TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

TÊN SV: Trần Chí Kiên MSSV: 61800954 MS NHÓM: S4N8

Hồ Bảo Trâm 61801010 S4N8

Lê Hải Đăng 61800491 S4N8

Bài số: 4 + 8 Điểm:
Tên bài:
Định tính và định lượng nitơ acid amin
Định lượng Vitamin C và khảo sát các
enzyme hô hấp
Ngày TN: 4/9/2019

BÀI 4
A.Dụng cụ-Hóa chất

I. Dụng cụ:

Ống nghiệm 2 Buret 25mL 1 Bình định mức 100mL 1

Giá ống nghiệm 1 Pipep vạch 1mL 1 Ống đong 10mL 1

Đèn cồn + Quẹt ga 1 Pipett bầu 5mL 1 Becher 100mL 2

Cốc 100mL 3 Pipett bầu 10mL 1

Erlen 100mL 3 Bóp cao su+đầu tip 1

II. Hóa chất:

Dd protein trứng NaOH 0.005N Phenolphtalein 0.5 %

Dd ninhydrin 0.1% Bromthymol Blue Nước mắm/nước tương

Dd formol (formalin) Đệm pH 7 và pH 9.2 HCl hay H2SO4 0.05N

B, Thực hành

I. Định tính acid amin bằng ninhydrin

1. Nguyên tắc:

Khi phản ứng với ninhydrin ở nhiệt độ cao các acid amin bị dezamin hóa, oxy hóa
nhóm COOH tạo thành NH3 và aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo thành
diceto oxyhydriden.

Sau đó diceto oxyhydrien, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử
ninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu.

Phức có màu xanh tím

 2. Tiến hành

Ống Protein Gia

Ninhydrin Kết quả
nghiệm trứng nhiệt

Đun
1 1 mL 1 mL
nhẹ

Không
2 1 mL 1 mL
đun

Ống nghiệm 1: xuất hiện phức màu

xanh tím vì các acid amin trong
protein bị dezamin hóa khi tác dụng
với ninhydrin ở nhiệt độ cao, oxy
hóa

Ống nghiệm 2: không xảy ra hiện

tượng
II. Định lượng nitơ acid amin theo phương pháp SORENSEN
1. Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của formaldehyde (formol) các nhóm amin bị methylene hóa tạo
thành các dẫn xuất methylene của các acid amin. (Còn gọi là phương pháp chuẩn
độ formol).

Các hợp chất tạo thành là những acid mạnh hơn các acid amin tự do, dễ dàng định
phân bằng kiềm qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của các acid amin có
trong nguyên liệu.

Khi dùng phương pháp này cần chú ý những điểm sau:

 Để cho phản ứng tạo dẫn xuất methylene tiến hành hoàn toàn, cần có dư một
ít dung dịch formaldehyde và phản ứng trung hòa hoàn toàn các nhóm
cacboxyl được thực hiện khi pH môi trường đạt tới 9,2 – 9,5.
 Arginin không phản ứng với formaldehyde cho nên không tính khi chuẩn
bằng kiềm.
 Tirozin cho kết quả cao hơn vì ngoài nhóm cacboxyl, nhóm phenol cũng có
tác dụng với kiềm. Một số acid amin cho kết quả ít hơn như prolin.
 Nếu trong dung dịch có chứa nhiều NH3, nhất là trong các dịch thủy phân
protein thì phải loại bỏ NH3 trước trong chân không ở nhiệt độ 40°C.
 Các muối amon như NH4Cl, (NH4)2SO4 cũng tác dụng với formaldehyde
tạo thành hexamethylene tetramin và acid. Acid này sau đó được trung hòa
bởi kiềm:
 Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu màu đậm thì
rất khó nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ.
 Dùng phương pháp này thì kết quả chỉ thật đúng với trường hợp acid
monoamino monocacboxylic. Để kết quả đúng hơn với mọi trường hợp (khi
trong dung dịch ngoài các acid monoamino monocacboxylic ra còn có chứa
các acid monoamino dicacboxylic và diamino monocacboxylic) cần phải
trung hòa dung dịch đến pH 7 trước khi phân tích.
 Để xác định điểm bắt đầu (pH 7) và điểm kết thúc (pH 9,2), người ta dùng
phương pháp so màu. Tạo ra hai thang màu chuẩn ở pH 7 và pH 9,2 rồi đưa
pH của mẫu về 7( so sánh màu với màu chuẩn pH 7) sau đó định phân đến
pH 9,2 (so sánh màu với màu với pH 9,2).

