Bộ Công Thương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Khoa Công Nghệ Sinh Học
-------------

Môn: Thực Hành Công Nghệ Enzyme

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ ENZYME

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Nhóm 7: Võ Thị Cẩm Vân 2008160153
Trần Thị Hồng Vân 2008160154
Kiều Yến Vy 2008160163
 BÀI 1: ĐỘNG HỌC BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME.
XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME NEUTRASE

 Bảng phân công nhiệm vụ từng thành viên:

Đánh giá của NT

STT Họ và tên Nội dung công việc
(Cho điểm)

Tổng hợp, lập đường

1 Võ Thị Cẩm Vân Tốt
chuẩn Tyrosin

Xây dựng đồ thị

2 Trần Thị Hồng Vân lineweaver-burk, vẽ Tốt
đường chuẩn

Xây dựng đồ thị

3 Kiều Yến Vy Tốt
lineweaver-burk, tính toán
1.Nguyên tắc
Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis Km.
Tốc độ của phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong
môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hoà bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ lệ thuận
với nồng độ cơ chất.
Thí nghiệm này khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thuỷ phân casein của Neutrase
bằng cách thay đổi nồng độ casein từ 2.4-12 mM để tìm khoảng nồng độ casein mà trong
đó enzyme chưa bị bão hoà bởi cơ chất.
Xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thuỷ phân của enzyme và nồng độ cơ
chất theo phương trình Lineweaver-Burk.
1 1 𝐾𝑀 1
= + .
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆

Enzyme Neutrase là chế phẩm protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Neutrase chứa
các protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa lẫn
protease kiềm. Neutrase không chứa Î ±-amylase, enzyme có nhiệt độ thích hợp nhất từ
45-55oC và pH 5.5-7.5. Enzyme Neutrase được ứng dụng trong thuộc da, chất tẩy rửa,...
2.Nội dung thực hành:
2.1 Xác định thông số động học của enzyme phân giải đường (glucoamylase)
2.1.1Xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk:
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh dấu từ 0 đến 5 →cho Maltodextrin 20 vào từng ống ( lượng
dung dịch khác nhau ở mỗi ống ) → cho vào mỗi ống một lượng nước cất khác nhau
→bổ sung 5ml Glucoamylase 0,01 % vào mỗi ống → để yên ở 55oC 2 phút→đun sôi 3
phút→ làm nguội và lấy dịch lọc bên dưới→ từ dịch lọc mỗi ống nghiệm hút 1ml dịch
lọc sang ống nghiệm khác→ bổ sung 3ml thuốc thử DNS 1% → bịt đầu ống nghiệm bằng
giấy nhôm đun sôi 5 phút→làm lạnh→đo OD (Abs) tại =540nm→ ghi kết quả.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Maltodextrin 20 (mg/ml) 0 1 2 3 4 5

Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0

 Glucoamylase 0.01% ml 5

Để yên ở 55oC trong vòng 2 phút

Đun sôi trong 3 phút, làm nguội,lấy dịch lọc bên dưới

Dịch lọc (ml) 1

Thuốc thử DNS 1% 3

Dùng giấy nhôm bịt đầu ống nghiệm đun sôi 5 phút và làm lạnh

Đo OD(Abs) tại =540nm

2.1.2Lập đường chuẩn glucose:

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh dấu từ 0 đến 5 →cho Glucose 1mg/ml vào từng ống nghiệm
( lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống ) → cho vào mỗi ống một lượng nước cất khác
nhau → cho 3ml thuốc thử DNS 1% vào mỗi ống→dùng giấy nhôm bịt đầu ống nghiệm
đun sôi 5 phút→làm lạnh→đo OD (Abs) tại  = 540nm→xây dựng đường chuẩn glucose
biểu diễn sự tương quan giữa lượng glucose và OD.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Glucose (mg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Nước cất(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Thuốc thử DNS 1% (ml) 3

