BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên sinh viên thực hiện: Trần Phương Thảo

Mã số sinh viên: 20190383

BÀI 6:
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI
TIẾN

I.NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP

-Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân protein caseinat natri (cơ chất có thể là casein hoặc hemoglobin)
bằng chế phẩm enzyme có trong dung dịch nghiên cứu tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein
chưa bị thủy phân bằng axit tricloaxetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy
phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrosine để tính lượng sản phẩm
tương ứng do enzyme xúc tác tạo nên

-Hoạt độ protease được định nghĩa là lượng enzyme trong thời gian một phút ở 30℃ chuyển hóa được
một lượng caseinnat natri tương đương với một µmol tyrosine không bị kết tủa bởi TCA

-Hoạt độ của các chế phẩm protease có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn được xác định tại các chỉ số pH:

pH= 2,5±0,2 đối với protease axit

pH= 7,2±0,2 đối với protease trung tính

pH= 9,5±0,2 đối với protease kiềm

II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1, Chuẩn bị
-Dung dịch cơ chất: Casein 1% pha dung dịch phosphate pH=7
-Dung dịch enzyme: Pha loãng enzyme gốc trong dung dịch đệm phosphate pH=7
-Đặt bình ổn nhiệt ở 30oC, để lọ dung dịch cơ chất và dung dịch enzyme trong bể ổn nhiệt

2, Tiến hành

CÁC BƯỚC MẪU THÍ NGHIỆM MẪU KIỂM CHỨNG

Bước 1
Cho vào ống nghiệm:
-2ml dung dịch cơ chất
-2ml dung dịch enzyme
-Trộn đều, để phản ứng trong đúng
10 phút ở 30℃

Bước 2
-Bổ sung 4ml TCA 0,3M, trộn đều
ngay lập tức, để yên hỗn hợp trong
20 phút.
-Lọc, thu dịch lọc thí nghiệm
Cho vào ống nghiệm:
-2ml dung dịch enzyme vào trước
-4ml dung dịch TCA 0,3M
-2ml dung dịch cơ chất
-Trộn đều ngay lập tức, để hỗn hợp
trong vòng 20 phút
-Lọc, thu dịch lọc kiểm chứng

Bước 3
Cho vào ống nghiệm:
Cho vào ống nghiệm:
-0,3ml dịch lọc -0,3 ml dịch lọc kiểm chứng
-1,5ml Na2CO3 0,5M -1,5ml Na2CO3 0,5M
-Trộn đều, để yên trong 30 phút -Trộn đều, để 10 phút
-Thêm 0,3ml dung dịch Folin
-Trộn đều, để yên 30 phút

Bước 4
Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 750nm với
dung dịch đối sánh với mẫu kiểm chứng

3, Số liệu và kết quả

 Đồ thị đường chuẩn của Tyrosine

Số liệu thực nghiệm:

Protease pha loãng 2000 lần
Mẫu thí nghiệm thứ nhất có mật độ quang thu được sau phản ứng: OD=0,476

Mẫu thí nghiệm thứ hai có mật độ quang thu được sau phản ứng: OD=0,394

Trung bình hai lần đo: OD=0,435

Ứng với nồng độ Tyrosine chiếu theo đường chuẩn là 0,4µmol/ml

Tính toán:
Nồng độ Tyrosine trong dịch lọc là 0,4µmol/ml
Nồng độ Tyrosine không bị đông tụ bởi TCA là: 0,4 x 4 = 1,6 µmol/ml

Trong 30 phút ở 30℃ , dưới tác dụng của 2ml dung dịch enzyme, lượng Tyrosine không bị kết tủa là 1,6
µmol/ml

1,6
Lượng Tyrosine trong dịch lọc không bị kết tủa trong 1 phút có: = 0,053 (µmol/ml)
30
 Trong 1ml dung dịch enzyme pha loãng có: 0,026 (µmol/ml)

Trong 1ml dung dịch enzyme ban đầu có: 53,3 (µmol/ml)

Vậy hoạt độ của enzyme Protease là 53,3 µmol/ml

BÀI 7 :
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP DNS

I.NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP

-Glucoamylase là enzyme phân cắt các liên kết glycozit α-1,4 và α-1,6 bên trong tinh bột, giải phóng
glucose

