BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Họ và tên sinh viên thực hiện: Trần Phương Thảo

Mã số sinh viên: 20190383

BÀI 1: SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

I.CƠ SỞ LÝ THUYẾT
-Sắc ký trao đổi ion là kỹ thuật tách các cấu tử anion hay cation từ hỗn
hợp sắc ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha
động
-Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các
ion linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi
cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh
II. TIẾN HÀNH
Hoá chất và dụng cụ:
- Dung dịch Trilon B 0,1N: TrilonB có trọng lượng phân tử bằng 372,
254g (C10N2H14O8Na2.2H2O), đương lượng gam là 186,127.
- Dung dịch đệm amôniăc: 2g NH4Cl và 8,8ml dung dịch amôniăc 25%,
1lít nước.
- Dung dịch chỉ thị eriocrôm đen: 0,5g trong cồn 960, thêm 10ml dung
dịch đệm rồi định mức đến 100ml bằng cồn.
- Dung dịch HCl 5%
- NaOH 0,1 N
- Chỉ thị methyl da cam
- Nhựa trao đổi ion loại cationit
- Cột sắc ký
- Buret 25ml, bình tam giác 250 ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, pipet
5 ml, 10 ml.

Nội dung 1. Xác định dung lượng trao đổi ion

· Cân 5 gam nhựa cationit vào cốc 250 ml.
· Thêm 100 ml dung dịch CaCl2 1% (m/v).
· Để trong 30 phút để phản ứng trao đổi diễn ra.
· Dùng NaOH 0,1 N để chuẩn độ lượng H+ tạo thành với chỉ thị metyl
da cam. Chú ý: chỉ lấy 10 mL dung dịch và pha loãng trong 40 mL nước
cất để mang đi chuẩn độ
· Tính dung lượng trao đổi ion (mmol/g nhựa)
D= 0,1 x V (mmol/g)
Trong đó:
V- thể tích dung dịch NaOH 0,1 N tiêu hao để chuẩn độ lượng H+ tạo
thành trong 100 ml dung dịch đã được trao đổi bởi 1 g nhựa
Kết quả
V1= 1,4ml
V2= 1,2ml
Vtrung bình = 1,3ml
Tính được dung lượng trao đổi: D= 0,1 x 1,3= 0,13

Nội dung 2. Sắc ký trao đổi ion

1. Chuẩn bị nhựa và nhồi cột
· Cân 20-40g nhựa (tùy độ lớn cột) cho vào 1 cốc thủy tinh 250 ml
· Rửa sạch bằng nước cất nhiều lần (dùng 500 ml nước làm 5 lần).
· Lần cuối ngâm trong 30 phút
· Đổ vào cột dưới dạng huyền phù. Khi đổ cột, đóng van đáy.
2. Tiến hành sắc ký
· Pha 250 mL dung dịch CaCl2 22,2 g/l.
· Đổ khoảng 50 mL dung dịch CaCl2 22,2 g/l vào cột sắc ký đã chuẩn
bị, điều chỉnh van đáy để có tốc độ đầu ra ổn định. Khi dung dịch gần
chảy hết thì bổ sung thêm dung dịch mới vào cột.
· Thu các phân đoạn đầu ra, mỗi phân đoạn 50 mL
· Phân tích hàm lượng canxi trong mỗi phân đoạn bằng phương pháp
TrilonB
3. Phân tích hàm lượng Ca2+ bằng trilonB
Cở sở của phương pháp
Trilon B kết hợp với ion Ca++ / Mg++ tạo thành liên kết bền vững. Chất
chỉ thị eriocrôm đen kết hợp với Ca++ / Mg++ tạo thành hợp chất có
màu đỏ như rượu nho. Khi trilon kết hợp hoàn toàn với Ca++ / Mg++,
màu của dung dịch sẽ biến thành xanh da trời.
Cách tiến hành:
· Lấy 100ml dung dịch đã pha loãng (10 đến 100 lần) vào trong bình tam
giác 250 mL,
· Thêm 5ml dung dịch đệm
· Thêm 5 giọt chỉ thị Eriocrôm đen
· Dùng dung dịch trilon B 0,1N để định phân cho đến khi xuất hiện màu
xanh da trời
· Hàm lượng Ca++ trong mẫu phân tích được tính theo công thức:
C= 2 * V * d * 10 (mg/ l)
Trong đó:
V- thể tích dung dịch trilon B 0,1 N tiêu tốn cho phản ứng
2 mg Ca –tương đương với 1 ml dung dịch trilon B 0,1 N, tương đương
0,1 mg đương lượng.
d-hệ số pha loãng
10- hệ số chuyển đổi 100 ml thành 1000 ml
Tốc độ chảy hết Thể tích trilon B Hàm lượng
50ml (s) (ml) Ca2+
(mg/l)
Bình 1 15,52 0,2 40
Bình 2 22 2,5 500
Bình 3 38,22 4,4 880
Bình 4 40,21 4,6 960
Bình 5 39,39 4,4 880

