Chương IVA

DNA EXTRACTION

Trần Nhân Dũng

 Nguyên tắc ly trích DNA

Ví dụ ly trích DNA lá cây có múi

Gồm 3 bước chánh:

(1) Phá vách tế bào, màng tế bào, màng nhân.
Thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh.
(2) Loại protein và polysaccharides khỏi DNA.
Loại protein trong các phase không hòa tan. DNA được kết tủa trong
ethanol. Thu DNA.
(3) Thu hồi DNA.
Thu DNA ở trạng thái nguyên vẹn tối đa.

2
 Khử trùng bề mặt lá

- Khử trùng bề mặt lá bằng cồn 70%, sau đó dùng kéo và kẹp (đã
được khử trùng) cắt lá thành từng mảnh nhỏ rồi cho riêng vào các
tuýp Eppendorf 2ml (mỗi mẫu riêng một tuýp khoảng 0,1g).

3
 Phá vỡ tế bào

• Phá vỡ tế bào
• - Để các tuýp và dụng cụ nghiền mẫu vào nitơ lỏng (-196 oC) trong 10 phút.
• - Cho mẫu vào máy nghiền, có tần số 27 lần/giây, lập lại khoảng 3 lần.
• - Cho vào mỗi tuýp 1ml dung dịch EB (extraction buffer) và 50µl SDS
(sodium dodecyl sulfate) 10%, lắc mạnh.
• - Ủ các tuýp ở 65 oC trong 30 phút, tiến hành đảo tuýp mỗi 5 phút một lần.
• - Ly tâm các tuýp ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, chuyển phần trong bên
trên sang tuýp mới (800µl).

4
 Trầm hiện DNA

• Trầm hiện DNA

- Cho vào các tuýp một lượng tương đương Isopropanol (800 µl),
đảo nhẹ.
- Ủ các tuýp ở -20 oC trong 2 giờ.
- Li tâm các tuýp 12000 vòng/phút trong 10 phút, đỗ bỏ phần dung
dịch trong ở bên trên.

5
 Tinh sạch DNA

- Cho vào mỗi tuýp 400 µl TE 0.1 và 400 µl CTAB (hexadecyl trimethylammonium
bromide), đảo nhẹ tuýp.
- Ủ các tuýp ở 65 oC trong 30 phút.
- Cho vào các tuýp 200 µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ.
- Ly tâm các tuýp ở 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy phần trên (700 µl) mới.
- Cho vào tuýp mới 1.4 ml cồn 95 %, đảo nhẹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Li tâm các tuýp ở 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Rửa mẫu bằng 700 µl cồn 70 % (2 lần), vệt trắng nhỏ đọng bên dưới đáy tuýp
chính là DNA sau khi đã được làm sạch.
- Hút chân không trong 10 phút trong máy sấy chân không ở 45 oC để làm khô DNA.
6
 Trữ DNA

• DNA được trữ trong 200 µl TE 0.1 X ở -20 oC.

CÔNG THỨC:
Extraction Buffer: 0.1M Tris.Cl (pH8), 0.5M NaCl, 0,05M EDTA, 0.01 beta mercaptho ethanol;
CTAB buffer: 0.2M Tris. Cl pH7.5, 2M NaCl, 0.05M EDTA .
TE 10 X: Cho 100 ml Tris.HCl pH 8.0 và 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 vào chai có sẵn 880 ml nước
cất 1 lần. Khuấy đều.
Loading buffer 10 X: Cho 0.05 g Bromophenol, 0.05 g Xylene Cyanol, 6 ml Glycerol vào cốc có
sẵn 14 ml nước cất khử trùng. Khuấy đều.

7
Centrifuge
65oC
13000rpm


Put in liquid nitrogen

about 10 minute
CTAB-EDTA
Eliminate protein & complex
2-Mercapto ethanol TE 0.1X
substances
SDSD(sodium
10% dodecyl sulfate) alcohol (24:1)
chloroform-isoamyl
estroy ARN by Rnase
DNA
Precipitate in 95% ethanol
DNA extraction
Wash 70% ethanolprocess
8

* Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)

 Công dụng các hóa chất trong quy trình trích DNA

• Tris-HCl pH 8-8,6;
• SDS (sodium dodecyl sulfate)
• EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
• CTAB (hexadecy cetyltrimethylammonium
bromide,
• Chloroform-isoamylalcohol (24-1)
• 2-mercaptoethanol
• Ethanol 95-100%; Ethanol 70%
• Triton X-100
 Máy ly tâm
Máy nghiền

10

Máy hút chân không