Sinh viên: Phạm Thị Thu Uyên

Mssv: 20211571
Mã lớp: 728604

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 6: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ GLUCOAMYLASE
Mục đích thí nghiệm
- Xác định hoạt độ glucoamylase trong các hợp chất hữu cơ.
I- Nguyên tắc của phương pháp
- Phương pháp này dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng enzym
Glucoamylase sau đó xác định lượng đường khử glucose bằng phương pháp DNS:
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit
dinitro salicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng
độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung
dịch đường khử nghiên cứu với thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị đường chuẩn của
glucoza tinh khiết với thuốc thử này ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của
dịch tinh bột sau khi thủy phân bởi enzyme. Từ nồng độ Glucose và dựa vào định
nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme => Hoạt độ enzyme Glucoamylase của chế phẩm.
- Glucoamylase là enzym phân cắt các liên kết α(1-4) glicozit , α(1-6) glicozit bên
trong phân tử tinh bột giải phóng Glucose.

Glucoamylase, 30oC, pH
(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6

- Glucose được giải phóng sẽ được xác định bằng phương pháp DNS.
 Trong môi trường kiềm và nhiệt độ cao, axitdinitro salicylic (DNS) có màu
vàng bị Glucose và Fructose khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid có màu nâu
đỏ, bản thân đường Glucose bị khử thành acid Gluconic. Trong đó 3-amino-5-
nitrosalicylic acid hấp thụ mạnh bước sóng 540 nm, do đó thông qua việc đo
cường độ màu của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 540 nm ta có thể biết được
nồng độ 3-amino-5-nitrosalicylic acid được tạo ra từ đó xác định được hàm lượng
đường khử tổng số trong mẫu. Tiến hành lập đồ thị đường chuẩn OD 540 nm của
Glucose ở các nồng độ khác nhau, từ giá trị OD 540nm của dung dịch cần phân
tích, đối chiếu vào đồ thị đường chuẩn ta sẽ xác định được nồng độ đường khử
của dịch sau khi bị enzim thủy phân.

- Định nghĩa đơn vị hoạt độ glucoamylase : là lượng enzim tác dụng lên tinh bột ở 30
độ C và pH= 4,7 trong thời gian 1 giờ làm giải phóng được 1mg
glucoza
Cách tiến hành
Mẫu thí nghiệm: Chế phẩm enzyme glucoamylase do PTN cung cấp
I.1. Chuẩn bị
- Dung dịch cơ chất: dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch enzyme: pha loãng enzyme gốc trong dung dịch đệm citrate
pH=4,7
- Đặt bình ổn nhiệt ở 30oC; Để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzyme
10 phút trong bể ổn nhiệt 30oC (ổn nhiệt trước khi phản ứng)
 I.2. Tiến hành (làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng)

Các bước Ống nghiệm 1,2 ( mẫu thí
tiến hành nghiệm)
Bước 1 Phản ứng xúc tác enzym
- 0.5ml dịch enzym phân tích
(đã ở 30 độ C)
- 0.5ml dung dịch hồ tinh bột
1%
(đã ở 30 độ C)
- Trộn đều và để phản ứng
đúng 10 phút ở 30 độ C
Bước 2 Vô hoạt enzym
- Bổ sung 3ml DNS , trộn đều
(sau đó đặt ống nghiệm vào
giá trong nồi cách thủy)
Bước 3 Định lượng sản phẩm tạo thành
- Đun sôi cách thủy 5 phút
- Làm nguội nhanh (bằng cách
nhúng ống nghiệm vào khay/
chậu nước lạnh hoặc nước
đá)
Bước 4 - Đo mật độ quang
OD540nm
đối sánh với mẫu kiểm
chứng
chứng
Ống nghiệm 3 ( mẫu
kiểm chứng)
- 0.5ml dịch enzym phân
tích
- 3ml DNS trộn đều
- 0.5ml dung dịch hồ tinh
bột 1 %. Trộn đều ( sau
đó đặt ống nghiệm vào
giá trong nồi cách thủy
đang sôi)
- Đun sôi cách thủy 5 phút
- Làm nguội nhanh(bằng
cách nhúng ống nghiệm
vào khay/ chậu nước
lạnh hoặc nước đá)
Đo mật độ quang
OD540nm
đối sánh với mẫu
kiểm