Dùng giấy nhôm bịt đầu ống nghiệm đun sôi 5 phút sau đó làm lạnh

Đo OD(Abs) tại =540nm

Dựng đường chuẩn glucose biểu diễn sự tương quan giữa lượng glucose và OD. Ống
0 là ống mẫu, các ống khác là ống thí nghiệm.
2.2 Xác định thông số động học của enzyme phân giải protein ( neutrase ):
2.2.1 Xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk:
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh dấu từ 0 đến 5→ cho casein 12nM với lượng khác nhau vào
mỗi ống nghiệm→ thêm vào mỗi ống một lượng đệm photphate khác nhau→ cho 5ml
enzyme Neutrase 2% vào mỗi ống→ để yên ở 50-55oC trong 2 phút→ thêm vào mỗi ống
5ml TCA 5%→ để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới→ từ dịch lọc ở mỗi ống nghiệm,
hút 5ml từ ống nghiệm đó sang ống nghiệm khác→ thêm vào 10ml NAOH 0.5N→ 1ml
Folin 1/3N→ lắc mạnh 30s , để yên trong 10 phút→ đo OD (Abs) tại =595nm→ ghi kết
quả.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Casein 12mM (ml) 0 1 2 3 4 5

Đệm photphate (ml) 5 4 3 2 1 0

Neutrase 2% (ml) 5

Lắc đều, để yên ở 50-55oC trong vòng 2 phút

TCA 5% (ml) 5

Lắc đều, để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Dịch lọc 5

NAOH 0.5N (ml) 10

Thuốc thử Folin 1/3N 1

Lắc mạnh, sau đó để yên trong 10 phút

Đo OD(Abs) tại =595nm

2.2.2 Lập đường chuẩn Tyrosine:

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh dấu từ 0 đến 5→ cho Tyrosine vào từng ống nghiệm
(lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống)→ cho vào mỗi ống một lượng HCl 0.2N khác
nhau→ bổ sung mỗi ống 10ml NAOH 0.5N→ bổ sung mỗi ống 1ml folin pha loãng 3
lần→ đo OD (Abs) tại =595nm→ xây dựng đường chuẩn tyrosine biểu diễn sự tương
quan giữa lượng tyrosine và OD.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Tyrosin (mM) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

HCl 0.2N (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0

NaOH 0.5N (ml) 10

Thuốc thử Folin 1/3 N 1

Lắc mạnh 30s, để yên trong 10 phút

Đo OD(Abs) tại =595nm

Dựng đường chuẩn tyrosine biểu diễn sự tương quan giữa lượng tyrosine và OD.
Ống 0 là ống mẫu, các ống khác là ống thí nghiệm.
3.Kết quả & giải thích kết quả:
3.1 Xác định thông số động học của enzyme phân giải đường (glucoamylase): ( lấy số
liệu của nhóm 4)
3.1.1 Lập đường chuẩn glucose:
 Hình 1: dung dịch sau khi cho thuốc thử DNS 1% vào

 Kết quả OD :
Nồng độ Glucose
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1mg/ml
OD tại =540 0 0.206 0.541 0.676 0.911 1.136

Đường chuẩn glucose

1.4 y = 1.1329x + 0.0119
R² = 0.9919
1.2
1
OD 540 nm

0.8
0.6 OD 540 nm
0.4 Linear (OD 540 nm)
0.2
0
0 0.5 1 1.5
Nồng độ glucose mg/ml

Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ sản phẩm và độ hấp thụ có dạng là:

y = 1.1329x + 0.0119
Trong đó: x là nồng độ sản phẩm

y là giá trị OD tại bước sóng 540nm

3.1.2 Xây dựng đồ thị LINEWEAVER-BURK

Hình 2 : Dung dịch sau khi cho thuốc thử DNS 1% vào
 Kết quả OD:

Maltodextrin 1 2 3 4 5
OD tại =540 3,638 4,69 5,095 5,365 6.5

 Xác định thông số động học Vmax và Km:

Dựa vào đồ thị chuẩn, tính lượng sản phẩm tương đương với giá trị OD.

