CHIẾT TÁCH PLASMID VK BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU NHỎ

NGUYÊN TẮC
 Tương tự chiết tách ADN bộ gen, nhưng phải thêm bước tách plasmid
 Phương pháp mẫu nhỏ (ly giải kiềm): chiết ADN plasmid từ 1-2 ml dịch nuôi cấy VK
ADN bộ gen (NST) ADN plasmid
Dưới tác động của SDS-kiềm thì các ADN bị biến tính và duỗi thẳng
Lớn hơn Nhỏ hơn (Plasmid lớn nhất = 8% kích thước của NST
Khi thêm KOAc, do kích thước lớn, không hồi phục, ở E.coli)
trạng thái kết tủa (cùng protein TB) Khi thêm KOAc, hồi phục được cấu dạng, ở trạng thái
hòa tan
Phân biệt về: cấu dạng, kích thước, độ tan, nhiệt độ biến tính

NGUYÊN VẬT LIỆU

 Vi khuẩn E. coli có mang plasmid pBluescript
 Môi trường nuôi cấy: Môi trường LB chứa ampicillin 50 µg/ml  duy trì plasmid do chủng E.coli mang
plasmid pBluescript có đề kháng ampicillin  thu VK còn plasmid (yếu tố chọn lọc, chất cảm ứng)
 Các dung dịch ly giải
 Dung dịch đệm GTE: Glucose, Tris-HCl, EDTA (Lysis solution I)
*Vai trò GTE:
o Glucose giúp ổn định áp suất thẩm thấu (duy trì đẳng trương), giúp TB không bị vỡ
o Tris-HCl: giúp ổn định pH môi trường
o EDTA: tạo phức ion trong enzym DNAse (khóa Mg2+), vô hiệu hóa enzym, ADN ko bị thoái hóa
→ Sol I (GTE) có chức năng huyền phù tế bào, giúp cho sol II (SDS – kiềm) tiếp xúc đều với các tế bào để phá
màng tế bào
 Dung dịch SDS- Kiềm: SDS 1% - NaOH 0,2 M (Lysis solution II). Pha dùng trong ngày
*Vai trò SDS – kiềm: phá vỡ TB (SDS) bằng cách nhũ tương hóa các thành phần lipit, biến tính protein trong
màng TB, ADN plasmid và ADN NST sợi đôi thành sợi đơn (Kiềm cắt lk H)
 Dung dịch KOAc 5 M, pH 4,8 (Lysis solution III) (pH để tủa protein)
*Vai trò KOAc: KOAc 5M trung hòa pH môi trường, giúp ADN plasmid phục hồi, ở tt hòa tan (ADN NST ko
phục hồi, ở tt kết tủa, loại = ly tâm); tủa protein, hỗ trợ tủa ADN bằng cồn
*Vì sao phải bổ sung KOAc ?
Dưới tác dụng của SDS kiềm: plasmid và NST đều bị tách thành dạng thẳng, khi cho KOAc thì ADN NST không phục
hồi được cấu trúc ban đầu, còn plasmid do kích thước nhỏ nên hồi tính (về dạng vòng). Do đó tách được ADN
plasmid khỏi ADN NST.
*Không thay thế bằng NaOAc được: vì ko thể tạo tủa protein
 Ethanol tuyệt đối: 2.5:1, Ethanol 70%
 RNAase 10 mg/ml
 Đệm TE 0,1
*Các bước tiến hành:
PHÁ VỠ TẾ BÀO
1. Hút 1.5 ml E. coli vào eppendorf
2. Đem ly tâm 20000g, 1min  đổ bỏ phần nước nổi
3. Phân tán TB VK trong 100 μl GTE  Vortex  Ủ 5 min ở t0 phòng
*Hiện tượng: sinh khối huyền phù đều
4. Thêm 200 μl SDS – kiềm (pH = 12-13)  úp ngửa eppendorf 5-10 lần  ủ đá 5 min
*Hiện tượng:

Nguyễn Thanh Huy – D21

 CHIẾT LẤY ADN
5. Thêm 150 μl KOAc 5M  úp ngửa eppendorf 5-10 lần  ủ đá 5 min
*Hiện tượng: tủa trắng xuất hiện
6. Đem ly tâm 20000g, 5min
7. Hút phần nước nổi sang eppendorf mới, tránh chuyển phần tủa, thu dịch chứa plasmid
*Nếu dính tủa, lặp lại 2 bước trên
KẾT TỦA , TINH CHẾ ADN, LOẠI TẠP CATION
8. Thêm 1 ml Ethanol tuyệt đối lạnh  úp ngửa eppendorf 5-10 lần
*Hiện tượng: ADN bị tủa (do muối cation htr I và ethanol lạnh)
9. Đem ly tâm 20000g, 15min để lắng tủa ADN plasmid  đổ bỏ ethanol
*Lúc này tủa thu được gồm: ARN, Ion kim loại, ADN plasmid
10. Rửa tủa: thêm 500 μl Ethanol 70%  ly tâm 20000g, 1min  hút bỏ ethanol, thu cắn plasmid
*Lưu ý tránh làm tróc tủa: đặt tip đối diện tủa
11. Khô cắn: mở nắp eppendorf, để t0 phòng/500C
12. Hòa tan: thêm 50 μl nước khử khoáng, 2 μl Rnase 10mg/ml  ủ 370C, 30min
13. Bảo quản ADN plasmid ở 40C (time ngắn)/-200C (time dài)

*Vì sao không dùng lysozym để phá hủy thành TB của E.coli (bài 2 dùng lysozym phá hủy thành tế bào của chủng
Bacillus subtilis) ?
Vì chủng Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương có vách rất dày gồm peptidoglycan. Còn E.coli là vi khuẩn gram âm
vách TB có 3 lớp, màng tế bào trong cùng peptidoglycan mỏng và lớp ngoài cùng với lipoprotein và
lipopolysaccharide tạo phức hợp lipid- polysaccharide
*So sánh sự tủa ADN trong ethanol và isopropanol?
Ethanol Isopropanol
Tinh khiết hơn
Nhiệt độ thấp
ADN kích thước lớn
ADN kích thước vừa
Lâu bay hơi hơn
Phải có sự hiện diện của ion kim
Giá thành cao hơn
loại hóa trị I
Không cần sự hiện diện của ion
Nhanh bay hơi
kim loại
Lượng thể tích cần nhiều (2,5:1)
Lượng thể tích cần ít (0,7:1)
*Thu được dịch nổi sau bước 6 (qua dd II và III):
Hỗn hợp gồm DNA plasmid, protein, RNA và RNAse. Loại bỏ tạp chất còn lại bằng phenol và chloroform và thu ADN
plasmid:
+ Phenol (độc): biến tính, tách protein ra khỏi nước bằng cách làm protein bộc lộ các vùng kị nước để tan trong phenol
(ADN tích điện âm do các nhóm photphat nên tan trong nước mà không tan trong phenol ít phân cực)
 Khi li tâm, dung dịch thu được tách thành 2 lớp: lớp trên là pha nước chứa DNA plasmid, lớp dưới là pha dung
môi hữu cơ có chứa protein các sản phẩm cần loại bỏ khác.
+ Chloroform: ít tan trong nước, hỗ trợ phenol biến tính protein và trung hòa lượng phenol còn dư
 Thu nhận dịch nổi phía trên có chứa plasmid nhưng với nồng độ thấp. Để tăng nồng độ plasmid ta dùng:
+ Ethanol ủ lạnh: tạo liên kết hydro với nước làm khả năng liên kết của ADN plasmid với nước giảm tạo kết tủa
 Thu tủa hòa với nước ta nhận được dung dịch có nồng độ plasmid cao hơn ban đầu.
* Sau khi thêm KOAc, không lắc rung eppendorf: sẽ gây lẫn tạp ADN NST vào plasmid