(C6H10O5)n + nH20 (xúc tác glucoamylase, 30℃ , pH tối ưu) = nC6H12O6

-Phương pháp này dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng enzyme glucoamylase, sau đó xác định lượng
đường khử và tính hoạt độ enzyme

-Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng enzyme cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30℃ tác dụng lên tinh
bột tan giải phóng được 1mg glucose

II  : CÁC LƯU Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME

1, Enzyme là những protein có hoạt tính xúc tác nên không bền, rất nhạy với các tác nhân hóa lý, vì vậy
cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein
2, Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện có dư cơ chất. Sau khi dừng phản ứng, lượng cơ chất
bị chuyển hóa không quá 20%
3, Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút
4, Khi xác định hoạt độ enzyme phải làm mẫu kiểm chứng song song mẫu thí nghiệm. Trong mẫu kiểm
chứng, enzyme đã bị vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc cơ chất. Trong mẫu kiểm chứng, enzyme đã bị vô
hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất
Giải thích
Enzyme là chất xúc tác, không có enzyme phản ứng vẫn diễn ra, nên phải làm mẫu kiểm chứng để kiểm
tra (nhưng với tốc độ chậm, không xác định được đâu là lượng sản phẩm sinh ra do enzyme, đâu là sản
phẩm tự phản ứng, vì vậy phải loại trừ phản ứng diễn ra)

III.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1, Chuẩn bị
- Dung dịch cơ chất: Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch enzym: pha loãng enzyme gốc trong dung dịch đệm citrate pH 4,7
- Đặt bình ổn nhiệt ở 30°C; Để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzym trong bể ổn
nhiệt 30°C (để ổn nhiệt trước khi phản ứng).

2, Tiến hành
Các bước Ống nghiệm 1 (mẫu thí Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm
tiến hành nghiệm) chứng)

0,5ml dịch enzym phân tích

(đã ở 30oC)
0,5 ml dung dịch hồ tinh bột
Bước 1: 1% (đã ở 30oC)
Trộn đều và để phản ứng đúng
10 phút ở 30oC

0,5ml dịch enzym phân tích

3 ml DNS
Bổ sung 3 ml DNS, trộn đều
0,5 ml dung dịch hồ tinh bột
ngay lập tức
1%
(sau đó nhanh chóng đặt ống
Bước 2 Trộn đều ngay lập tức (sau đó
nghiệm vào
nhanh chóng đặt ống nghiệm
giá trong nồi cách thủy đang
vào giá trong nồi cách thủy
sôi)
đang sôi)

Đun sôi cách thuỷ 5 phút

Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Làm nguội nhanh (bằng cách
Làm nguội nhanh (bằng cách
nhúng ống nghiệm vào
Bước 3 nhúng ống nghiệm vào
khay/chậu nước lạnh hoặc
khay/chậu nước lạnh hoặc
nước đá)
nước đá)

Đo độ hấp thụ của dung dịch

thí nghiệm ở bước sóng 540
Bước 4 nm với dung dịch đối sánh
với mẫu kiểm chứng

III, Số liệu thực nghiệm:

Glucoamylase pha loãng 5000 lần
Mẫu thí nghiệm thứ nhất có mật độ quang thu được sau phản ứng: OD=0,148

Mẫu thí nghiệm thứ hai có mật độ quang thu được sau phản ứng: OD=0,309

Trung bình hai lần đo: OD=0,2285

Nồng độ Glucose giải phóng tương ứng là 0,2µmol/mol

Tính toán:
Trong 30 phút ở 30℃ , dưới tác dụng của 0,5ml dung dịch enzyme, lượng Glucose không bị kết tủa là 0,2
µmol/ml

0,2
Lượng Glucose trong dịch lọc giải phóng trong 1 phút có: = 0,006 (µmol/ml)
30
 1
Trong 1ml dung dịch enzyme pha loãng có: : (µmol/ml)
75
Trong 1ml dung dịch enzyme ban đầu có: 66,6 (µmol/ml)

Vậy hoạt độ của enzyme Glucoamylase là 66,6 µmol/ml

BÀI 8 :
XÁC ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ BẰNG 2,6 DCIP)