Tính vận tốc phản ứng ở nồng độ cơ chất tương ứng:

dP 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚

𝑉= =
𝑑𝑡 𝑇ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑥ú𝑐 𝑡á𝑐

T=2 phút=120 giây

Giá trị Các ống nghiệm

 ống 1’ ống 2’ ống 3’ ống 4’ ống 5’
OD tại =540 3,638 4,69 5,095 5,365 6.5
Lượng sản phẩm (P) 3,2 4,129 4.487 4.725 5.726
Vận tốc phản ứng (V) 0,275 0.213 0.196 0.186 0.154
Bảng 1: Ghi nhận số liệu xác định vận tốc phản ứng:

Các ống nghiệm

Giá trị
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Nồng độ cơ
0.313 0.242 0.223 0.212 0.175
chất (S)
1
3.2 4.129 4.487 4.725 5.726
𝑆
Vận tốc phản
0,275 0.213 0.196 0.186 0.154
ứng (V)
1
3.638 4.69 5.095 5.365 6.5
𝑉
Bảng 2: Ghi nhận số liệu vẽ đồ thị Lineweaver – Burk:

Đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

7 y = 1.1055x + 0.0906
R² = 0.9913
6
5
4
1/V

3 1/V
2 Linear (1/V)
1
0
0 2 4 6 8
1/S

Theo phương trình Lineweaver-Burk:

1 1
Sừ dụng phần mềm Exel ta được phương trình biểu diễn theo :
𝑆 𝑉
y = 1.1055x + 0.0906, với R² = 0.9913, do đó:
𝐾𝑚
a = 1.1055 = (1)
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
b = 0.0906 = (2)
𝑉𝑚𝑎𝑥

Giai hệ phương trình (1) và (2) ta được Km = 12.203 M; Vmax = 11.038 (M-1).

3.2 Xác định thông số động học của enzyme phân giải protein ( neutrase ):

3.2.1 Lập đường chuẩn Tyrosine:

1
Hình 3 : Dung dịch sau khi cho thuốc thử Folin N vào
3
 Kết quả đo OD:

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Tyrosine (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
OD (595 nm) 0 0.13 0.73 0.76 0.85 1,51
 Đường chuẩn Tyrosine
1.6 y = 1.3914x - 0.0324
1.4 R² = 0.9096
1.2
1
OD 595 nm

0.8
OD 595nm
0.6
Linear (OD 595nm)
0.4
0.2
0
-0.2 0 0.5 1 1.5
Nồng độ Tyrosine mM

3.2.2 Xây dựng đồ thị LINEWEAVER- bURK

Hình 4: Dung dịch sau khi bổ sung TCA 5 %

 Hình 5: Dung dịch sau khi bổ sung Folin pha loãng 3 lần

 Kết quả đo OD:

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
OD( 540nm 0 0.55 1,07 1,24 1,93 2,1
Casein 12mM 0 1 2 3 4 5

Bảng: Lượng Tyrosine tương ứng từ kết quả đo OD

𝑑(𝑃) lượng Tyrosine
Tính vận tốc phản ứng (V) = =
𝑑𝑡 𝑡ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛

Kết quả được tính ghi vào bảng sau với thời gian 2 phút = 120 giây

Các ống nghiệm

Giá trị
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
OD (λ=540nm) 0.55 1.07 1.24 1.93 2.1
Lượng sản phẩm (P) 0.419 0.792 0.914 1.41 1.533
Vận tốc phản ứng (V) 1.818 0.935 0.806 0.518 0.476
Ghi nhận số liệu vẽ đồ thị Lineweaver – Burk

Các ống nghiệm

Giá trị
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
 Nồng độ cơ chất (S) 2.387 1.263 1.094 0.709 0.652
1/S 0.419 0.792 0.914 1.41 1.533
Vận tốc phản ứng (V) 1.818 0.935 0.806 0.518 0.476
1/V 0.55 1.07 1.24 1.93 2.1

Đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

2.5
y = 1.183x + 0.0443
R² = 0.9854
2

1.5
1/V

1/V
1
Linear (1/V)

0.5

0
0 0.5 1 1.5 2
1/S

 Xác định thông số động học Km và Vmax:

1 1
Dựa vào phương trình đồ thị tương quan giữa và
𝑆 𝑉

Ta có: y = 1.183x + 0.0443 với R2 = 0.9854 :

1 1 𝐾𝑀 1
Phương trình dạng: = + ×
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆

𝐾𝑚
a = 1.183 = (1)
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
b = 0.0443 = (2)
𝑉𝑚𝑎𝑥

Giai hệ phương trình (1) và (2) ta được Km = 26.704 (mM); Vmax = 22.573 (mol/phút).
3.Nhận xét:

Trong thí nghiệm này ta chọn phương pháp xác định biến thiên nồng độ sản phẩm tạo
thành thông qua xác định hàm lượng sản phẩm Tyrosine để xác định hàm lượng sản
phẩm Tyrosine để xác định tốc độ phản ứng của enzyme với cơ chất.

Khi enzyme chưa bảo hòa thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.

Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng là mối quan hệ tuyến tính

BÀI 2 : THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME TỪ THỰC
VẬT

 Bảng phân công nhiệm vụ từng thành viên:

 Đánh giá của NT
STT Họ và tên Nội dung công việc
(Cho điểm)

Tổng hợp, thu nhận và

1 Võ Thị Cẩm Vân tinh sạch bromelain từ thịt
trái dứa, tính toán

Xác định hoạt tính

bromelain theo phương
2 Trần Thị Hồng Vân
pháp Asson cải tiến, tính
toán

Xác định hàm lượng

3 Kiều Yến Vy protein theo phương pháp
Bradford, tính toán

1.MỤC ĐÍCH

-Thực hiện quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme bromelin từ thực vật.

-Hiểu nguyên tắc các phương pháp tinh sạch enzyme bromelin.

-Đánh giá mức độ tính sạch của enzyme bằng phương pháp điện di.
-Xác định hàm lượng protein, hoạt tính, hoạt tính riêng của enzyme bromelin.

2. CƠ SỞ LÍ THUYẾT

-Bromelin là tên gọi chung cho các enzyme phân giải protein chứa nhóm sulfhydryl được
tách chiết chủ yếu từ các mô của thực vật thuộc họ Bromeliaceae, tiêu biểu nhất là dứa.
Hai loại bromelin được công nhận là bromelin tách chiết từ thân ( stemvbromelin – SBM
–EC 3.4.22.32 ) và từ trái ( fruit bromelin – FMB – EC 3.4.22.33 ). Ngoài ra, bromelin
còn có thể được tách chiết từ phụ phẩm của dứa như vỏ, lõi, lá, chồi ngọn.
(Ketnawa,2011).

-Bromelin được tách chiết từ dứa bằng cách nghiền nhuyễn, xay, ly tâm loại bỏ các mảnh
vỡ tế bào. Sau đó, dịch enzyme thô được tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau
như kết tủa, trích ly hai pha lỏng, lọc màng, hệ thống micelle ngược ( reverse micellar
system ), các kỹ thuật sắc kí.

