Họ Tên: Phạm Thị Thu Uyên

Mssv: 20211571
Mã lớp: 728604
Giảng viên hướng dẫn: Cô Phùng Thị Thủy và cô Lê Thị Lan Chi

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 2: Xác định hàm lượng Protein hòa tan bằng phương pháp Lowry
I. Nguyên tắc của phương pháp:

1. Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử folin. Cường độ màu
của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được
mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo đường chuẩn của
protein tinh khiết với thuốc thử này, có thể dễ dàng tính được lượng protein của mẫu vật nghiên
cứu

2. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry gồm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Phản ứng biure: đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit (CO-NH-). Trong môi
trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo
thành phức chất màu xanh tím. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptit
Protein (có từ 2 liên kết peptit trở lên) R-COO-NH-R + Cu2+ => phức ( Cu+ - Protein )
Điều kiện: có OH-
 Giai đoạn 2: Phản ứng với thuốc thử folin: thuốc thử folin có chứa
axitphosphomolipdic và axit photpho vonframic. Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy của
phản ứng biure, một mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các axit amin
này tham gia trong quá trình tạo phức chất có màu xanh da trời, hấp thụ cực đại bước sóng ở 750
nm.
Cu+ - Protein (aa vòng ) + Folin -----> Cu2+ (màu xanh đậm, hấp thụ a/s Lamda=750nm)
(Tyrosin, Triptophan) (W+6 /Mo+6 ) (Wx /Moy ); (x,y <6)

Điều kiện: OH- , pH 9-10,5

 Đường chuẩn - Đo mật độ quang OD
 Định luật Lambert - Beer:
A= OD= log( I0/I ) = ɛ.L.C
+ Trong đó:
C: nồng độ chất hấp thụ ánh sang (mg/ml , mmol/ml)
L: chiều dày lớp dung dịch
ɛ : hệ số hấp phụ phân tử đặc trưng cho từng loại chất.
+ Từ đó ta có: OD= ɛ.L.C= k.C (k=ɛ.L= const).
OD = f(C) => quan hệ tuyến tính => xác định được lượng protein thông qua C.
II. Tiến hành thí nghiệm:

Các hóa chất cần dùng gồm:

 Thuốc thử Folin: Hòa tan 100 g Na2WO4.H2O và 25 g Na2MoO4.2H2O vào 800 ml nước cất.
Thêm 50ml H3PO4 80% và 100ml axit clohydric đậm đặc. Đun sôi hỗn hợptrong bình cầu đáy
tròn dung tích 2000ml với ống sinh hàn ngược trong vòng 10giờ. Có thể đun ngắt quãng, không
cần phải đun liên tục, nhưng phải đun sôi đủ 10 giờ. Sau khi đun sôi xong, thêm vào hỗn hợp 105
gam lithium sunfat, 50ml nước cất và 5 giọt nước brom. Đun sôi 15 phút không có ống sinh hàn
ngược đểloại trừ lượng brom dư. Dung dịch thuốc thử phẩm có màu vàng (đang ở dạng khử),
không được có màu xanh. Nếu thuốc thử có màu xanh phải xử lý brom lần thứ hai. Sau khi
làmnguội dung dịch, thêm nước cất cho đến vạch mực trong bình định mức dungtích 1 lít. Lọc
qua ống Allin có chứa bông thủy tinh
 Dung dịch A: dung dịch Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1N
 Dung dịch B: dung dịch CuSO4.5H2O ( 0,5% pha trong dung dịch natri citrat 1% hoặc pha trong
dung dịch kali-natri tartrat 1% ). Dung dịch pha trong natri citrat sẽ bền hơn pha trong kali-natri
tartra)
 Dung dịch C: hỗn hợp của hai dung dịch A và B pha theo tỷ lệ 50:1 trước khi dùng

