BÀI 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SACCAROSE

(Theo phương pháp thủy phân, xác định đường khử

theo DNS)

I. NGUYÊN TẮC
 Giai đoạn 1: Thủy phân đường saccaroza

Thủy phân saccaroza bằng axit ta thu được hỗn hợp của 2 đường khử là glucoza
và fructoza. Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính được lượng
saccaroza có trong mẫu thí nghiệm
HCl
C12H22O11 + C6H12O6 + C6H12O6
H2O

 Giai đoạn 2: Xác định đường khử bằng DNS

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
axit dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với
nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn
của glucoza tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử
của mẫu.

100⁰C
+ +
Bbbbbbbbbbbbb

3,5 – dinitrosalicylic D – Glucose 3-amino-5-nitrosalicylic D-Gluconic acid

(vàng) (nâu đỏ)

 Ưu nhược điểm của phương pháp

- Phương pháp đơn giản, nhanh và tương đối rẻ

- Các loại đường khử khác nhau cho độ đậm nhạt khác nhau, do đó, cần phẩn
xây dựng đường chuẩn cho từng loại đường

- Độ đặc hiệu tương đối thấp

- Phản ứng bị ảnh hưởng bởi nhiều hợp chất khác nhau: rượu, các axit amin,
phenol…

II. CÁC CHÚ Ý KHI LÀM THÍ NGHIỆM

- Không dùng phenol trong quá trình trung hòa sau thủy phân

- Khi phân tích đường khử gì là chủ yếu thì phải dùng đường khử đó làm đường
chuẩn

- Dùng sinh hàn khí để HCl không bay hơi

- Khi trong mẫu không chỉ có đường saccaroza mà còn có loại đường khử khác
ta phải lưu ý nên sử dụng enzyme thay vì sử dụng axit

- Trong quá trình làm cần loại bỏ những thành phần ảnh hưởng đến quá trình

- Các giá trị pH khác nhau của cùng 1 dung dịch đo màu cho ra giá trị OD khác
nhau

Độ hấp thụ phụ thuộc vào pH dung dịch đo

=> Cần trung hòa mẫu trước khi đem vào phản ứng màu

- Nên xác định các mẫu có 1 loại đường => cho kết quả chính xác nhất

- Đường khử khác nhau cho màu khác nhau

- Phản ứng của đường khử với DNS: Cho DNS vào nồi đun sôi cách thủy, 5
phút lấy ra coi như phản ứng đã xong, DNS có màu vàng nhạt, sản phẩm của
phản ứng cho màu vàng đỏ

- Thuốc thử DNS: thành phần

+ Phenol làm tăng cường độ màu phản ứng

+ Sodium sulfite: lấy oxi có thể tham gia phản ứng oxi hóa – khử với DNS

+ NaOH: môi trường kiềm cho phản ứng

III. CÁCH TIẾN HÀNH

PHẦN 1. Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp DNS
1. Dung dịch glucose gốc: 2 mg/ml

2. Tiến hành:

Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch (6 ống).

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch glucose gốc 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
(ml)
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Dung dịch DNS (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Trộn đều, đun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước lạnh

Đo độ hấp thụ của dung dịch màu tại bước sóng 540nm với dung dịch đối sánh
là mẫu trong ống 1.
Nồng độ glucose Ci 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2
(mg/ml)
OD 540nm

PHẦN 2. Phân tích mẫu

Mẫu thí nghiệm: nước ngọt chứa saccarose (PTN cung cấp)

1. Thuỷ phân saccarose

Dùng pipet cho vào bình cầu 0,4 ml mẫu, dùng ống đong thêm 19 ml nước cất
và 10 ml HCl 5%. Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách thuỷ 30 phút để thuỷ phân
saccarose. Làm nguội và trung hoà mẫu bằng NaOH 5% với giấy chỉ thị pH.
 Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100 ml, định mức bằng nước cất
tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử sau thuỷ phân.

2. Dịch đường khử trước thuỷ phân

Dùng pipet cho 0,4 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ 100 ml. Định
mức bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử trước thuỷ
phân.

3. Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic (DNS)

 Mẫu sau thuỷ phân: ống 1

- 0,5 ml dịch đường khử sau thuỷ phân
- 1,5 ml DNS
- Trộn đều/Votex
- Đặt mẫu vào giá ống nghiệm trong nồi đang sôi, đun sôi cách thuỷ 5 phút
- Làm nguội nhanh.
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 540 nm với dung dịch đối sánh là Mẫu trước
thuỷ phân
 Mẫu trước thuỷ phân: ống 2
- 0,5 ml dịch đường khử trước thuỷ phân
- 1,5 ml DNS –
- Trộn đều/Votex
- Đặt mẫu vào giá ống nghiệm trong nồi đang sôi, đun sôi cách thuỷ 5 phút
- Làm nguội nhanh. Mẫu này dùng để set máy về giá trị OD = 0
Từ giá trị OD540nm đo được cho mẫu sau thủy phân, tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng
glucose và OD540nm suy ra hàm lượng đường khử có trong dịch đường sau thuỷ phân
(mg/ml). Từ đó tính được hàm lượng đường khử do Saccharose thủy phân ra và tính được
hàm lượng đường Saccharose trong mẫu nước ngọt
IV. XỬ LÍ SỐ LIỆU
Phương trình đường chuẩn: y = 1,749x – 0,0746
  Mẫu 1: OD = 1,063
Thay vào phương trình đường chuẩn ta có: x = 0,65 (mg/ml)
1ml dịch đường -> 0,65 mg đường khử
 Trong 100ml dịch đường có 66 mg đường khử
 Số gam saccarozo có trong 0,4 ml mẫu là:
65. 0,95 = 61,75 mg = 0,06175 g
Hàm lượng saccarozo có trong mẫu là:
0,06175/0,4=15,43%

 Mẫu 2: OD = 0,981
Thay vào phương trình đường chuẩn ta được x = 0,60 (mg/ml)
1ml dịch đường -> 0,60 mg đường khử
 Trong 100ml dịch đường có 60 mg đường khử
 Số gam saccarozo có trong 0,4 ml mẫu là:
60. 0,95 = 57 mg = 0,057 g
Hàm lượng saccarozo có trong mẫu là:0,057/0,4=14,25%
Hàm lượng saccaroza trung bình trong mẫu là: (14,25+15,43)/2=14,84%

nhận xét về kết quả thí nghiệm: kết quả thu được của 2 mẫu là tương đối gần nhau các
sai khác có thể xảy ra trong các quá trình chuẩn bị mẫu cũng như đo OD. Kết quả thu
được tương đối sát với thực tế chứng tỏ độ chính xác của phương pháp.

V,Phạm vi ứng dụng:

phương pháp DNS có thể được áp dụng để xác định chính xác hàm lượng Saccaroza có
trong mẫu trong phòng TN do có độ chính xác cao. Với mỗi loại đường khử thuốc thử
DNS sẽ cho màu sắc khác nhau do đó ứng với mỗi loại đường khử khác nhau có trong
mẫu thì ta cần xây dựng đường chuẩn khác nhau. Không nên sử dụng phương pháp để
xác định khả năng khử của hỗn hợp đường.