TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN .....-2 :2018

Xuất bản lần 1

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO

Fertilizers - Determination of free amino acids content

HÀ NỘI - 2018
TCVN ………….-2:2018

2
 TCVN ……-2:2018

Lời nói đầu

TCVN …….-2:2018 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn,
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn
Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

3
TCVN ………….-2:2018

4
 TCVN ……-2:2018

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN .........-2:2018

Phân bón – Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do

Fertilizers - Determination of free amino acids content

1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này quy định phương pháp xác định tổng hàm lượng axit amin tự do và từng loại
axit amin tự do;

Đối với phương pháp xác định tổng axit amin sử dụng phương pháp định l ượng nito formol và
hiệu chỉnh với nitơ ammoniac;

Đối với phương pháp xác định từng loại axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) dùng phương pháp
với việc sử dụng thiết bị phân tích axit amin hoặc thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có cột
trao đổi ion. Phương pháp áp dụng cho các axit amin sau:

- tổng của cystin và cystein; methionin; lysin; threonin; alanin; arginin; axit aspartic; axit glutamic;
glycin; histidin; iso leucin; leucin; phenylalanin; prolin; serin; tyrosin; valin.

Phương pháp này không phân biệt giữa các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng
đồng phân D và L của axit amin. Phương pháp không cho phép xác định tryptophan hoặc các chất
tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl.

2 Nguyên tắc

Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có
phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dung
dịch lọc dùng để xác định hàm lượng axit amin tự do.

2.1 Tổng axit amin tự do trong nước có môi trường trung tính, do 2 nhóm chức axit (-HCOOH) và
amin (-NH 2) đều yếu, quá trình điện ly kém, đồng thời 2 nhóm chức này còn trung hòa lẫn nhau.
Khi mẫu thử kết hợp với formol, nhóm amin kết hợp với formol tạo thành nhóm methylenic, muối
amoni trung tính kết hợp với formol tạo thành hexamethylen tetraamin và HCl. Do đó làm mất tính
kiềm của dung dịch, chuẩn độ lượng HCl và nhóm COOH được giải phóng ra trong phản ứng
bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N cho đến khi pH dung dịch đạt 9,2. Dựa vào l ượng kiềm tiêu tốn
khi chuẩn độ để tính tổng hàm lượng nitơ amin và nitơ amoniac (gọi chung nitơ formol). Hàm

5
TCVN ………….-2:2018
lượng nitơ axit amin được tính bằng cách hiệu chỉnh hàm lượng nitơ formol với hàm lượng nitơ
amoniac.

- Muối amoni có trong mẫu thử sau khi hòa tan trong n ước được kiềm hóa dung dịch bằng magie
oxit. Hàm lượng nitơ amoniac được định lượng bằng phương pháp kjeldahl.

2.2 Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion
trong thiết bị phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử
dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm.

3 Hóa chất và thuốc thử

Hóa chất và thuốc thử chất lượng PA dùng cho sắc ký

3.1 Nước, sử dụng nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương tự (độ dẫn điện <10 μS).

3.2 Magie oxit (MgO) tinh thể không chứa cacbonat.

3.3 Dung dịch axit clohydric (HCl) chuẩn 0,1N; 0,5N hoặc dung dịch axit sunfuric chuẩn (H2SO4)
0,1N; 0,5N; 1N: pha từ ống chuẩn.

3.4 Dung dịch natri hydroxit (NaOH) chuẩn 0,1N: pha từ ống chuẩn.

3.5 Thymolphtalein (C28H30O4) tinh thể.

3.6 Dung dịch thymolphtalein (C28H30O4) 1%: Hòa tan 1g tinh thể (3.5) với 99mL ethanol 60%.
Lắc đều.

3.7 Fomaldehyt (HCHO) đậm đặc

3.8 Dung dịch Fomaldehyt (formol) trung tính: Hút 50 thể tích dung dịch Fomaldehyt đậm đặc
(3.7) hòa tan với 1 thể tích dung dịch thymolphtalein 1% (3.6), thêm từ từ dung dịch natri hydroxit
0,1N (3.4) cho đến khi dung dịch có màu xanh nhạt.