4. Tái sinh cột

Dùng dung dịch HCl 5% để rửa nhựa. Ngâm trong 30 phút và dùng nước
cất để rửa lại 3-4 lần. Nhựa để khô chuẩn bị dùng cho lần sau.
 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ VÀ ĐO PH

A.Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

1. Cơ sở lý thuyết
-Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp phân tích định lượng dựa
vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi khi phân tử từ vật chất tương tác với bức xạ điện
từ. Vùng bức xạ dùng trong phương pháp là vùng tử ngoại gần hay vùng tử ngoại
khả kiến ứng với bước sóng từ 200-800nm
-Phương pháp tuân theo định luật Lambert-Beer
Io
A= log I = Ɛ.l.C

Trong đó Io: Cường độ nguồn sáng tới

I: Cường độ nguồn sáng truyền qua
A: Độ hấp phụ
C: Nồng độ dung dịch chất phân tích
2. Tiến hành
-Chuẩn bị các dung dịch cần đo (Dung dịch CuSO4 0,15M, dung dịch Hibicus)
-Bật máy quang phổ kế trước 15 phút để ổn định
-Chọn bước sóng cần đo
-Đặt giá trị A=0 cho cuvet dung dịch đối chứng
- Đặt cuvet mẫu và đọc số liệu, ghi kết quả tương ứng A- bước sóng hấp phụ
- Đo mẫu với các bước sóng khác nhau và dựng đồ thị để xác định bước sóng hấp
phụ cực đại
- Xác định bước sóng hấp phụ cực đại của chất phân tích
Sau khi có giá trị bước sóng hấp thụ cực đại của dung dịch CuSO4 0.15M, tiến
hành chuẩn bị các dung dịch CUSO4 với các nồng độ 0.05M, 0.75M, 0.1M,
0.15M, 0.2M
Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại giá trị bước sóng cực đại
Dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa A và nồng độ CuSO4, từ đó suy ra giá trị
3.
a, Tính toán khối lượng CuSO4 cần lấy để pha (stock)

Để pha 20ml dung dịch CuSO4 1M:

mCuSO4.6H2O= 1.20.10^-3.268= 5,36g
b, Pha các dung dịch CuSO4 với các nồng độ 0,05M; 0,75M; 0,1M; 0,15M,0,2M

Hút 0,5ml stock +9,5ml H2O (1)

0,75ml stock + 9,25ml H2O (2)
1ml stock +9 ml H2O (3)
1,5 ml stock + 8,5ml H2O (4)
2ml stock + 8ml H2O (5)

c,Kết quả
.CuSO4
Đo được bước sóng hấp phụ cực đại là 882 nm
Kết quả đo độ hấp thụ của các dung dịch tại bước sóng hấp phụ cực đại 882nm
1 2 3 4 5
OD 0,516 0,725 1,045 1,528 1,978

