F., Mullis, K., Scharf, S., 1986. Khuếch đại enzyme cụ thể của DNA trong ống

nghiệm. Cảng mùa xuân lạnh. Triệu chứng. Số lượng. Biol. 263e273.
thiện rất nhiều với việc xuất bản các hướng dẫn MIQE.
Gasparic, MB, Cankar, K., Zel, J., Gruden, K., 2008. So sánh các phương pháp hóa học

PCR thời gian thực khác nhau và tính phù hợp của chúng trong việc phát hiện và

định lượng các sinh vật biến đổi gen. Công nghệ sinh học BMC. 8, 26.
NGƯỜI GIỚI THIỆU
Gibson, U., Heid, CA, Williams, PM, 1996. Một phương pháp mới cho RT-PCR định lượng

Ahmad, AI, 2007. BOXTO với tư cách là phóng viên về thuốc nhuộm theo chu trình nhiệt theo thời gian thực. theo thời gian thực. Bộ gen Res. 6, 995e1001.

J. Sinh học. 32, 229e239. Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R., Mathieu, C.,

Bailey, JS, Cox, NA, 1992. Canh thang tiền tăng sinh phổ biến để phát hiện đồng thời 2001. Tổng quan về PCR định lượng thời gian thực: ứng dụng để định lượng biểu

Salmonella và Listeria trong thực phẩm. J. Thực phẩm hiện gen cytokine. Phương pháp 25, 386e401.

Prot. 55, 256e259.

Benes, V., Castoldi, M., 2010. Lập hồ sơ biểu hiện của microRNA bằng phương pháp PCR Gray, J., Coupland, L., 2014. Việc ứng dụng ngày càng tăng các xét nghiệm phát hiện

định lượng thời gian thực, cách sử dụng và những gì có sẵn. axit nucleic đa thành phần để chẩn đoán nhiễm trùng hội chứng.

Phương pháp 50, 244e249. Epidemiol. Lây nhiễm. 142, 1e11.

Bengtsson, M., Karlsson, HJ, Westman, G., Kubista, M., 2003. Thuốc nhuộm phóng viên Gudnason, H., Dufva, M., Bang, DD, Wolff, A., 2007. So sánh nhiều loại thuốc nhuộm DNA

cyanine bất đối xứng liên kết rãnh nhỏ mới cho PCR thời gian thực. Axit nucleic cho PCR thời gian thực: ảnh hưởng của nồng độ thuốc nhuộm và thành phần trình tự

Res. 31, e45. lên quá trình khuếch đại DNA và nhiệt độ nóng chảy. Axit nucleic Res. 35, e127.

Bernard, PS, Wittwer, CT, 2000. Khuếch đại đồng nhất và phát hiện biến thể bằng đầu dò

lai huỳnh quang. Phòng khám. Chem. 46, 147e148. Guyer, RL, Koshland Jr., DE, 1989. Phân tử của năm. Khoa học

246, 1543.
Machine Translated by Google

Chương PCR định lượng | 4 57

Hackett, NR, El Sawy, T., Lee, LY, Silva, I., O'leary, J., Rosengart, TK, Crystal, Livak, KJ, 1999. Phân biệt allelic bằng cách sử dụng đầu dò fluorogen và xét

RG, 2000. Sử dụng PCR thời gian thực TaqMan định lượng để theo dõi thời gian nghiệm 50 nuclease. Genet. Hậu môn. Sinh khối. Anh. 14, 143e149.

phụ thuộc phân bố các vectơ chuyển gen in vivo. Mol. Đó. 2, 649e656. Mestdagh, P., Hartmann, N., Baeriswyl, L., Andreasen, D., Bernard, N., Chen, C.,

Cheo, D., D'andrade, P., Demayo, M., Dennis, L ., 2014.

Hartnell, R., Lowther, J., Avant, J., Dancer, D., Lees, D., Russell, J., 2012. Đánh giá các nền tảng biểu hiện miRNA định lượng trong nghiên cứu kiểm soát

Sự phát triển của LENTICULES làm tài liệu tham khảo cho ovirus cũng như chất lượng micro RNA (miRQC). Nat. Phương pháp 11, 809e815.

ovirus. J. Ứng dụng. Vi sinh vật. 112, 338e345. Moreau, V., Voirin, E., Paris, C., Kotera, M., Nothisen, M., Remy, J.-

He, L., Hannon, GJ, 2004. MicroRNA: các RNA nhỏ có vai trò lớn trong S., Behr, J.-P., Erbacher, P., Lenne-Samuel, N., 2009. Zip Nucleic

điều hòa gen. Nat. Linh mục Genet. 5, 522e531. Acids: các oligonucleotide có ái lực cao mới làm mồi mạnh cho PCR
Heid, CA, Stevens, J., Livak, KJ, Williams, PM, 1996. Thời gian thực và sao chép ngược. Axit nucleic Res. 37 (19). http://dx.doi.org/

PCR định lượng. Bộ gen Res. 6, 986e994. 10.1093/nar/gkp661.