3.9 Kali clorua (KCl) tinh thể.

3.10 Dung dịch kali clorua (KCl) 1M: Hòa tan 74,5g kali clorua tinh thể (3.9) với khoảng 500mL
nước trong bình định mức dung tích 1000mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

3.11 Nhôm clorua (AlCl 3.6H2O) tinh thể.

3.12 Dung dịch nhôm clorua (AlCl 3) 1M: Hòa tan 240g nhôm clorua tinh thể (3.11) với khoảng
500mL nước trong bình định mức dung tích 1000mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

3.13 Kali hydroxit (KOH) tinh thể.

6
 TCVN ……-2:2018
3.14 Dung dịch kali hydroxit 170g/L: Hòa tan 170g kali hydroxit tinh thể (3.13) với khoảng
500mL nước trong bình định mức dung tích 1000mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

3.15 Axit clohydric (HCl) đậm đặc d= 1,184.

3.16 Dung dịch axit clohydric (HCl) tỷ lệ 1:200: Pha loãng axit clohydric đậm đặc (3.15) với
nước theo tỉ lệ 1: 200 về thể tích.

3.17 Amoni sunfat [(NH4)2SO4] tinh thể.

3.18 Dung dịch amoni sulfat [(NH4)2SO4] 0,5gN/L: Hòa tan 2,3571g amoni sulfat tinh thể (3.17)
(đã sấy ở 100 oC trong 2 giờ, để trong bình hút ẩm) vào cốc 100mL, sau đó chuyển vào bình định
mức 1000mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều. Bảo quản kín ở 20 oC.

3.19 Metyl đỏ (C15H15N3O2) tinh thể

3.20 Dung dịch chỉ thị methyl đỏ (C15H15N3O2) 0,1g/100mL: Hòa tan 0,1g metyl đỏ tinh thể (3.19)
với khoảng 50mL ethanol 95% trong bình định mức dung tích 100mL. Thêm ethanol 95% đến vạch
định mức và lắc đều.

3.21 Thymol blue (C27H30O5S) tinh thể.

3.22 Dung dịch chỉ thị Thymol blue (C27H30O5S) 1g/100mL : Hòa tan 1g thymol blue tinh thể
(3.21) với khoảng 20mL ethanol 95%, trong bình định mức dung tích 100mL. Thêm ethanol 95%
đến vạch định mức và lắc đều.

3.23 Natri hydroxit (NaOH) tinh thể.

3.24 Dung dịch natri hydroxit (NaOH) 400g/L: Hòa tan 400g natri hydroxit tinh thể (3.23) trong
nước và định mức đến 1000mL. Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín.

3.25 Dung dịch natrihydroxit 7,5 M: Hòa tan 300g natrihydroxit tinh thể (3.23) trong nước và
định mức đến 1000mL. Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín.

3.26 Dung dịch natrihydroxit 1M: Hòa tan 40g natrihydroxit tinh thể (3.23) trong nước và định
mức đến 1000mL. Bảo quản dung dịch này trong bình nhựa kín.

3.27 Axit boric (HBO 3) tinh thể.

3.28 Dung dịch axit boric (HBO 3), 5%: Hòa tan 50g axit boric (3.27) với 950mL nước nóng. Lắc
đều, để nguội. Khi sử dụng cứ 50mL axit boric 5% cần cho thêm 10 giọt hỗn hợp chỉ thị màu, sau
đó nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu đỏ tía nhạt (pH khoảng 5).

3.29 Metyl xanh (C37H27N3Na2O9S3) tinh thể.

3.30 Dung dịch chỉ thị màu hỗn hợp: Hòa tan 0,1g metyl đỏ tinh thể (3.19) với khoảng 50mL
rượu etylic 95% và thêm vào 0,05g metyl xanh tinh thể (3.29) trong bình định mức dung tích

7
TCVN ………….-2:2018
100mL, lắc cho tan hết. Thêm rượu etylic đến vạch định mức và lắc đều. Bảo quản ở 20oC trong lọ
màu nâu.

