10 CÂU KIỂM TRA THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ

Phần 1: TÁCH CHIẾT

Câu 1: Trình bày các bước cơ bản chung trong tách chiết DNA

- Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước chính sau:

 Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào
hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K.
 Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein, polysaccharide.
Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh
cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa.

Protein sẽ bị biến tính và kết tủa

DNA, RNA được hoà tan trong nước

Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:

Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA.

Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.

Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine

 Bước 3. Tủa axít nucleic

Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20oC trong 30 phút hoặcở 0oC qua
đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa. Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1)
ở 0o C, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa.
 Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối
và isopropanol còn lại.
 Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Ribonuclease. Sau đó kết
tủa lại được DNA.

Câu 2: So sách giữa tách chiết bằng hóa chất ( phenol-chloroform ) và tách chiết bằằng cột silica

- Giống nhau: đều là công cụ để tách chiết DNA

- Khác nhau
 Chloform: độc hơn, rẻ hơn, bao gồm nhiều thao tác hơn, khó thực hiện hơn. So với nhiều
dung dịch hữu cơ, tách chiết protein bằng chloroform không thu được kết quả cao, tuy nhiên
nó lại rất hiệu quả khi cần loại bỏ phenol ra khỏi pha lỏng
 Cột silica: an toàn hơn, giá thành cao hơn hơn, ít thao tác thực hiện hơn. Rất dễ thủng luới
silica

Câu 3: Giải thích việc kiểm tra DNA tách chiết được bằng điện di và đo quang phổ

- Sau khi phân lập đuợc DNA  định lượng + phân tích chất luợng DNA  quan trọng trong
nghiên cứu ( PCR,…)  chạy điện di và chạy cùng với ước lượng đo quan phổ DNA:
 Phân tích sự hấp thụ tia cực tím của các nucleotide cung cấp một ước tính đơn giản và chính
xác về nồng độ của axit nucleic trong một mẫu. Purines và pyrmidine trong axit nucleic cho
thấy cực đại hấp thụ khoảng 260nm (ví dụ: dATP: 259nm; dCTP: 272nm; dTTP: 247nm) nếu
DNA mẫu tinh khiết không bị nhiễm bẩn đáng kể từ protein hoặc dung môi hữu cơ. Tỷ lệ của
OD260 / OD280 cần được xác định để đánh giá độ tinh khiết của mẫu. Phương pháp này tuy
 nhiên bị giới hạn bởi số lượng DNA và độ tinh khiết của chế phẩm. Phân tích chính xác DNA
Việc chuẩn bị có thể bị cản trở bởi sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu hoặc nếu lượng
DNA quá ít. Ví dụ, trong ước tính tổng số DNA bộ gen, sự hiện diện của RNA, DNA bị cắt, v.v.
có thể gây trở ngại cho việc ước tính chính xác tổng trọng lượng phân tử cao DNA bộ gen.
 Tỷ lệ giữa 1,8-2,0 biểu thị rằng sự hấp thụ trong phạm vi UV là do nucleic các axit.
 Tỷ lệ thấp hơn 1,8 cho thấy sự hiện diện của protein và / hoặc các chất hấp thụ tia cực tím
khác.
 Tỷ lệ cao hơn 2,0 cho thấy rằng các mẫu có thể bị nhiễm cloroform hoặc phenol. Trong cả hai
trường hợp (<1,8 hoặc> 2,0), nên kết tủa lại DNA
http://www.nbpgr.ernet.in/Portals/6/DMX/GENOMIC_RESOURCES/DNA%20quality-
spectrophotometry%20and%20electrophoresis.pdf

Câu 4: Nêu sự khác biệt cơ bản giữa tách chiết DNA và RNA

- Sự khác biệt giữa tách chiết DNA và RNA

 Sự định nghĩa
Tách chiết DNA: Quy trình phân lập và tinh sạch DNA
Tách chiết RNA: Quy trình tinh sạch RNA từ mẫu
 Loại axit nucleic được chiết xuất
Chiết xuất DNA: DNA
Chiết xuất RNA: RNA
 độ pH
Tách chiết DNA: Hoàn thành lúc 8.0
Tách chiết RNA: Thực hiện ở 4.7
 Các bước
Tách chiết DNA: Phá vỡ màng tế bào hoặc ly giải tế bào, loại bỏ lipid màng và kết tủa DNA
Chiết xuất RNA: Ly giải tế bào, chiết xuất guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform, chuẩn
bị với isopropanol
 Sử dụng nước đã qua xử lý DEPC
Chiết xuất DNA: Không có
Tách chiết RNA: Tất cả các thuốc thử được chuẩn bị bằng nước được xử lý bằng DEPC
 Nơi lưu trữ
Chiết xuất DNA: DNA có thể được chiết xuất trước và được lưu trữ theo lô
Chiết xuất RNA: Việc tách chiết RNA được thực hiện ngay trước khi các quy trình hạ nguồn
 Lưu trữ dài hạn
Chiết xuất DNA: Ở -20 ° C
Chiết xuất RNA: Ở -80 ° C
Câu 5: Tại sao trong pp tách chiết hóa chấất DNA ở pH = 8.0 còn RNA thì pH = 4.7