3. NỘI DUNG THỰC HÀNH

Dứa → gọt vỏ → ép → lọc ( bằng vải , bông ) → ly tâm ( 4000 vòng/ phút trong 15 phút
) → tủa amonium sulfate

- Xác định hoạt tính enzyme bromelain

-Xác định hàm lượng protein

-Xác định hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi, mức độ tinh sạch

3.1 Thu nhận, tinh sạch Bromelain từ thịt trái dứa

Dứa → gọt vỏ → ép → lọc ( bằng vải , bông ) → ly tâm ( 4000 vòng/ phút trong 15 phút
) → tủa amonium sulfate

3.1.1 Xử lý nguyên liệu

Chọn trái dứa còn xanh, tươi → gọt bỏ vỏ và lõi →ép lấy dịch → lọc dịch → xác định thể
tích dịch thu được V (ml)

3.1.2 Ly tâm

Ly tâm dịch dứa 4000 vòng / phút trong 15 phút → hút dịch nỗi vào cốc sạch → xác
định thể tích dịch thô thu được, hàm lượng protein, hoat tính bromelain, hoạt tính riêng

3.1.3 Kết tủa protein bằng muối amonium sulfate

Lấy 50ml dịch enzyme thô→cho từ từ (NH4)2SO4 vào→khuấy đều→để yên 60 phút→ly
tâm →xác định khối lượng tủa, hàm lượng protein,hoạt tính bromelain, hoạt tính riêng

3.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

3.2.1 Lập đường chuẩn albumin:

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5 → cho Albumin 100 µg/ml vào từng ống
nghiệm ( lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống) → cho vào mỗi ống một lượng nước
cất khác nhau → cho Albumin 0.01% vào từng ống (lượng dung dịch khác nhau cho mỗi
ống) → cho thuốc thử Bradford 2ml vào từng ống → lắc đều, để yên 10 phút → đo độ
hấp thụ ở bước sóng 595nm.

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
0 1 2 3 4 5
Albumin 100 µl/ml ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất ml 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Nồng độ albumin µl/ml 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử Bradfotd ml 2.0
Lắc đều. để yên 10 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm

3.2.2 Xác định hàm lượng protein:

Chuẩn bị hai ống nghiệm:

 Ống nghiệm 1: cho vào ống 1ml dung dịch enzyme và 2ml thuốc thử Bradford
 Ống nghiệm 2: (dùng để đối chứng) cho vào ống 1ml nước cất và 2ml thuốc thử
Braford

→ đem đo hấp thụ λ=595 nm và ghi nhận mật độ quang sau 2 phút → suy ra hàm lượng
protein

3.3 Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Asson cải tiến

Nguyên tắc: Bromelain là một enzyme thuộc nhóm protease. Khả năng thủy phân của
bromelain được thực hiện với cơ chất protein (hemoglobin, casein, albumin) tạo ra các
sản phẩm tan trong dung dịch TCA là các peptide có chứa tyrosin. Việc định lượng
tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân
của enzyme.
Cách tiến hành:

Chuẩn bị 3 ống nghiệm ghi chú lần lượt: ống tyrosin, ống mẫu và ống không → Cho
2,5ml dung dịch Hb 1% vào từng ống nghiệm → Để yên ở 35,50C trong 5 phút → Cho
lần lượt từng dung dịch Trichloacetic acid 5%, HCl 0,2N, Tyrosin 1/400N và Dịch
enzyme bromelain vào từng ống nghiệm ( lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống) →
Lắc đều, để yên ở 35,50C trong 10 phút → Cho lần lượt từng dung dịch Trichlororacetic
acid 5% và dịch enzyme bromelain vào từng ống nghiệm ( lượng dung dịch khác nhau
cho mỗi ống) → Lắc đều, để yên 10 phút ở 250C → Lọc.

Lấy 2,5ml dung dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm mới được ghi chú như trên → Cho
5ml NaOH 0,5N vào từng ống nghiệm → Cho 1ml thuốc thử Folin 1/3 → Lắc đều, để
yên trong 15 phút → Đo OD tại bước sóng 660nm.

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị Ống Ống
Ống mẫu
tyrosin không

Dung dịch Hb 1% ml 2,5 2,5 2,5

Để yên 35,50C trong 5 phút

Trichloacetic acid 5% ml 5,0 0,0 5,0

HCl 0,2N ml 0,0 0,5 0,5

Tyrosin 1/400N ml 0,5 0,0 0,0

Dịch enzyme
ml 0,0 0,5 0,0
bromelain

Lắc đều, để yên ở 35,50C trong 10 phút.