Heller, MJ, Morrison, LE, 1985. Phát quang hóa học và huỳnh quang Morey, JS, Ryan, JC, Van Dolah, FM, 2006. Xác nhận microarray: các yếu tố ảnh

đầu dò cho hệ thống lai DNA. Phát hiện nhanh. Nhận dạng. Lây nhiễm. đại lý hưởng đến mối tương quan giữa microarrays oligonucleotide và PCR thời gian

245e256. thực. Biol. Đã xử lý. Trực tuyến 8, 175e193.

Hierro, N., Esteve-Zarzoso, B., Gonzalez, A., Mas, A., Guillamon, JM, 2006. PCR Nazarenko, IA, Bhatnagar, S., Hohman, R., 1997. Một dạng ống kín để khuếch đại và

định lượng thời gian thực (QPCR) và QPCR phiên mã ngược để phát hiện và định phát hiện DNA dựa trên sự truyền năng lượng.

lượng tổng số nấm men trong rượu vang. ứng dụng. Axit nucleic Res. 25, 2516e2521.

Môi trường. Vi sinh vật. 72, 7148e7155. Nazarenko, I., Lowe, B., Darfler, M., Ikonomi, P., Schuster, D., Rashtchian, A.,

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R., 1993. Phân tích Kinetic PCR: 2002. PCR định lượng đa kênh sử dụng mồi tự dập tắt được dán nhãn một

theo dõi thời gian thực các phản ứng khuếch đại DNA. fluorophore. Axit nucleic Res. 30, e37.

Công nghệ sinh học 11, 1026e1030. Nielsen, PE, Egholm, M., Berg, RH, Buchardt, O., 1991. Nhận dạng có chọn lọc

Holland, Thủ tướng, Abramson, RD, Watson, R., Gelfand, DH, 1991. trình tự DNA bằng cách dịch chuyển chuỗi bằng polyamit thay thế thymine. Khoa

Phát hiện sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase cụ thể bằng cách sử dụng hoạt học 254, 1497e1500.

tính 5'd3'exonuclease của enzyme DNA polymer Thermus Aquas. Proc. Natl. Học Norton, DM, 2002. Các phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi Polymerase để phát hiện

viện. Khoa học. 88, 7276e7280. Listeria monocytogenes: hướng tới sàng lọc theo thời gian thực đối với các

Hudlow, WR, Chong, MD, Swango, KL, Timken, MD, Buoncristiani, MR, 2008. Xét nghiệm mẫu thực phẩm và môi trường. J. AOAC Int. 85, 505e515.

qPCR thời gian thực bốn cực để đánh giá đồng thời tổng số DNA của con người, Paris, C., Moreau, V., Deglane, G., Voirin, E., Erbacher, P., Lenne Samuel, N.,

DNA nam giới của con người, sự thoái hóa DNA và sự hiện diện của các chất ức 2010. Axit nucleic Zip là chất thăm dò thủy phân mạnh cho PCR định lượng.

chế PCR trong các mẫu pháp y: một công cụ chẩn đoán để gõ STR. Khoa học pháp Axit nucleic Res. 38, e95.

y. Int. Genet. 2, 108e125. Pfaffl, MW, 2001. Một mô hình toán học mới để định lượng tương đối trong RTePCR

Johnson, GC, Todd, JA, 2000. Các chiến lược lập bản đồ các bệnh phức tạp. thời gian thực. Axit nucleic Res. 29, e45.

Curr. Ý kiến. Genet. Dev. 10, 330e334. Provenzano, M., Mocellin, S., 2007. Các kỹ thuật bổ sung: xác nhận dữ liệu biểu

Kayser, S., Walter, RB, Stock, W., Schlenk, RF, 2015. Bệnh còn sót lại tối thiểu hiện gen bằng phương pháp PCR thời gian thực định lượng. Khuyến cáo. Exp.

trong tình trạng hiện tại và tương lai của bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính. Med. Biol. 593, 66e73.