Nguyễn Thanh Huy – D21

 PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN

NGUYÊN LÝ PCR
 Khuếch đại đặc hiệu 1 đoạn ADN/ARN
 Kỹ thuật PCR dựa trên đặc điểm của quá trình sao chép gene trong tế bào
 Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa đặc hiệu
 Trong điều kiện có sẵn nucleotid, ADN polymerase sẽ kéo dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn ADN
sợi đơn nếu đầu 3’OH của mồi còn trống tạo thành sản phẩm sợi đôi
 Phản ứng được quay vòng nhờ mồi thừa và sử dụng nhiệt độ cao để tái tạo khuôn ADN sợi đơn từ sản
phẩm sợi đôi
CÁC THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG PCR: 20 -100µl
 ADN khuôn mẫu:
o Chứa đoạn ADN cần khuếch đại (trình tự đích). Có thể là ADN bộ gen, plasmid, cADN
o 50µl (nồng độ quá cao gây ức chế phản ứng)
o Kích thước ≤ 3 kilobase (ADN dài quá thì sẽ bị rối khi tách thành sợi đơn)
 Taq ADN polymerase (ADN polymerase chịu nhiệt): là 1 ADN polymerase in-vitro
o Xúc tác pứ gắn các 2-oxynucleotid vào mồi
o Hđ tối ưu ở 75-800C, hoạt tính giảm ở 37 0C
o 0,5 – 2U/50µl pứ
o Bảo quản trong glycerol  khá nhớt (để ko đông đá)
 Hỗn hợp đồng lượng các dNTP (Deoxynucleotide triphosphate):
o Cung cấp nlg và nu tự do (A, T, G và C, 10mM mỗi loại, nồng độ pứ 200µM)
 Dung dịch đệm phản ứng PCR:
o DTT: bảo quản chống oxh
o Làm mtr pứ và pH phù hợp để ổn định hoạt tính ADN polymerase, tăng H% gắn mồi
o Có nồng độ Mg2+ thay đổi tùy loại enzym (cần tối ưu hóa khi thay đổi cặp mồi) để tối ưu hóa hoạt
tính enzym, thường trong khoảng 0,5 – 5mM
 Nước: vừa đủ
 Mồi oligonucleotid (xuôi-ngược):
o Ngắn (15-30 nu) có đầu 3’-OH tự do bắt cặp bổ sung đặc hiệu với 2 đầu của đoạn ADN cần khuếch
đại  đảm bảo tính chính xác, đặc hiệu của PCR
o 1µM, nồng độ quá cao sẽ dẫn đến bắt cặp sai và làm giảm tính đặc hiệu
*Yêu cầu mồi PCR :
 Chiều dài 18 – 30 nucleotid (tối thiểu là 15, có thể dài hơn 30):
o Mồi ngắn quá thì sự gắn vào ADN sẽ không đặc hiệu
o Mồi dài quá thì 2 mồi có thể tự bắt cặp với nhau ở một trình tự nào đó (ko để chung)
 Khoảng cách các vị trí bắt cặp không quá 10kb (tốt nhất < 3kb)
 Tỷ lệ GC chiếm 40-60% . Các nucleotid AT và GC được phân bố đều, tránh dồn vào một chỗ
 Đầu 3’ của mồi nên có các nucleotid G hoặc C.
 Trình tự của mồi được lựa chọn sao không tạo cấu trúc kẹp tóc và hai mồi không bắt cặp với nhau
 Nhiệt độ chảy 2 mồi phải gần nhau khoảng 40-65 độ, tốt nhất 52 -58 độ
*Cách tính nhiệt độ gắn mồi :
Tm (oC)= 4(GC) +2(AT)
Nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ chảy khoảng 3 -50C: Tm -50C
Nhiệt độ gắn mồi ảnh hưởng bởi tỷ lệ G/C
*Kích thước sản phẩm PCR xác định bằng cách nào? Cụ thể là bao nhiêu?
 Mồi xuôi: vị trí 40-59