Trichlororacetic acid
ml 0,0 5,0 0,0
5%
 Dịch enzyme
ml 0,5 0,0 0,5
bromelain

Lắc đều, để yên 10 phút ở 250C. Lọc

Dung dịch lọc ml 2,5 2,5 2,5

NaOH 0,5N ml 5,0 5,0 5,0

Thuốc thử Folin 1/3 ml 1,0 1,0 1,0

Lắc đều, để yên 15 phút

Đo OD tại bước sóng 660nm ODT = ODM = ODC =

4. Kết quả và tính toán

4.1 Xác định hàm lượng protein

Hình 1 :dung dịch albumin

 Hình 2: dung dịch sau khi cho 2 ml thuốc thử Bradford vào

 Kết quả OD

Ống 0 1 2 3 4 5
OD 0 0.169 0.237 0.329 0.338 0.370

 Đường chuẩn albumin:

Đường chuẩn Albumin

0.45
y = 0.6997x + 0.0656
0.4
R² = 0.8826
0.35
0.3
OD 595nm

0.25
OD (595nm)
0.2
Linear (OD (595nm))
0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6
Nồng độ Albumin (μg/ml)

Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn albumin suy ra hàm lượng protein.
Giá trị OD đo được 1.645

 Hàm lượng protein thu được dựa vào phương trình đường chuẩn là:

1.645 = 0.6997 x + 0.0656

 x = 2.257(mg).

4.2 Xác định hoạt tính bromelain

Hình 3: dung dịch sau khi cho Hb 1% vào

Hình 4:dung dịch sau khi cho trichloacetic acid 5%,HCl 0.2 N, Tyrosin1/400N,dịch
enzyme bromelain vào

Hình 5 : Dung dịch sau khi cho trichlororacetic acid 5% và dịch enzyme
bromelain vào
 Hình 6 : Dung dịch sau khi lọc và cho thuốc thử folin vào

Hoạt tính enzyme bromelin được biểu thị là số μg tyrosin sinh ra do sự thủy phân
Hemoglobin của enzyme có trong 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa bromelin trong 1
phút ở 35,50C và pH = 6,0.

Hoạt tính này được tính theo công thức:

450∗ 𝛥𝑂𝐷𝑀 1 𝑋1
HT= * *
𝛥𝑂𝐷𝑇 10 𝑋2

Trong đó:

HT: hoạt tính enzyme bromelin (UI/ml).

X1: thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml).

X2: thể tích dung dịch chứa enzyme (ml).

Với ΔODc = 0

 ΔODT = ODT - ODC = 0,646 - 0,389 = 0,217

ΔODM = ODM - ODC = 0,606 - 0,389 = 0,257
 Ta có X1 = 0.5ml

X2 = 0.5ml

 HT = 37,996 (UI/ml).
 Xác định hoạt tính riêng bromelin

Hoạt tính riêng của bromelin được tính theo công thức
𝐻𝑇
HTR =
𝑚

Trong đó:

HTR: hoạt tính riêng của bromelin (UI/g).

HT: hoạt tính enzyme bromelin (UI/ml).

m: hàm lượng protein (g).

Với hàm lượng protein là 2.257 mg = 3.257x10-3 g

 HTR = 11665,95 (UI/g)