.Hibicus
Bước sóng hấp phụ cực đại của dung dịch Hibicus là 270 nm

B. Sử dụng pH met
I. Các bước tiến hành

1. Bật máy
2. Mở nắp đậy bảo vệ đầu điện cực (thường được chứa dung dịch )
3. Sử dụng trạng thái đo pH để đo các dịch chuẩn
4. Chuẩn lại hệ thống trước khi sử dụng mỗi ngày
a. Điều chỉnh nút đặt nhiệt độ đo tới nhiệt độ phòng hoặc sử dụng ATC probe
b. Dùng 2 dung dịch đệm chuẩn pH=7 và chuẩn môi trường axit nếu mẫu đo có
tính axit hoặc dùng dung dịch chuẩn pH kiềm nếu mẫu đo có tính kiềm.
c. Rửa điện cực bằng nước cất và lau khô bằng giấy mềm. Chú ý không được làm
xước đầu điện cực vì sẽ dẫn đến kết quả đo sai lệch.
d. Nhúng điện cực vào đệm chuẩn pH =7. Chú ý để mức dung dịch của mẫu đo
thấp hơn dung dịch bên trong điện cực. Đặt chế độ máy tự điều chỉnh pH=7.
e. Lấy đầu điện cực ra, rửa lại bằng nước cất, lau khô, dùng dung dịch cần đo tráng
qua.
f. Đặt điện cực vào dung dịch chuẩn lần 2, đặt chế độ tự chỉnh theo đệm pH chuẩn
thứ 2. Lại rửa và làm sạch như lần thứ nhất
g. Có thể kiểm tra lại bằng cách đo dung dịch pH =7. Điều chỉnh nếu cần thiết. Đọc
giá trị sau 3 lần đo và nếu giữa các lần đo chêng lệch không được quá 0,05. Nếu sai
lệch nhiều thì cần làm sạch lại điện cực.
5. Đặt nhiệt độ theo nhiệt độ của dung dịch đo hoặc nhiệt độ tự động
6. Đặt điện cực vào dung dịch đo
7. Để pH- met tự đọc. Thông thường, máy tự đọc cho giá trị ổn định trong vòng 1
phút. Ban đầu pH hiển thị thay đổi nhanh, sau đó ổn định chậm.
8. Ghi lại các giá trị đo kể cả nhiệt độ mẫu.
9. Lấy điện cực ra khỏi dung dịch đo và rửa, làm sạch, lau khô.

II: Kết quả

Số thứ tự V KH2PO4 V NaOH Giá trị pH đo

0,1M 0,1M được
1 0 20 12,89
2 1 19 12,78
3 2 18 12,73
4 3 17 12,66
5 4 16 12,52
6 5 15 12,32
7 6 14 12,18
8 7 13 11,94
9 8 12 11,58