- Tại sao DNA cần được tách chiết ở 8 pH: DNA có thể bị biến tính ở trong môi trường Acid
hoặc Bazo nên cần phải tách chiết ở môi trường trung tính.
- RNA tách chiết ở 4.7pH (môi trường hơi acid): Ở môi trường kiềm, Nhóm OH dư trong
đường ribose có thể bị hydro hóa trong môi trường kiềm (alkaline hydrolysis).

Phần 2: PCR
Câu 1: Nguyên lý cơ bản của pp PCR

- Kỹ thuật PCR dựa trên sự sao chép của enzym DNA. Trong PCR, một đoạn ngắn của DNA
được khuếch đại bằng cách sử dụng các enzym trung gian mồi. DNA Polymerase tổng hợp
chuỗi DNA mới bổ sung cho DNA khuôn mẫu. DNA polymerase chỉ có thể thêm nucleotide
vào nhóm 3’-OH đã có từ trước. Do đó, cần phải có một đoạn mồi. Do đó, nhiều nucleotide
hơn được thêm vào đầu 3 ’của DNA polymerase.

Câu 2: Thành phần và các bước cơ bản trong PCR

- Thành phần
 Khuôn DNA ( lượng DNA thường dung khoảng 100-1000 ng cho phản ứng PCR 25-50 uL )-
 Mồi ( nồng độ mỗi mồi trong phản ứng là 0.1-0.5 uM)- những đoạn DNA sợi đơn bổ sung cho
đầu 3’
 Enzyme DNA polymerase ( thông thường, lượng enzyme sử dụng là 0.5 UL cho mỗi phản
ứng có thể tích 25 uL )-
 Các Nucleic tự do ( nồng độ dNTP mỗi loại khoảng 50-200 uM cho mỗi phản ứng PCR )- cung
cấp năng lượng cho quá trình trùng hợp và là nền tảng để tổng hợp DNA và là đơn vị cơ sở
đơn lẻ
 Dung dịch đệm – magie hoặc kali tạo điều kiện tối đa cho sự biếến tính của DNA. Nó cũng
quan trọng đối với độ hoạt động polymerase và sự ổn định
- Các bước cơ bản
 Denaturation: Biến tính - xảy ra khi phản ứng được tăng nhiệt độ khoảng 94oC khoảng từ
0.5-2 phút  hyrrogen broken giữa 2 mạch DNA  single strand  mỗi mạch đơn chính là
template  tổng hợp liên tục, nhanh chóng
 Annealing: Ủ- hạ nhiệt độ xuống 54-60oC khoảng 20-40s  đoạn mồi liên kếết với trình tự
bổ sung của chúng trên DNA. Sợi mồi là chuỗi DNA hoặc RNA có chiều dài khoảng 20-30
base. Là điểm khởi đầu của quá trình tổng hợp DNA. The two separated strands run in the
opposite direction and consequently there are two primers- a forward primer and a reverse
primer.
 Elongation: Kéo dài: tang nhiệt 72-80oC. Các bazơ được thêm vào đầu 3 ’của mồi nhờ enzym
Taq polymerase. Điều này kéo dài DNA theo hướng 5 'đến 3'. DNA polymerase thêm khoảng
1000bp / phút trong điều kiện tối ưu. Taq Polymerase có thể chịu được nhiệt độ rất cao. Nó
gắn vào mồi và thêm các gốc DNA vào sợi đơn. Kết quả là thu được một phân tử ADN sợi
kép. Ba bước này được lặp lại 20-40 lần để thu được một số trình tự DNA quan tâm trong
một khoảng thời gian rất ngắn.
- Bài tập: Tách chiết được bộ gen người với nồng độ 50 ng/ uL  PCR. Cần dung với 100 ng
khuôn mẫu  cần dung bao nhiêu uL đê đi phản ứng. 1 bộ gen người là 6,6 pg.
 Cần lấy 2 uL
 100 ng  chứa tầm 15k151 bộ gen người

Câu 3: Trình bày ngắn gọn về pp Real-time PCR,, ưu điểm của real-time PCR so với PCR ?