3.31 Thiodiglycol (C4H10O2S) độ tinh khiết >99%.

3.32 Axit 5-sulfosalicylic (C7H6O6S) tinh thể.

3.33 Natri citrat (Na3C6H5O7) tinh thể.

3.34 Natri clorua (NaCl) tinh thể.

3.35 Dầu nhẹ, nhiệt độ sôi từ 40 0C đến 60 0C.

3.36 NorLeucin, hay bất kỳ chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn.

3.37 Khí nitơ 5.0

3.38 Các axit amin

3.38.1 Các chất chuẩn axit amin chỉ ra trong Điều 1.

3.38.2 Axit cysteic.

3.38.3 Methionin sulfon.

GHI CHÚ 1: Sử dụng các hợp chất tinh khiết không chứa nước kết tinh. Làm khô trong chân không có chứa P 2O 5 hoặc
H 2SO4 trong 1 tuần trước khi sử dụng.

3.39 Hỗn hợp chiết (axit clohydric 0,1M chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2mL axit clohydric đậm đặc
(3.4) pha loãng với khoảng 900mL nước. Thêm 20mL thiodiglycol (3.7) và định mức tới 1000mL
bằng nước (3.1).

GHI CHÚ 2: Không trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (3.4) và thiodiglycol (3.7)

3.40 Dung dịch axit sulfosalicylic 6 %: Hòa tan 60g axit sulfosalicylic (3.8) trong nước (3.1) và
định mức đến 1000mL bằng nước (3.1).

3.41 Đệm citrat (Na+: 0,2M) , pH = 2,20.

Hòa tan 19,61g natri citrat (3.9), 5mL thiodiglycol (3.7), 1g phenol (3.6) và 16,50mL axit clohydric
đậm đặc (3.4) trong khoảng 800mL nước (3.1). Điều chỉnh pH tới 2,20. Định mức đến 1000mL
bằng nước (3.1).

3.42 Đệm rửa giải, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

3.43 Thuốc thử ninhydrin, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

3.44 Dung dịch chuẩn của các axit amin

3.45.1 Dung dịch chuẩn gốc axit amin (theo điều 1) có nồng độ là 2,5 μmol/mL trong axit HCl.

Các dung dịch này thường có sẵn trên thị trường.

3.46.2 Dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon, 1,25 μmol/mL.

8
 TCVN ……-2:2018
Hòa tan 0,2115 g axit cysteic (3.16.2) và 0,2265g methionin sulfon (3.16.3) trong đệm citrat (3.24)
vào bình định mức 1000mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat.

GHI CHÚ 4: Các dung dịch chuẩn được bảo quản dưới 5 OC không quá 12 tháng. Dung dịch này không nên dùng nếu
dung dịch chuẩn gốc (3.26.1) có chứa axit cysteic và methionin sulfon.

3.46.3 Dung dịch chuẩn gốc và chất nội chuẩn, ví dụ như norleucin 20 μmol/mL.

Hòa tan 0,6560g norleucin (3.14) trong đệm citrat (3.24) vào bình định mức 250mL và định mức
đến vạch bằng đệm citrat. Bảo quản dưới 5 OC không quá 6 tháng.

3.46.4 Dung dịch chuẩn làm việc của các chất chuẩn axit amin, sử dụng cho các dịch thủy
phân, axit cysteic và methionin sulfon có nồng độ 0,1μmol/mL và các axit amin khác là
0,2μmol/mL.

Hòa tan 2,2 g natri clorua (3.10) trong cốc 100mL với 30mL đệm citrat (3.24). Thêm 4,00 mL dung
dịch chuẩn gốc axit amin (3.27.1), 4,00 ml dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon
(3.27.2), và 0,50mL chuẩn gốc của dung dịch nội chuẩn (3.27.3) nếu cần sử dụng. Điều chỉnh pH
tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1M (3.18). Chuyển định lượng vào bình định mức 50mL và
định mức bằng đệm citrat (3.24), trộn đều. Bảo quản dưới 5 oC không quá 3 tháng.

3.46.5 Dung dịch hiệu chuẩn của các chất chuẩn axit amin

Đối với đường chuẩn của các axit amin (điều 1) sử dụng các dịch thủy phân được chuẩn bị theo
5.3.3.2 và sử dụng với các dịch chiết (5.2).

Đối với đường chuẩn axit cysteic và methionin sulfon chuẩn bị dung dịch tương tự 3.27.4 nhưng
không dùng natri clorua. Bảo quản dung dịch này dưới 5 oC không quá 3 tháng.