Phần 1: Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp Lowry

1. Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA): 1 mg/ml (PTN pha sẵn)
- Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm sạch gồm 6 ống rồi thực hiện các bước dưới đây:
2. Tiến hành
2.1 Pha dãy dung dịch BSA với các nồng độ Ci cho đường chuẩn (dãy ống 1):

- Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương đương như bảng sau tạo dãy ống nghiệm có
nồng độ BSA (Ci)

Ống falcon 15ml/ống nghiệm ngắn 1 2 3 4 5 6

Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,1 0.2 0,3 0,4 0,5

Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Nồng độ BSA Ci (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci
2.2 Thực hiện phản ứng:

- Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau vào dãy ống 1 ở trên tạo dãy
ống có cường độ màu khác nhau tùy thuộc nồng độ BSA Ci khác nhau:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 5

Trộn đều để yên 10 phút

Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Trộn đều bằng vortex, để yên 20 – 30 phút

OD750nm 0,000 0,078 0,124 0,161 0,212 0,297

2.3 Vẽ đồ thị đường chuẩn albumin như sau:

Phần 2: Phân tích mẫu

- Mẫu thí nghiệm: 0.3g mẫu đậu phụ

1. Chuẩn bị dịch protein phân tích
- Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml dd NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100ml
- Cân khoảng 0,3 g mẫu (ghi lượng mẫu chính xác cân được); chuyển mẫu vào cối, cho một ít
dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm
- Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml.
- Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại
- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút
- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm dịch
lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn).
- Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn đều.
- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.

2. Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ

 Mẫu thí nghiệm:
- Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):
0,3 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)
3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng micropipet)
- Trộn đều. Để yên 10 phút.
- Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy voltex)
- Để phản ứng 20 – 30 phút.
 Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm):
- Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):
0,3 ml H2O (dùng micropipet) vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvv
3 ml dung dịch C (dùng micropipet)
- Trộn đều. Để yên 10 phút.
- Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn voltex)
- Để phản ứng 20 – 30 phút.
( Note: mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm làm song song nhau)
 Đo độ hấp thụ ánh sáng
- Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN, SV chỉ sử dụng thiết bị khi đã được thầy cô
hướng dẫn.
- Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750nm, với dung dịch
đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.
- Sử dụng đường chuẩn protein để tính hàm lượng protein của dung dịch nghiên cứu.

III. Tính toán kết quả thí nghiệm, nhận xét về kết quả thí nghiệm
 1. Lượng mẫu thực phẩm lấy được: 0,3g
2. Kết quả đo OD
- Mẫu kiểm chứng: 0,000
- Mẫu thí nghiệm: y=0,124

3. Theo đường chuẩn Albumin, phương trình protein: y = 0,2749x + 0,0079

- Mà y = 0,124 suy ra x = 0,422 (mg/ml)
 Trong 1ml dịch thì có 0,422 mg protein
 Trong 100ml dịch thì có 42,2 mg protein = 0,0422g protein
0,0422
 Hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm là: % protein = x 100% = 14,07%
0,3
 Nhận xét: Kết quả có thể có sai số do một số nguyên nhân sau:
- Các ống nghiệm được sử dụng có thể chưa sạch hoàn toàn hóa chất của các lần sử dụng trước.
Việc trung hòa dung dịch cũng có thể gây sai số.

- Việc sử dụng pipet có thể sảy ra sai sót do: chưa thành thạo việc sử dụng hút và nhả dung dịch thể tích
lấy ra không chuẩn xác. Đầu pipet vào quá sâu, đầu côn có thể dịch các hóa chất gây sai lệch, cần thay
đầu côn mới sau khi hút từng loại hóa chất và hạn chế cho pipet vào quá sâu.

- Khi đo trong máy đo quang, nếu để cuvet không đúng chiều ánh sáng đi qua, đổ tràn dung dịch, dùng
tay cầm vào 2 mặt trong của cuvet mà không dùng giấy lau sạch 2 mặt trong sẽ ảnh hưởng đến đường
truyền của ánh sáng dẫn đến sai số.