I.NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP

Axit Ascobic (Vitamin C) là một hợp chất chưa no có 2 nhóm enol và 2 nhóm hydroxyl, hòa tan trong
nước và tồn tại dưới 2 dạng oxy hóa và dạng khử

Dạng khử Dạng oxy hóa

-Axit ascobic bị phân hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong môi trường axit. Do
vậy, người ta thường chiết axit ascorbic trong mẫu bằng các dung dịch axit như axit axetic

-Phương pháp dựa trên nguyên tắc là axit ascobic có khả năng oxy hóa khử thuận nghịch với chất chỉ thị
đặc trưng màu xanh là 2,6 diclophenolin dophenol (DCIP). Dựa vào lượng DCIP tiêu tốn, ta tính được
lượng vitamin C có trong mẫu thí nghiệm

-Sơ đồ phản ứng

-Đặc điểm của chất chỉ thị:
-2,6 DCIP là chất chỉ thị đặc trưng , chỉ phản ứng với vitamin C mà không tác dụng với chất khác
-Đóng hai vai trò là chất chỉ thị và thuốc thử và đơn giản hóa quá trình chuẩn độ
-Chất chỉ thị này có khả năng đổi màu kép, khi pH của môi trường của môi trường thay đổi từ kiềm sang
axit thì màu của chất chỉ thị chuyển từ xanh sang hồng, mặt khác dạng oxy hóa của DCIP có màu còn
dạng khử là không màu (DCIP có màu xanh trong môi trường kiềm và môi trường axit yếu, có màu tím
trong pH từ 4-5 và hồng ở pH<4)
-DCIP bền trong môi trường trung tính (pH=7) nên khi chuẩn độ, DCIP ở dạng oxy hóa, suy ra dung dịch
ban đầu màu xanh
-DCIP là chất không bền, nồng độ thay đổi theo thời gian
-DCIP ban đầu ở dạng oxy hóa màu xanh, khi nhỏ DCIP xuống nó chuyển sang dạng khử không màu.
Sau điểm tương đương, DCIP dư, môi trường axit nên xuất hiện màu hồng

II: TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG

1. Chuẩn bị
Dung dịch 2,6 DCIP (KTV của PTN chuẩn bị)

1.1,Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch 2,6 DCIP
 Bình tam giác 1 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết (PTN pha sẵn)
2,5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút, được
a1 ml
 Bình tam giác 2 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết
Vài hạt tinh thể KI
5 giọt hồ tinh bột
Chuẩn bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b1 ml
 Tính hệ số f của dung dịch 2,6 DCIP dùng trong phân tích : f = b1 / a1
1.2. Dịch phân tích:
Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit metaphosphoric 5% (hoặc HCl
5%). Chuyển mẫu vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức tới vạch bằng axit metaphosphoric
5% (hoặc HCl 5%). Lắc đều, lọc và thu dịch lọc vitamin C phân tích.

 Mẫu thí nghiệm:

Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50 ml, bình số 3):
10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng micropipet)
5 ml dung dịch oxalatamon bão hoà (dùng micropipet)
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút.
 Mẫu kiểm chứng:
Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50 ml, bình số 4):
10 ml HCl 1% (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút

III, SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM VÀ TÍNH TOÁN

1.1: Xác định hệ số hiệu chỉnh
Chuẩn độ Vitamin C bằng DCIP.
Thể tích DCIP tiêu tốn là a1= 5,15ml
Chuẩn độ Vitamin C bằng KIO3
Thể tích KIO3 tiêu tốn là b1= 4,17ml
Hệ số f= a1/b1= 0,8097
1.2: Tính hàm lượng vitamin C
Kết quả
Mẫu thí nghiệm (1,2): V= 3.4ml
Mẫu kiểm chứng: V=0.1ml
Cứ 1ml 2,6DCIP 0,001N tương ứng 0,088mg vitamin C
3,4-0,1= 3,3 ml 0,001N tương đương với 0,088 x 3,3= 0,2904 mg vitamin C
Trong 10ml dịch lọc có 0,2904 mg vitamin C
0,2904 x 100
Trong 100ml có =2,904 mgvitamin C
10
Vậy trong 10g mẫu có 2,904 mg vitamin C
2,904 X 100
Trong 100g mẫu có =29,04 mg = 0,02904g vitamin C
10

Hàm lượng vitamin trong mẫu là 2,904%