4 Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và

4.1 Bình cầu đáy tròn, dung tích 100mL hoặc 250mL có sinh hàn hồi lưu.

4.2 Bình thủy tinh bosilicat, dung tích 100mL với nắp bằng cao su/teflon (ví dụ: Duran, Schott)
chịu nhiệt.

4.3 Tủ sấy, có điều khiển nhiệt độ.

4.4 Máy đo pH, đọc được đến ba số thập phân.

4.5 Màng lọc, 0,2 μm.

4.6 Máy ly tâm.

4.7 Máy lắc và mấy khuấy từ.

4.8 Rây 0,25mm.

9
TCVN ………….-2:2018
4.9 Bể điều nhiệt.

4.10 Thiết bị chưng cất Kjeldahl, có dung tích 250mL bao gồm.

4.10.1 Ống sinh hàn.

4.10.2 Bình cất Kjeldahl, dung tích 250mL (Nếu đun trực tiếp sử dụng bình đáy cầu dung tích
1000mL).

4.10.3 Đầu tránh bắn, có đầu vào đầu ra và nối với phễu nhỏ giọt.

4.10.4 Phễu nhỏ giọt có khóa.

4.10.5 Bình hứng, dung tích 250mL (hoặc 500mL).

4.11 Máy phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC có cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột
cho ninhydrin và detector quang.

Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra
khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin. Tốc độ dòng của dung dịch đệm và
ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổn định ± 0,5% trong suốt quá trình chạy
đường chuẩn và phân tích mẫu.

Đối với một số máy phân tích axit amin, quá trình thủy phân có thể được sử dụng mà trong đó
dịch thủy phân có nồng độ natri 0,8M và chứa tất cả lượng axit formic dư từ bước oxy hóa. Một số
máy khác sẽ không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa nồng độ axit
formic quá dư và/hoặc nồng độ ion natri cao. Trong trường hợp này, giảm thể tích axit bằng cách
làm bay hơi tới xấp xỉ 5mL sau khi thủy phân và trước khi điều chỉnh pH. Quá trình bay hơi nên
thực hiện trong điều kiện chân không ở nhiệt độ không vượt quá 40 oC.

5 Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu:

5.1.1 Phân bón dạng rắn: Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015

5.1.2 Phân bón dạng lỏng

- Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử,
mẫu phải được lắc đều.

- Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử,
mẫu phải được trộn đều.

GHI CHÚ 3: Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 oC hoặc đông khô trước
khi nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (3.13) trước khi nghiền.

5.2 Xác định tổng axit amin tự do

10
 TCVN ……-2:2018
Cân khoảng 5 gam mẫu chính xác đến 0,0001g đã được chuẩn bị theo (5.1) vào bình nón và thêm
100,0mL của hỗn hợp dịch chiết (3.39). Lắc đều trong 60 min sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy
từ. Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10,0mL dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ 100mL. Đối
với mẫu dạng lỏng (5.1.2), dùng pipet hút khoảng 5mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến
0,0001g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng
dạng sền sệt;

Thêm 5,0mL dung dịch axit sulfosalicylic 6% (3.22), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục
khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa. Dung
dịch (A) thu được dùng để xác định tổng axit amin tự do.

5.2.1 Xác định hàm lượng nitơ ammoniac

5.2.1.1 Lắp đặt, kiểm tra thiết bị chưng cất Kjeldahl:

Tùy theo thực tế của mỗi thiết bị mà cách lắp đặt có thể khác nhau, nhưng phải tuyệt đối kín trong
suốt quá trình hoạt động, có khả năng điều chỉnh được tốc độ cất và tốc độ ngưng;

Trước khi chưng cất mẫu phải kiểm tra thiết bị Kjeldahl bằng cách chưng cất 50mL dung dịch
amoni sulfat 0,5gN/L (4.23) với kiềm. Chuẩn độ lượng nitơ trong bình hứng hết 17,85mL ± 0,1mL
dung dịch chuẩn độ tiêu chuẩn acid chlohydric 0,1N (4.2) là đạt yêu cầu, nếu ít hơn là do thiết bị
cất bị hở, nếu lớn hơn có thể là do bị bắn kiềm từ bình cất hoặc do thiết bị không sạch, cần khắc
phục và kiểm tra lại.