5. YÊU CẦU THẢO LUẬN
 Nguyên tắc sử dụng muối (NH4)2SO4 để tủa protein: khi bổ sung muối vào dung
dịch protein, muối sẽ lôi kéo các phân tử nước chen giữa các phân tử protein và các phân
tử protein sẽ tụ lại với nhau, sau đó tiến thành ly tâm lọc bỏ dịch nổi và thu cặn đáy.
 Nguyên tắc của quá trình thẩm tích: dịch chứa enzyme được đặt trong một túi
thẩm tích, túi thẩm tích được cấu tạo bằng màng bán thấm (thường là màng celophan) sau
đó túi thẩm buộc 2 đầu và được đặt vào trong một dung dịch đệm không chứa chất hòa
tan cần loại bỏ (nước cất). Chất hòa tan khếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng
độ từ cao đến thấp, chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau do đó
phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm, thỉnh thoảng phải thay dung dịch đệm. Dùng
dung dịch BaCl2 quan sát hiện tượng kết tủa để kết thúc quá trình thẩm tích.
 Dùng BaCl2 để thử dung dịch đệm, nếu có xuất hiện kết tủa thì quá trình thẩm tích
hoàn thành và ngược lại nếu chưa xuất hiện kết tủa thì tiếp túc quá trình thẩm tích.
 Loại muối dung dịch bromelin trước khi thực hiện sắc ký lọc gel vì: quá trình sắc
ký là loại bỏ các protein tạp trong dịch kết tủa protein. Quá trình sắc ký thực hiện với
những phân tử có kích thước nhỏ vài micromet mà khi tủa bằng muối có kích thước rất
lớn, vì vậy cần loại bỏ muối trước khi thực hiện sắc ký thì quá trình sẽ diễn ra nhanh hơn,
tiết kiệm thời gian và protein thu nhận được sau sắc ký sẽ tinh sạch hơn, không bị lẫn tạp
các protein khác.
 Giải thích các bước tiến hành đo hoạt tính bromelin:

Cho cơ chất protein là dung dịch hemoglobin 2% sau đó để yên trong 35,50C trong 5 phút
để biến tính protein bằng nhiệt độ. Sau đó cho trichloacetic acid 5%, HCl 0,2N, tyrosin
1/400N, dịch enzyme bromelin lắc đều, để yên 35,50C trong 10 phút đây là quá trình
enzyme bromelin thủy phân protein. Tiếp tục cho trichlororacetic 5%, dịch enzyme
bromelin, lắc đều để yên 10 ở 250C và lọc để tiếp tục quá trình thủy phân protein sau đó
lọc để loại bỏ cặn có những thành phần protein chưa thủy phân, enzyme dư. Dung dịch
lọc được cho thêm NaOH 0,5N và thuốc thử Folin1/3, NaOH là đệm kiềm để cho thuốc
thử Folin hoạt động tốt. Sau đó tiến hành đo OD và đọc kết quả.

BÀI 3 : THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME TỪ

ĐỘNG VẬT
 Bảng phân công nhiệm vụ từng thành viên:

Đánh giá của NT

STT Họ và tên Nội dung công việc
(Cho điểm)

Tổng hợp, lập đường

1 Võ Thị Cẩm Vân
chuẩn Tyrosin

Kết tủa protein bằng

2 Trần Thị Hồng Vân acetone,xác định hàm
lượng protein,tính toán

3 Kiều Yến Vy Xác định hoạt tính

 enzyme pepsin,khảo sát
khả năng độ đong tụ sữa

1. Nguyên tắc

Pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật do sự tự phân trong môi trường
acid loãng. Dung dịch dạng hoà tan có chứa pepsin dạng hoà tan và các thành phần
protein khác. Sự tinh sạch enzyme có thể thực hiện sau khi đã thu nhận được chế phẩm
enzyme tô nhờ vào các tác nhân gây tủa.

Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.4.23.1) phân giải được Hemoglobin thành
Tyrosine và Tryptophane hoà tan trong TCA. Xác định hàm lượng Tyrosine và
Tryptophane nhờ vào thuốc thử Folin-Ciocalteu.

2. Thu nhận dung dịch enzyme

Nguyên liệu: dạ dày cá ngừ mới giết mổ đã được xử lý thô bảo quản trong điều kiện
nhiệt độ thấp có mặt chloroform 5%. Bảo quan ttoois đa trong 48h, cân khối lượng niêm
mạc m1 (g).