Curr. Hematol. Malig. Dân biểu 10, 132e144. Rijpens, NP, Herman, LM, 2002. Các phương pháp phân tử để xác định và phát hiện

Kim, MJ, Lee, SY, Kim, HJ, Lee, JS, Joo, IS, Kwak, HS, vi khuẩn gây bệnh thực phẩm. J. AOAC Int. 85, 984e995.

Kim, HY, 2016. Phát triển phương pháp RT-PCR song công một bước để phát hiện Ririe, KM, Rasmussen, RP, Wittwer, CT, 1997. Sự khác biệt hóa sản phẩm

đồng thời các vùng VP3/VP1 và VP1/P2B của vi-rút viêm gan A. J. Vi sinh vật. bằng cách phân tích đường cong nóng chảy DNA trong quá trình phản ứng chuỗi

Công nghệ sinh học. polymerase. Hậu môn. Hóa sinh. 245, 154e160.

Kirchner, B., Paul, V., Riedmaier, I., Pfaffl, MW, 2014. Độ tinh khiết và tính Risch, NJ, 2000. Tìm kiếm các yếu tố di truyền quyết định trong thiên niên kỷ

toàn vẹn của mRNA và microRNA: chìa khóa thành công trong việc lập hồ sơ biểu mới. Bản chất 405, 847e856.

hiện. Phương pháp Mol. Biol. 1160, 43e53. Rocha, JM, Xavier, SG, De Lima Souza, ME, Assumpcao, JG, Murao, M., De Oliveira,

Kutyavin, IV, Afonina, IA, Mills, A., Gorn, VV, Lukhtanov, EA, Belousov, ES, BM, 2016. Các chiến lược hiện tại để phát hiện bệnh còn sót lại tối thiểu

Singer, MJ, Walburger, DK, Lokhov, SG, Gall, AA, 2000. Chất kết dính rãnh 30 trong bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính ở trẻ em. Mediterr. J.

-DNA đầu dò làm tăng độ đặc hiệu của trình tự ở nhiệt độ mở rộng PCR. Axit Hematol. Lây nhiễm. Dis. 8, e2016024.

nucleic Res. 28, 655e661. Rowley, JD, 1998. Vai trò quan trọng của sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể trong bệnh

bạch cầu ở người. Annu. Linh mục Genet. 32, 495e519.

Lee, M., Siddle, A., Page, R., 2002. ResonSense: đầu dò huỳnh quang tuyến tính Rudi, K., Nogva, HK, Moen, B., Nissen, H., Bredholt, S., Moretro, T., Naterstad,

đơn giản cho phản ứng chuỗi polymerase nhanh đồng nhất về số lượng. Hậu môn. K., Holck, A., 2002. Phát triển và ứng dụng axit nucleic mới dựa trên Công

Chim. Acta 457, 61e70. nghệ phân tích cộng đồng vi sinh vật trong thực phẩm Int. J. Vi sinh thực

Lee, RC, Feinbaum, RL, Ambros, V., 1993. Gen mãn tính C. Elegans dị tính lin-4 phẩm. 78, 171e180.

mã hóa các RNA nhỏ có tính chất bổ sung antisense cho lin-14. ô 75, 843e854. Saitta, E., Brasselet, A., Cadouot, M., Gibeaud, A., Jourdain, M., Bozonnet, D.,

Goussot, V., Riedinger, JM, Lizard, S., 2016. Các bước xác thực cho Phát

Lewis, BP, Shih, I.-H., Jones-Rhoades, MW, Bartel, DP, Burge, CB, 2003. Dự đoán hiện đột biến L858R ở gen EGFR bằng PCR định lượng thời gian thực. Ann. Biol.

các mục tiêu microRNA của động vật có vú. Ô 115, 787e798. Phòng khám. Paris. 74, 196e202.

Livak, KJ, Schmittgen, TD, 2001. Phân tích dữ liệu biểu hiện gen tương đối bằng Senoo, M., Matsubara, Y., Fujii, K., Nagasaki, Y., Hiratsuka, M., Kure, S.,

phương pháp PCR định lượng thời gian thực và phương pháp 2dDDCT. Uehara, S., Okamura, K., Yajima, A., Narisawa, K., 2000. Adenovirus qua

Phương pháp 25, 402e408. trung gian chuyển gen tử cung ở chuột và chuột lang: mô
Machine Translated by Google

58 Chẩn đoán phân tử

sự phân bố adenovirus tái tổ hợp được xác định bằng xét nghiệm định lượng trong các khối u ác tính về huyết học bằng phương pháp PCR định lượng thời gian thực: nguyên tắc,

chuỗi phản ứng TaqManepolymerase. Mol. Genet. Metab. 69, 269e276. phương pháp tiếp cận và các khía cạnh trong phòng thí nghiệm. Bệnh bạch cầu 17, 1013e1034.

Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe,

Stappers, MH, Hagen, F., Reimnitz, P., Mouton, JW, Meis, JF, Gyssens, IC, 2016. A., Speleman, F., 2002. Chuẩn hóa chính xác RT-PCR định lượng thời gian thực

Bacteroides fragilis trong sinh thiết của bệnh nhân bị áp xe nặng và nhiễm dữ liệu bằng cách lấy trung bình hình học của nhiều gen kiểm soát nội bộ.

trùng bàn chân do tiểu đường: phát hiện trực tiếp bằng phân tử so với phát Bộ gen Biol. 3 (7) nghiên cứu0034.

hiện dựa trên nuôi cấy. Chẩn đoán vi sinh vật. Lây nhiễm. Dis. 85, 263e265. Von Ahsen, N., Oellerich, M., Schütz, E., 2000. Sử dụng hai loại thuốc nhuộm báo

Stryer, L., 1978. Truyền năng lượng huỳnh quang như một thước đo quang phổ. cáo mà không can thiệp vào PCR chu kỳ nhanh ống đơn: xác định kiểu gen a1-

Annu. Mục sư Hóa sinh. 47, 819e846. antitrypsin bằng phương pháp PCR huỳnh quang thời gian thực ghép kênh với

Summers, KE, Goff, LK, Wilson, AG, Gupta, RK, Lister, TA, Fitzgibbon, J., 2001. Light Cycler . Phòng khám. Chem. 46, 156e161.

Tần suất sắp xếp lại Bcl-2/IgH ở người bình thường: ý nghĩa đối với việc theo Warhurst, G., Dunn, G., Chadwick, P., Blackwood, B., Mcauley, D., Perkins, GD,

dõi bệnh ở bệnh nhân mắc bệnh Giải phẫu hạch bạch huyết. J. Lâm sàng. Oncol. Mcmullan, R., Gates, S., Bentley, A., Young, D., Carlson , GL, Dark, P.,

19, 420e424. 2015. Phát hiện nhanh nhiễm trùng máu liên quan đến chăm sóc sức khỏe trong

Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M., 2000. Đầu dò phát sáng: axit trường hợp chăm sóc tích cực bằng cách sử dụng công nghệ phản ứng chuỗi

nucleic peptide liên hợp màu cam thiazole để phát hiện axit nucleic mục tiêu polymerase thời gian thực đa mầm bệnh: nghiên cứu độ chính xác chẩn đoán và

trong dung dịch đồng nhất. Hậu môn. Hóa sinh. 281, 26e35. đánh giá hệ thống. Công nghệ sức khỏe. Đánh giá. 19, 1e142.

Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J., Brown, T., 2000. Phương Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, SP, Brown, T., Little, S., 1999.

thức hoạt động và ứng dụng mồi Scorpion để phát hiện đột biến. Phát hiện các sản phẩm PCR bằng cách sử dụng các bộ khuếch đại tự thăm dò và phát

Axit nucleic Res. 28, 3752e3761. quang huỳnh quang. Nat. Công nghệ sinh học. 17, 804e807.

Tyagi, S., Kramer, FR, 1996. Đèn hiệu phân tử: đầu dò phát huỳnh quang khi lai. Wittwer, CT, Herrmann, MG, Gundry, CN, Elenitoba-Johnson, KS, 2001. Xét nghiệm

Nat. Công nghệ sinh học. 14, 303e308. PCR ghép kênh thời gian thực. Phương pháp 25, 430e442.

Tyagi, S., Bratu, DP, Kramer, FR, 1998. Đèn hiệu phân tử nhiều màu để phân biệt Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F., 2004. Các nghiên cứu về sự

alen. Nat. Công nghệ sinh học. 16, 49e53. xen kẽ DNA và liên kết bề mặt của SYBR Green I, việc xác định cấu trúc và ý

Van Der Velden, V., Hochhaus, A., Cazzaniga, G., Szczepanski, T., Gabert, J., Van nghĩa phương pháp luận của nó. Axit nucleic Res. 32, e103.

Dongen, J., 2003. Phát hiện bệnh còn sót lại ở mức tối thiểu