IV. Chú ý khi thí nghiệm để đạt kết quá chính xác nhất có thể
1. Chuẩn bị dịch phân tích
- Dùng NaOH để nghiền mẫu, chiết vi NaOH giúp phá vỡ cấu trúc màng tế bào để protein chui ra
bên ngoài, do tế bào có màng lipid tác dụng với NaOH. NaOH là dung dịch kiềm nhẹ nên làm
protein phân ly tốt hơn, khả năng hòa tan và đẩy tốt hơn.
- Nghiền nhuyễn mẫu.
- Đun cách thủy ổn định không quá cao trong 15 phút để tránh biến tính protein vì nhiệt độ quá
cao, protein bị biến tính. Còn nhiệt độ thấp dẫn tới hiệu suất không cao.
- Sau khi chiết protein xong phải trung hòa dung dịch bằng HCl loãng đến pH=7 vì phản ứng
biure diễn ra mạnh trong môi trường kiềm pH = 9 – 10,5, phụ thuộc vào pH nên phải đưa môi
trường dung dịch về pH=7 để ko làm ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng biure.
- Dùng giấy pH làm chỉ thị kiểm tra môi trường trong dung dịch chứ không dùng
phenolphthalein vì phenolphthalein sẽ làm ảnh hưởng đến màu sắc của dung dịch sau phản ứng
biure do sau phản ứng dung dịch sẽ có màu xanh lam, dùng phenolphtalein dung dịch có màu
hồng do môi trường kiềm, ảnh hưởng đến cường độ màu → mật độ quang đo được sẽ bị ảnh
hưởng.
- Khi dung giấy pH để kiểm tra phải dung đũa thủy tinh chấm dung dịch, chứ không thả giấy vào
dung dịch để tránh giấy tan vào dung dịch, hóa chất trong giấy khuếch tán ra dung dịch ảnh
hưởng đến kết quả đo.
- Khi chuyển mẫu sang bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn đều. ( lắc
đều khoảng 20 lần trước khi cho vào lọc để mẫu lấy ra chuẩn và nhiều protein)
- Lọc trng và thu dịch lọc protein phân tích.
2. Làm phản ứng màu:
 - Dung dịch A: Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1 N => Cung cấp môi trường kiềm. Na2CO3 dùng
làm dung dịch đệm duy trì pH
- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch natrixitrat 1% bền vững hơn trong Kali-
natrixitrat 1%
- Dung dịch C: hỗn hợp A/B = 50/1
3. Đo độ hấp phụ:
- Mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng phải được tiến hành trong cùng điều kiện, dùng cùng một
máy đo quang, đo cùng lúc.
- Dung dịch phải trong (vì nếu đục sẽ có hạt lơ lửng => ánh sáng gặp hạt sẽ bị phản xạ, tán xạ =>
sai số) Vì vậy phải lọc.
- Ánh sáng phải đơn sắc
- Khi dùng cuvet phải cầm vào phần đục, trước khi cho vào máy phải lau.

V. Phạm vi áp dụng của phương pháp

- Phương pháp Lowry chỉ sử dụng để phân tích mẫu có chưa hàm lượng protein thấp có axit amin
mạch vòng và là protein hòa tan.
- Phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch. Nếu trong mẫu
có các thành phần khác như K+, Mg2+, NH4+, EDTA, Tris-HCl, cacbohydrate và tác nhân khử có
gây ảnh hưởng đến kết quả. Ngoài ra một khi đã nhuộm, mẫu protein không thể được sử dụng
cho các phương pháp xét nghiệm khác.

Cường độ màu của pư cũng phụ thuộc nhiều vào loại protein, độ pH, tùy loại máy đo

Phương pháp có độ nhạy cao: 0,1-5mg/ml (Biuret) và 10µmg/ml (Phương pháp Lowry)

Phát hiện và định lượng được protein hoà tan