5.2.1.2 Chưng cất mẫu

Hút 50mL dung dịch A thêm ≥ 2g magie oxit không chứa carbonate (4.1);

Dùng phễu nhỏ giọt, rót từ từ vào bình chưng cất 100ml dung dịch natri hidroxyt 400g/L (4.23)
hoặc 20ml nếu là mẫu không qua thủy phân hoặc phân hủy, giữ lại khoảng 2ml trong phễu;

Dùng buret cho vào bình hứng chứa 50ml dung dịch axit boric 5% (4.25) có chứa sẵn hỗn hợp chỉ
thị (4.27) và 35mL axit sunfuric tiêu chuẩn 0,1N (4.2);

Lắp bình vào bộ chưng cất sao cho đầu ra của ống sinh hàn thấp hơn bề mặt dung dịch axit, nếu
cần cho thêm nước;

Tiến hành chưng cất cho đến khi thu được khoảng 200mL dung dịch ở bình hứng. Ngừng đun,
tháo ống sinh hàn, dùng bình tia tráng rửa ống sinh hàn, nước rửa thu vào bình hứng.

5.2.1.3 Chuẩn độ mẫu

Chuẩn độ lượng axit dư trong bình hứng bằng dung dịch tiêu chuẩn natri hidroxit 0,1N (4.3) đến
khi màu dung dịch chuyển từ xanh tím sang xanh lá cây;

Tiến hành phép thử trắng trong cùng một điều kiện với cùng lượng các loại thuốc thử nhưng
không có mẫu phân tích.

11
TCVN ………….-2:2018
5.2.1.4 Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ - amoniac, được tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức (1):

(1)

Trong đó:

k là hệ số hiệu chuẩn nồng độ dung dịch natri hydroxit 0,1N;

V1 là thể tích dung dịch natri hidroxyt 0,1N dùng để chuẩn độ lượng axit dư trong mẫu phân
tích, tính bằng mililít (mL);

V2 là thể tích dung dịch natri hidroxyt 0,1N dùng để chuẩn độ lượng axit dư trong màu trắng,
tính bằng mililít (mL);

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

0,001401 là khối lượng nitơ tương ứng với 1mL dung dịch axit sunfuric 0,1N.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của hai phép thử được tiến hành song song, sai
lệch cho phép giữa chúng không được vượt quá 0,30% giá trị tuyệt đối.

5.2.2 Xác định hàm lượng nito amin – amoniac (nito formol)

5.2.2.1 Cách tiến hành

Hút 50mL dung dịch A thêm khoảng 400mL dung dịch kali clorua 1M (4.9), lắc đều trong khoảng
30 phút với với tốc độ lắc 30-40 vòng/phút;

Thêm dung dịch nhôm clorua 1M (4.11) (3ml AlCl 3 1M cho mỗi 0,04g P hay 0,1g P 2O5 trong dung
dịch mẫu) và một vài giọt chỉ thị methyl đỏ 0,1g/100mL (4.19);

Thêm ngay lập tức (vừa lắc vừa thêm) dung dịch kali hydroxit 170g/L (4.13) cho đến khi dung dịch
chuyển thành màu vàng nhạt;

Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều và lọc;

Dùng pipet lấy chính xác 20mL dịch sau lọc cho vào cốc dung tích 250mL, thêm n ước đến thể tích
khoảng 50mL, trung hòa dịch lọc bằng dung dịch axit clohydric 1: 200 về thể tích (4.15) cho đến
khi dung dịch có màu hồng nhạt;

Dùng buret cho thêm 20mL dung dịch formol trung tính (4.7) vào rồi khuấy đều, để yên 5 phút;

Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N cho đến khi pH của dung dịch bằng 9,2 (sử dụng
máy đo pH hoặc dùng chỉ thị thymol xanh (4.21) màu của dung dịch sẽ chuyển từ màu xanh lá
sang màu xanh da trời;

12
 TCVN ……-2:2018
Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất và các bước thử nghiệm như trên, thay
dịch mẫu thử bằng 20mL nước cất.