- Real-time RT-PCR là một phiên bản PCR được sửa đổi, trong đó sử dụng enzym được gọi là
enzym phiên mã ngược. Enzyme này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển đổi một chuỗi
RNA thành chuỗi DNA bổ sung của nó. RT-PCR hoạt động trên nguyên tắc phiên mã ngược
này. Đây là một kỹ thuật thời gian thực kết hợp phiên mã ngược của RNA thành DNA và
khuếch đại DNA mục tiêu. Đây là một phương tiện định tính để phát hiện một trình tự RNA
cụ thể với độ chính xác và độ nhạy cao.
- Ưu điểm
  PCR thông thường tốn nhiều thời gian hơn vì nó sử dụng điện di trên gel để phân tích các
sản phẩm PCR khuếch đại. Ngược lại, PCR thời gian thực ít tốn thời gian hơn vì nó có thể
phát hiện sự khuếch đại trong giai đoạn đầu của phản ứng.
 PCR thời gian thực thu thập dữ liệu ở giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của PCR trong
khi PCR truyền thống thu thập dữ liệu tại Điểm cuối của phản ứng.
 Kết quả điểm cuối của PCR thông thường có thể không chính xác lắm, nhưng kết quả của
PCR thời gian thực rất chính xác.
 PCR thời gian thực nhạy hơn PCR thông thường.
 PCR thông thường có độ phân giải rất kém trong khi PCR thời gian thực có thể phát hiện rất
ít thay đổi do độ phân giải cao.
 Phát hiện điểm cuối của PCR thông thường có dải động ngắn trong khi phát hiện PCR thời
gian thực có dải động rộng.
 Không giống như PCR thông thường, kỹ thuật phát hiện tự động được tìm thấy trong PCR
thời gian thực.
 PCR thông thường rất phức tạp và tốn nhiều công sức hơn PCR thời gian thực.
 Không giống như PCR thời gian thực, PCR thông thường không thể phân biệt vi khuẩn sống
và chết.
 PCR thời gian thực sử dụng hệ thống nhuộm huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm trong
khi PCR thông thường sử dụng ethidium bromide và tia UV để hình dung các dải trong môi
trường gel agarose.

Câu 4: Trình bày ngắn gọn về pp reverse transcription PCR

- Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược là một kỹ thuật phân tử thường được gọi là RT-
PCR. PCR là viết tắt của phản ứng chuỗi polymerase, một phương pháp trong phòng thí
nghiệm được sử dụng để khuếch đại các vùng cụ thể của DNA để chẩn đoán và phân tích
trong nghiên cứu y tế. PCR phiên mã ngược, thay vì DNA, sử dụng mRNA làm khuôn mẫu ban
đầu.

Câu 5 : Nguyên nhân của kết quả âm tính giả và dương tính giả trong xét nghiệm COVID-19
bằng rRT-PCR

Về dương tính giả:

Trong xét nghiệm PCR trong phòng thí nghiệm thông thường, một số kết quả dương tính giả có thể
được quản lý thông qua đường cong chuẩn hoặc các đối chứng tạm thời. Tuy nhiên, kết quả sai lệch
có thể xảy ra do: 1) kinh nghiệm rRT-PCR trong phòng thí nghiệm không đủ, 2) nhiễm chéo SARS-
CoV-2, 3) phát hiện coronavirus không xác định, 4) phát hiện không hoạt động / tồn dư SARS-CoV-2,
5) phản ứng chéo với axit nucleic từ các mầm bệnh hoặc tế bào mô khác, và 6) lý do kỹ thuật liên
quan đến mồi kit, đầu dò và loại huỳnh quang

Về âm tính giả:

ột số dạng âm tính giả phổ biến xảy ra: 1) hiệu suất rRT-PCR trong phòng thí nghiệm không đầy đủ,
2) thiếu hoặc giảm chất lượng mẫu, 3) lý do kỹ thuật liên quan đến mồi kit , đầu dò và loại huỳnh
quang, 4) Đột biến SARS-CoV-2 và 5) Thuốc ức chế RT-PCR. Việc thu thập, xử lý, vận chuyển mẫu bị
lỗi hoặc sự suy giảm của RNA SARS-CoV-2 trong quá trình vận chuyển / bảo quản có thể dẫn đến
hiệu suất xét nghiệm rRT-PCR dưới mức tối ưu và kết quả SARS-CoV-2 âm tính giả.