Nguyễn Thanh Huy – D21

  Mồi ngược: vị trí 1532-1513
 Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược. Mồi ngược trừ mồi xuôi 1532 – 40 = 1492 (khoảng 1,5kb)
*Các yếu tố cần được tối ưu hóa:
 Khuôn mẫu của polymerease, cần tối ưu hóa cho từng khuôn mẫu khác nhau thường trong khoảng 0.5 –
5mM
 Nhiệt độ gắn mồi = Tm -50C, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng:
o Quá cao phản ứng khó diễn ra
o Quá thấp không đặc hiệu
*Yếu tố quyết định kích thước đoạn khuếch đại:
 Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược
 RE được chọn để cắt cần lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu tù hay đầu dính
*Các bước tiến hành 1 phản ứng PCR:
1. Biến tính khởi đầu: ADN sợi đôi thành các sợi đơn (để gắn mồi) ở 950C trong 5 – 10 phút (ở nhiệt độ này tất
cả ADN sợi đôi bất kể chiều dài đều bị biến tính, lk H bị phá vỡ)
2. Chu kỳ nhiệt (điển hình): Gồm 3 bước lặp lại 25 - 40 lần (tăng chu kì sẽ tăng số bản copy)
a. Biến tính: 92 - 96 độ trong 30s - vài phút
b. Gắn mồi: 45 - 65 độ (< Tm của mồi) trong 30 – 60s
Các mồi lai đặc hiệu với trình tự bổ sung ở 2 đầu ADN đích và ngăn 2 mạch ADN đơn hồi tính
c. Kéo dài: 72 độ đối với Taq enzym polymerase, thời gian tùy theo độ dài khuôn.
Enzym polymerase kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu tạo thành 2 sợi đôi mới
3. Kéo dài kết thúc: 72 - 74 độ trong 5 - 15 phút (gấp vài lần thời gian kéo dài)
ADN polymerase tiếp tục tổng hợp các đoạn ADN chưa được kéo dài hoàn tất (do chu kì cuối, hoạt lực enzym giảm)
*Các bước tiến hành: *ghi nhãn ở mặt bên, ko ghi trên nắp
1. Cài đặt chương trình cho máy PCR
1 chu kỳ: 950C 5 phút
30 chu kỳ: 950C 45s --- 550C 45s --- 720C 2 phút
1 chu kỳ: 720C 10 phút
1 chu kỳ: 40C 5 phút
2. Chuẩn bị các thành phần pứ vào tube PCR theo thứ tự trong bảng
* Chú ý hút Taq Enzym nhớ CHỈ NHÚNG ĐẦU TIP GẦN MẶT THOÁNG VÀ DỊCH CHUYỂN XUỐNG
*Trong qtr chuẩn bị, luôn đặt tube PCR và các thành phần pứ trong đá bào
*Chỉ lấy Taq khỏi tủ lạnh -200C ngay trc khi sd (enzym giảm hoạt tính khi nhiệt độ thay đổi)
*Khi chuẩn bị nhiều pứ cùng lúc, để hạn chế sai số, chuẩn bị MasterMix (MM) có V tương ứng với slg pứ,
gồm các thành phần của 1 pứ (trừ ADN khuôn, bổ sung sau)
3. Trộn đều nhẹ nhàng: khẩy ngón tay vào đáy tube PCR 3-5 lần
4. Spin trên máy ly tâm
5. Cho tube PCR vào máy, chạy chương trình
6. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng pp điện di trên gel agarose
*Ưu nhược điểm PCR :
 Ưu: Nhanh, đơn giản, nhảy, đặc hiệu
 Nhược: Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi ; Ngoại nhiễm mất tính đặc hiệu
*Vai trò mastermix:
 Hút chính xác hơn các chất có thể tích nhỏ
 Tiết kiệm hóa chất
*Nhiệt độ nắp đậy máy PCR: được gia nhiệt tới 1050C để các dung môi bay hơi ngưng tụ, pứ ở thể lỏng

*Lưu ý chọn tube PCR: tái sd đc, chịu nhiệt cao, phù hợp từng loại máy luân nhiệt, thành mỏng

Nguyễn Thanh Huy – D21

Nguyễn Thanh Huy – D21