5.2.2.2. Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ - formol, được tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức (2):

(2)

Trong đó:

V1 Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng mililit (mL);

V2 Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng mililit (mL);

m Khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

0,001401 Số gam nitơ tương ứng với 1mL dung dịch NaOH 0,1N ;

500 Thể tích toàn bộ dịch lọc, tính bằng mililit (mL);

20 Thể tích dịch lọc dùng để xác định, tính bằng mililit (mL).

5.2.3 Hàm lượng nitơ - axit amin (N axit amin) tính bằng phần trăm theo công thức (3):

Naxit amin = Nformol – Namoniac (3)

Trong đó:

Namoniac : Hàm lượng nitơ amoniac được tính bằng phần trăm theo công thức (1).

Nformol: Hàm lượng nitơ formol được tính bằng phần trăm theo công thức (2).

5.2.4 Hàm lượng axit amin tổng số tính bằng phần trăm theo công thức (4):

% Axit amin (tổng số) = N axit amin x 6,25 (4)

Chênh lệch giữa hai kết quả xác định song song không lớn hơn 0,5%

5.3 Xác định từng loại axit amin tự do

5.3.1 Chiết mẫu

Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1g đến 5 g) chính xác đến 0,0001g đã được chuẩn bị theo
(5.1) vào bình nón và thêm 100,0mL của hỗn hợp dịch chiết (3.21). Lắc đều trong 60 min sử dụng
máy lắc hoặc máy khuấy từ. Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10,0mL dung dịch phía trên cho
vào cốc có mỏ 100mL.

GHI CHÚ 4: Lượng mẫu cân nên chứa hàm lượng nitơ khoảng 10 mg và hàm lượng nước không vượt quá 100 mg;

Lượng mẫu cân chuẩn bị được tính toán như sau:

13
TCVN ………….-2:2018

Trong đó:

Ns Hàm lượng nitơ trong mẫu thử, tính bằng phần trăm, %

Ws Khối lượng của phần mẫu thử tương đương với hàm lượng nitơ khoảng 10mg, tính bằng miligram, mg.

Thêm 5,0mL dung dịch axit sulfosalicylic 6% (3.22), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục
khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa. Lấy
10,0mL dung dịch vào cốc 100mL, điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1M (3.18).
Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100mL, tráng rửa bằng đệm citrat (3.24) và định
mức đến vạch bằng dung dịch đệm (3.24).

Nếu sử dụng chất nội chuẩn, thêm 1,00mL dung dịch nội chuẩn (3.27.3) cho mỗi 100mL dịch cuối
và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm (3.24).

Chạy sắc ký tiếp theo 5.3

Nếu dịch chiết không được sử dụng cùng ngày thì phải bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 oC.

5.3.2 Chạy sắc ký

Trước khi thực hiện chạy sắc ký, đưa dịch chiết (5.2) về nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp và lọc
một lượng phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2 μm. Đưa dịch lọc sạch vào cột trao đổi ion, sử dụng máy
phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC.

Bơm mẫu có thể thực hiện bằng tay hoặc tự động. Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng
một lượng dung dịch chất chuẩn và mẫu thử không sai khác quá 0,5% trừ khi chất nội chuẩn được
sử dụng, tỷ lệ giữa lượng natri:axit amin trong chất chuẩn và dung dịch mẫu là tương tự nhau thì
mới có thể thực hiện được.

Nói chung, tần suất chạy dung dịch chuẩn phụ thuộc độ ổn định của thuốc thử ninhydrin và hệ
thống phân tích. Pha loãng chất chuẩn hoặc mẫu với dung dịch đệm citrat (3.23) để có được diện
tích pic của chất chuẩn vào khoảng 30% đến 200% điện tích pic mẫu axit amin.

Sắc ký đồ của axit amin sẽ thay đổi một ít tùy theo máy phân tích và chất nhồi cột được sử dụng.
Hệ thống phân tích được chọn phải có khả năng tách được các axit amin ra khỏi nhau và ra khỏi
các chất dương tính với ninhydrin. Trong phạm vi hoạt động, hệ thống sắc ký phải đáp ứng tuyến
tính với các thay đổi về lượng axit amin đưa vào cột.

Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số giữa chiều cao lõm : pic đề cập ở dưới đây được áp dụng
khi dung dịch có cùng nồng độ mol (của các axit đang xác định) được phân tích. Dung dịch axit
amin cùng nồng độ mol này chứa ít nhất 30 % của lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà
có thể đo được chính xác với hệ thống máy phân tích axit amin (4.9).