BÀI 3: ĐIỆN DI BIẾN TÍNH SDS TRÊN POLYARCYAMID

I, CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện trong điện trường. Vận
tốc vận chuyển của phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân
tử
Điện di các hợp chất cao phân tử (protein, enzym, axit nucleic…) được thực hiện
trên một chất mang là khối gel xốpcó vai trò như một lưới lọc phân tử.
Các gel thường được sử dụng trong điện di là polyacrylamit, agarose
Khi có mặt ß-mercaptoethanol để khử các cầu disulfua (-S-S-) và SDS các phân tử
protein sẽ bị biến tính. Chuỗi polipeptit đã bị duỗi ra sẽ được phủ kín bởi SDS –
chất tẩy rửa mang điên tích âm gắn vào phần lớn các protein tạo ra một polyanion
có mật độ điện tích trên 1 đơn vị chiều dài gần như không đổi và không phụ thuộc
vào trình tự chuối peptit. Dưới tác dụng của điện trường protein sẽ dịch chuyển
trên gel acrylamit về phía điện cực dương. Do tỉ lệ điện tích/khối lượng tương
đương nhau, sự phân tách protein đã biến tính bởi SDS chỉ dựa trên khối lượng
phân tử mà ko phụ thuộc điện tích. Do mắt lưới của gel, các phân tử protein có
KTPT lớn di chuyển chậm hơn các phân tử protein có KTPT nhỏ và do vậy có thể
tách ra trên bản điện di.
II. CHUẨN BỊ HÓA CHẤT
- Dung dịch Acrylamide 30%
60g acrylamide
1.6g bisacrylamide
Thêm nước khử ion chỉnh đến 200ml
Dung dịch được bảo quản trong lọ màu tối
- Đệm Tris 1.5M, pH 8.8
36.3 g tris - bazơ thêm 150 ml nước khử ion, chỉnh về pH 8.8 bằng HCL pha loãng
2 lần. Sau đó định mức đến 200ml.
Đệm được bảo quản ở 40C, sử dụng 3 tháng
- Tris 0.5M, pH 6.8
3 g Tris – bazơ, thêm 40ml nước khử iôn, dùng HCL pha loãng 2 lần chỉnh về pH
6.8. Sau đó định mức đến 50ml
Đệm được bảo quản ở 40C, sử dụng 3 tháng
- 10% SDS
10 g SDS, thêm nước khử iôn đến 100ml. Bảo quản nhiệt độ phòng, 6 tháng.
- 10% APS (Ammonium persulfate)
0.1 g APS thêm 1 ml nước khử iôn, hòa tan và sử dụng luôn (bảo quản trong tủ
lạnh dùng được vài tuần).
- Đệm mẫu (5X = 1đệm + 4 mẫu)
Pha 16ml đệm mẫu:
6.8 ml nước cất
2 ml 0.5M tris 6.8
3.2 ml glycerol
1.6 ml 20% SDS
0.8 ml β-mercaptoethanol (yếu tố quan trọng trong biến tính protein, do vậy chỉ
pha với một lượng nhỏ đệm mẫu và bổ sung β-mercaptoethanol rồi dùng luôn
trong tuần)
1.6 ml Bromophenol blue (bổ sung lượng nhỏ sao cho dung dịch nhuộm màu tím
đậm là được. Không cần cân chính xác)
bảo quản ở – 200C
- Đệm chạy (khoảng pH 8.3)
3.03 g Tris
14,4 g Glicine
1g SDS
Định mức đến 1lit, cất nhiệt độ phòng trong vòng 2tháng
- Nhuộm màu
0.5 g Coomasive brilliant blue R250 (cho vào lọ tối)
800 ml methanol (hòa tan coomasive) sau đó bổ sung tiếp
140 ml acetic acid
Dùng ống đong bổ sung đến 2 lít bằng nước cất. Cất ở nhiệt độ phòng, 6tháng
- Tẩy màu:
400ml methanol
70 ml acid acetic
định mức đến 1 lít bằng nước cất
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lắp bản kính điện di
2. Kiểm tra độ khít
3. Chuẩn bị gel tách 12% acrylamit
2ml acrylamide 30%
1.3ml Tris (pH 8.8)
1.6ml nước khử ion
50 μl SDS 10%
50 μl APS 10%
2 μl Temed
Đảo trộn nhẹ nhàng và tra vào bản gel (tránh tạo bọt), phủ 1 lớp ethanol và đợi 30
phút cho đông
4. Chuẩn bị mẫu protein , pha theo tỉ lệ 1đệm+4 mẫu (theo thể tích), đun ở 95oC
trong 5 phút
5. Chuẩn bị gel cô 5%
330 μl acrylamide 30%
250 μl Tris (pH 6.8)
1.4ml H2O
20 μl SDS 10%
20 μl APS 10%
2 μl Temed
Đảo trộn nhẹ nhàng và tra vào bản gel, đưa lược vào để tạo giếng, đợi 15 phút cho
đông và lấy lược ra.
6. Tra mẫu và điện di. Nhỏ một lượng 16 - 20µl mẫu/giếng gel, với protein chuẩn 5
- 10µl/ giếng, chạy với cường độ 1 – 1.5mA/giếng. Chạy bản gel cho đến khi vạch
màu xanh chạy đến cuối bản
7. Tháo bản gel ra
8. Tiến hành nhuộm màu với dung dịch nhuộm qua đêm,
9. Tẩy màu gel nhuộm đến khi nền bản gel sáng lên, làm khô bản gel để chụp ảnh
và lưu giữ mẫu.
IV. KẾT QUẢ ĐIỆN DI