2. Tiến hành:

Lấy 2 bình nón có dung tích như nhau.

Cho vào bình thứ nhất: 20mL dung dịch có pH 7 và 5 giọt Bromthymol Blue
0.04%. Cho vào bình thứ hai: 20mL dung dịch có pH 9,2; 5 giọt Bromthymol
Blue 0.04% và 3 giọt phenolphtalein 0.5%.

Bình 1 Bình 2
Xác định lượng nitơ amin trong nước mắm. Nước mắm là một dung dịch thủy
phân protein có thể định lượng bằng phương pháp chuẩn độ formol.

Lấy 1mL nước mắm vào bình định mức, dùng nước cất định mức thành 100
mL, lắc đều.

Lấy vào bình nón (có cùng dung tích với hai bình màu chuẩn) 20mL dịch mẫu
pha loãng từ bình định mức, thêm 5 giọt Bromthymol Blue. Nếu dung dịch có
màu xanh dương thì thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0.05N, nếu dung dịch có
màu vàng thì thêm từng giọt NaOH 0.05N cho đến khi dung dịch có màu ứng
với màu của bình 1 có pH 7,0.

Dung dịch có màu vàng thì thêm từng giọt NaOH 0.05N cho đến khi dung dịch có
màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0.

Thêm 3 giọt phenolphtalein 0.5%.; 5 mL formol trung tính (bằng ống đong) rồi
chuẩn độ bằng NaOH 0.05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của
bình 1 có pH 9,2.
 Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu
bằng nước cất.

Chuẩn độ NaOH Trung bình

Lần 1 Lần 2
bằng

Nước mắm 2.4 ml 1.8 ml 2.1 ml

Nước cất 0.1 ml 0.1 ml

Tính kết quả:

( a−b )∗T∗0.0014∗Vdm∗1000 ( 2.1−0 .1 )∗1∗0.0014∗100∗1000
X= = =14 (g/L)
20∗V 20∗1

Trong đó:

X: lượng gam Nitơ acid amin có trong 1L nước mắm.

a: số mL NaOH 0.1N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm.

b: số mL NaOH 0.1N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng.

 T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ
chuẩn. (1)

Vdm: thể tích bình định mức. (100ml)

V: số mL nước mắm cho vào bình định mức. (1ml)

0,0014: số gam Nitơ ứng với 1mL NaOH 0.1N

BÀI 8
A. Dụng cụ - Hóa chất
I. Dụng cụ

Ống nghiệm 6 Buret 25mL 1 Cối + chày sứ 1

Pipett bầu 10mL 1 Cốc 50Ml 3 Dao + thớt

Pipett vạch 2mL 1 Phễu thủy tinh 1 Cân

Pipett vạch 1mL 1 Bóp cao su + đầu tip 1 Giấy lọc

Erlen 100mL 3 Bình định mức 50mL 1 Vải mùng

II. Hóa chất

Dung dịch HCl 1% Xanh methylene 0,01% Củ cải tươi

Dung dịch KIO3/KI 0.01N H2O2 1% Khoai tây

Dung dịch hồ tinh bột 1% Dầu lửa

B. Thực hành
I. Định lượng Vitamin C
1. Nguyên tắc:

Acid ascorbic (vitamin C) là một hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol. Acid
ascorbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong
môi trường acid. Phương pháp dựa trên nguyên tắc acid ascorbic có khả năng
oxy hóa thuận nghịch nhờ trong phân tử của nó có nhóm endiol –
C(OH)=(OH)C- . Ta xác định acid ascorbic bằng phương pháp chuẩn độ
KIO3/KI theo các phản ứng sau:

KIO3 + 5KI +6HCl → 3I2 + 6KCl + 3H2O

Lượng iod tạo ra ở phương trình (1) sẽ oxy hóa acid ascorbic thành acid
dehydroascorbic, phương trình (2). Khi hết acid ascorbic, Iod thừa sẽ làm chỉ
thị hồ tinh bột hóa xanh.

2. Thực hiện

- Hút 10mL dịch chứa vitamin C từ bình định vào erlen 100mL, thêm vào vài
giọt hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng KIO3/KI 0,01N cho đến khi xuất hiện
màu xanh. Định phân 2 lần, kết quả định phân không sai lệch quá 0,03mL)

- Tiến hành song song các mẫu kiểm chứng, thay dịch chứa vitamin C bằng
dung dịch HCl 1%..

Định phân KIO3/KI bằng Vitamin C

 Định phân bằng Lần 1 Lần 2 Trung bình
KIO3/KI

Vitamin C 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml

HCl 1% 0.1 ml 0.1 ml

Định phân KIO3/KI bằng HCl 1%

TÍNH TOÁN:
( a−b )∗0.88∗100∗Vdm ( 0.3−0.1 )∗0.88∗100∗50
X= = = 8.8 (mg/100g)
10∗V (hay m) 10∗10

Trong đó: x là hàm lượng vitamin C (mg/100mL) hoặc (mg/100g)

a là số mL KIO3/KI 0,01N dùng chuẩn độ mẫu chứa vitamin C (0.3 ml)

b là số mL KIO3/KI 0,01N dùng chuẩn đọ mẫu kiểm chứng. (0.1 ml)

0,88 là số mg acid ascorbic ứng với 1mL dung dịch KIO3/KI 0,01N

Vdm là thể tích bình định mức (50ml)

V hay m là thể tích hoặc khối lượng mẫu ban đầu. (10g)
 II. Các enzyme hô hấp
1. Dehydrogenase
1.1 Nguyên tắc:

Dehydrogenase là nhóm các enzyme oxi hóa khử xúc tác cho phản ứng tách H trực
tiếp từ cơ chất ở giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp. Có vai trò quan trọng trong quá
trình sinh tổng hợp.

1.2 Tiến hành:

- Cho vào ống nghiệm vài lát củ cải đã cắt mỏng cỡ 2x2x1mm (dài x rộng x dày)

- Thêm dung dịch xanh Methylene 0,01% ngập củ cải 1 cm

- Đổ lên trên một lớp dầu lửa

- Đặt ống nghiệm vào nước ấm 40°C trong 30

phút.

- Làm ống kiểm chứng không chứa củ cải

Ống nghiệm 1: màu của dung dịch không đổi

sau khi bỏ vào nước ấm 40oC

Ống nghiệm 2: dung dịch xanh methylene nhạt

dần do enzym dehydrogenase làm xảy ra chức
năng vận chuyển H từ củ cải.
 2. Catalase
2.1 Nguyên tắc:

Catalase là loại enzyme Hemoproteit. Ở tế bào thực vật catalase chứa một nhóm
Hem. Khi enzyme xúc tác Fe nhóm ngoại không thay đổi hóa trị.

2.2 Tiến hành: cần theo tác thực hiện nhanh

- Nghiền kỹ 10 g khoai tây

- Thêm 10mL nước cất nghiền đều → Lọc

vào ống nghiệm

- Hút 0,5 mL dịch lọc cho vào một ống

nghiệm đã có chứa 2 mL H2O2 1% lắc nhẹ.

Hiện tượng: có hiện tượng sủi bọt khí

Giải thích: do emzyme catalase phân hủy H2O2 thành nước và oxi.