14
 TCVN ……-2:2018
Để tách threonin và serin, tỷ số giữa chiều cao lõm : pic của pic thấp hơn trong hai axit amin
chồng lên nhau trong sắc ký đồ không vượt quá 2:10 (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được xác
định, sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo). Đối với tất cả các axit
amin tỷ số tách tốt hơn nên là 1:10.

Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được tách khỏi "lysin nhân tạo" và ornithin.

5.3.3 Biểu thị kết quả

Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam
axit amin /kilogam mẫu, được tính theo công thức (5):

w= (5)

Nếu chất nội chuẩn được sử dụng, thì nhân với

Trong đó

Ae là diện tích pic của chất thủy phân hoặc chất chiết;

Ac là diện tích pic của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn;

Aie là diện tích pic của chất nội chuẩn trong thủy phân hoặc chiết;

Aic là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn;

M là khối lượng phân tử của axit amin được xác định;

C là nồng độ của chất chuẩn, μmol/mL;

m là khối lượng mẫu, tính bằng g (tính về khối lượng ban đầu nếu mẫu được làm khô hoặc
loại chất béo);

Ve là thể tích của tổng dịch thủy phân (5.3.4), tính bằng mililit, được tính theo tổng thể tích
pha loãng của dịch chiết được tính bằng mililit.

Cả cystin và cystein được xác định giống như axit cysteic trong thủy phân mẫu đã oxy hóa, nhưng
được tính theo tổng của cystein và cystin sử dụng M = 120,15g (= 0,5 x 240,30) (C 6H12N2O4S2,
M=240,30g).

Methionin được xác định như methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính
toán bằng cách sử dụng M của methionin = 149,21g.

Methionin tự do thêm vào được xác định sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử
dụng cùng chung M.

15
TCVN ………….-2:2018
Tổng thể tích dịch chiết pha loãng (Ve) dùng để xác định các axit amin tự do (5.2) được tính theo
công thức sau:

Ve = 100 x

Trong đó

Vef là thể tích chiết cuối cùng, tính bằng mililit.

Các kết quả có thể tính theo %: kết quả tính theo % = 0,1 x kết quả tính theo gam trên kilogam.

6 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có
thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm.

7 Một số lưu ý trong phương pháp

7.1 Do việc sử dụng các thiết bị phân tích axit amin khác nhau, nên các nồng độ cuối của các axit
amin (mục 3.27.4 và 3.27.5) và của dịch thủy phân (5.3.4) nên thực hiện theo trong hướng dẫn.
Khoảng đáp ứng tuyến tính của thiết bị phân tích nên được kiểm tra áp dụng cho tất cả các axit
amin.

7.2 Khi thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để phân tích các dung dịch thủy phân,
các điều kiện thí nghiệm nên được tối ưu hóa phù hợp với các yêu cầu của nhà cung cấp thiết bị.

7.3 Với việc sử dụng phương pháp để phân tích các mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa hơn 1%
hàm lượng clo (thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung khoáng, thức ăn bổ sung…) thì việc ước lượng
thiếu hàm lượng methionin có thể xảy ra và cần có phương pháp xử lý đặc biệt theo cách dưới
đây (phương pháp Slump). Sau khi thêm 5mL hỗn hợp chất oxi hóa ở 5.3.1, thêm tiếp 12,5mL
nước và khuấy đều mẫu trên máy khuấy từ trong 15min. Sau đó lại tiếp tục thực hiện quy trình
thông thường. Quy trình này không dùng để định lượng xác định hàm lượng tổng số của cystein
và cystin.

16
 TCVN ……-2:2018
TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 8764:2012 (ISO 13903:2005), Thức ăn chăn nuôi – Phương pháp xác định axit amin;

[2] AOAC 994.12, Amino Acids in Feeds;

[3] AOAC 999.13, Lysine, methionine, and threonine in feed grade amino acids and premixes.

[4] AOAC 920.03 determining formaldehyde titration method subtracting by ammoniacal nitrogen.
(magnesium oxide method).

[5] AOAC 920.04 Nitrogen (Ammoniacal) in Fertilizers Formaldehyde;

[6] REP 12/MAS : report of the thirty session of the codex committee on methods of analysis and
sampling – budapest, hungary, 5-9 march 2012.

__________________________

17