II- Kết quả thí nghiệm

Mẫu Thí nghiệm:
Giá trị đo OD lần 1:
0,810 Giá trị đo OD lần
2: 0,812
Mẫu kiểm chứng: OD=0,000
  Giá trị OD trung bình = (0,810 + 0,812) : 2 = 0,811
- Phương trình đường chuẩn: y = 1,749x – 0.0746

Giá trị OD 540nm = 1.749 x [Nồng độ Glucose] -0.0746

- Thay giá trị OD 540nm trung bình sau 2 lần đo vào phương trình ta được:

0.811 = 1.749 x [Nồng độ Glucose] -0.0746

 [Nồng độ Glucose] = 0,506 (mg/ml)

- Thiết lập công thức tính sai số:

Giá trị OD540nm Sai số

Lần 1 0.810 0,001
Lần 2 0,812 0,001
Trung bình 0,811
 Lượng glucose được giải phóng khi cho 0,5 ml dung dịch enzym Glucoamylase tác
dụng với 0,5 ml hồ tinh bột 1% trong 10 phút là: m= x.V= 0,506.(0,5 + 0,5 )= 0,506 (mg )
trong 1 giờ: m= 0,506.60/10 = 3,036 (mg )
0,5 ml enzym Glucoamylase có đơn vị hoạt độ enzym 3,036U.
Hoạt độ của enzym sau pha loãng là: 3,036/0,5 = 6,072 (U/ml )
Do enzym được pha loãng 40000 lần, nên hoạt độ enzym Glucoamylase ban đầu là:
6,072 x 40000= 242880 (U/ml )
Nhận xét: Kết quả có thể sai số do dụng đường chuẩn bài 4, quá trình đo lấy mẫu
chưa chuẩn hoặc sai số dụng cụ...

Chú ý
- Chúng ta cần chuẩn bị dung dịch hồ tinh bột 1% bằng các đun nóng tinh bột tại nhiệt độ
khoảng 80°C lí do là vì enzyme Glucoamylase không thủy phân được trong tinh bột sống.
- Trong định nghĩa đơn vị hoạt độ , yêu cầu thời gian làm trong 1 giờ đồng hồ, nhưng trên
thực tế, trong 30 phút đầu tiên với hoạt độ cao, vận tốc phản ứng nhanh, càng về sau, vận
tốc sẽ chậm dần; với hoạt độ thấp, thời gian có thể kéo dài tới 1h
- Cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein (do enzyme có nguồn gốc là protein có
hoạt tính xúc tác nên không bền vững, nhạy với các tác động lý, hóa học ) như nhiệt độ cao,
pH quá axit hoặc quá kiềm, muối kim loại nặng vv… Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong hỗn
hợp phản ứng vì một số enzyme có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia. Các điều kiện
phản ứng (pH, nhiệt độ ) phải ở trong giới hạn enzyme có thể tồn tại bền vững và giữ được
cố định trong suốt thời gian phản ứng. Thường người ta tiến hành phản ứng trong dung
dịch đệm với pH ổn định và tối ưu đối với enzyme đã cho và ở 30℃ trong máy siêu ổn
nhiệt.
- Khi xác định hoạt độ enzyme phải làm mẫu kiểm chứng song song với thí nghiệm. Trong
mẫu kiểm chứng enzyme đã bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất
- Khi chuẩn bị dung dịch enzyme để xác định hoạt độ thì tùy theo đặc tính và mức độ thuần
khiết của chế phẩm enzyme mà tiến hành chuẩn bị để có được dung dịch enzyme trong suốt
(vì có thể lúc hút để lấy enzyme đó không phải là enzyme)
- Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện dư cơ chất.
Một số lưu ý về enzym:
Enzim hay fecmen là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và tính đặc hiệu 4
khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học khác nhau. Mỗi một enzim có khả năng xác tác
cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt độ xác tác của enzim càng mạnh thì lượng
có chất bị chuyển hoá hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên một đơn vị thời gian
càng lớn. Vì vậy, có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của enzym bằng cách xác định tốc độ
chuyển hoá cơ chất hoặc tốc độ tích luỹ sản phẩm phản ứng. Để đạt mục tiêu này có thể
dùng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp đo độ nhớt, phương pháp phân cực
kế, phương pháp áp kế, phương pháp phổ quang kế, phương pháp chuẩn độ liên tục,
phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học.
Đối với chế phẩm enzim , ngoài việc xác định mức độ hoạt động của nó cần phải đánh giá
độ thuần khiết (độ sạch) của chế phẩm . Đại lượng đặc trưng cho độ thuần khiết của chế
phẩm enzim là hoạt độ riêng. Hoạt độ riêng được biểu diễn bằng số đơn vị enzym trên 1mg
Protein
III. Những điều cần lưu ý khi xác định hoạt độ enzym:
1 . Enzim là những protein có hoạt tính xúc tác nên không bền vững, rất nhạy đối với tác
động lý , hóa học . Vì vậy , cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ
cao pH quá axit hoặc quá kiểm , muối kim loại nặng vv . . Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong
hỗn hợp phản ứng vì một số enzym có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia .
Các điều kiện phản ứng ( pH , nhiệt độ ) phải ở trong giới hạn enzim có thể tồn tại bền
vững và giữ được cố định trong suốt thời gian phản ứng . Thường người ta tiến hành phản
ứng , trong dung dịch đệm với pH ổn định và tối ưu đối với enzim đã cho và ở 30°C trong
máy siêu ổn nhiệt
2 . Phản ứng enzim được tiến hành trong điều kiện dự cơ chứ . Sau khi dừng phản ứng
lượng có chất bị chuyển hoá không quá 20 % ( có thể khoảng 20 - 30 % ) để có thể bão hòa
hết lượng enzym.
3.Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút ( từ 5-30 phút).Tốt nhất là
xác định tốc độ ban đầu của phản ứng ( 30 - 60 giây) vì ở thời gian tốc độ phản ứng khá ổn
định , sau đó bắt đầu giảm. Trong một số trường hợp hoạt độ enzym quá thấp có kéo dài
thời gian phản ứng giữa enzym với cơ chất đến 1 giờ hay lâu hơn.
4 . Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song với mẫu thí nghiệm .
Trong mẫu kiểm chứng enzim đã bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất.
5 . Khi chuẩn bị dung dịch cnzim để xác định hoạt độ thì tuỳ theo đặc tính và mức độ thuần
khiết của chế phẩm Enzim mà tiến hành chuẩn bị để có được dung dịch enzim trong suốt.
Nếu là các chế phẩm thô cần hoà tan enzim , loại bỏ sinh khối và tạp chất rắn.
Đối với canh trường lông phải ly tâm ở nhiệt độ thấp hay lọc để nhận được dung dịch trong
suốt.
Đối với canh trường bỏ mặt phải nghiền nhỏ rồi chiết rút enzim bằng nước hay dung dịch
đệm có pH thích ứng với lượng dung môi gấp 10 - 20 lần ( thường là 10 lần) đối trọng . Sau
đó đem lọc hoặc ly tâm để có được dung dịch enzim trong suốt .
Nếu là các chế phẩm kỹ thuật hay thuần khiết phải hoà chế phẩm vào nước hoặc dung dịch
đệm thích ứng rồi dùng que thuỷ tinh trà cẩn thận với một lượng nhỏ dung môi , sau đó
thêm nước hoặc dung dịch đệm cho đến một thể tích nhất định . Nếu dung dịch không suốt
thì phải lọc hoặc ly tâm.
Có thể sử dụng phương pháp khác để xác định đường khử trong trường hợp này
không? Giải thích
- Ta có thể xác định hoạt độ bằng cách vô hoạt enzym bằng kiềm (Phương pháp lowry ),
hoặc vô hoạt bằng axit rồi trung hòa lại, hoặc dùng phương pháp Rodzevich (Thay DNS
bằn 1ml felin 1, 1 ml felin 2 và 2ml H2O ). Nhưng sẽ mất thời gian hơn và không hiệu quả
bằng phương pháp dùng DNS