Tự phân enzyme:

Niêm mạc thô Xay nhỏ trong dd Chậu thuỷ tinh

dạ dày HCl 0.5%

Đậy kín ở 40-42oC trong bể ổn Lọc qua vải (2-4 lần), Enzyme thô
định nhiệt, t=24-28h lọc qua bông

Thu chế phẩm pepsin:

T=1 giờ, 4oC,ly tâm tốc

Enzyme thô Cho từ từ acetone lạnh vào độ 5000 vòng/ phút
t=15 phút
(tỷ lệ 1:4),khuấy đảo nhẹ
 Cân khối lượng chế phẩm m2 (g)

Tác nhân là aceton: để khô tự nhiên (quạt gió) từ 3-4h.)

Bảo quản chế phẩm enzyme thu được trong điều kiện 0- 4oC

Hiệu suất chiết tách tính bằng công thức:

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎế 𝑝ℎẩ𝑚 (𝑚2 ) . 100%

𝑯=
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑛𝑖ê𝑚 𝑚ạ𝑐 𝑡ℎ𝑢 𝑛ℎậ𝑛 (𝑚1 )

3. Lập đường chuẩn Tyrosine

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5 → cho vào mỗi ống hàm lượng tyrosine
chuẩn 1mM khác nhau → thêm vào HCl 0.2 ml với lượng khác nhau vào mỗi ống →bổ
sung 10ml NaOH 0.5N vào mỗi ống →bổ sung 3ml folin pha loãng 3 lần vào mỗi ống
rồi đo OD với bước sóng 660nm

Ống 0 1 2 3 4 5
Tyrosine chuẩn 1mM 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
HCl 0.2N (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4
Lượng Tyrosine (μmol) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
NaOH 0.5N (ml) 10
Folin pha loãng 3 lần 3
Lắc mạnh, để yên 5-10 phút
Đo OD:  = 660nm
4. Xác định hoạt tính Pepsin trong mẫu chế phẩm Enzyme.

Chuẩn bị 3 ống nghiệm (1 ống đối chứng [ống 1], 1 ống enzyme tách chiết từ dạ dày heo
[ống 2], 1 ống enzyme công nghiệp [ống 3]) → cho 5 ml dung dịch Hb 2% ở 250C vào
các ống → cho 10 ml TCA 5% vào ống 2 và 3 → cho 0,1 dung dịch enzyme vào từng
ống → bổ sung 0,9 ml nước cất vào các ống → ống 2 và 3 để yên thời gian 10 phút sau
đó bổ sung 10 ml TCA 5% , ống 1 lắc đều để yên 30 phút → lọc lấy 5 ml dung dịch →
bổ sung 10ml NaOH 0,5N vào các ống → lắc đều → cho 3 ml Folin 1/3N vào từng ống
→ lắc đều để yên 5÷10 phút → đo OD tại λ = 660 nm

Các bước tiến hành thể hiện rõ ở bảng sau :

Các ống thí nghiệm

Hóa chất sử dụng Đơn vị Ống 2
Ống 1 Ống 3

Hb 2% ở 25 oC ml 5.0 5.0 5.0

TCA 5% ml 10 0 0

Enzyme pesine ml 0.1 0.1 0.1

Nước ml 0.9 0.9 0.9

Thời gian phút 0 10 10

TCA 5% ml 0 10 10

Lắc đều. Để yên 30 phút. Sau đó lọc lấy dung dịch

Hút 5ml dịch lọc từ hai ống nghiệm chuyển sang ống nghiệm mới tương ứng

NaOH 0.5N ml 10 10 10

Lắc đều

Foline 1/3N ml 3 3 3

Lắc đều.Để yên 5÷10 phút

Đo OD tại 660nm ODKC ODheo ODCN

5. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

5.1 Lập đường chuẩn Albumin

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5 → cho vào mỗi ống lượng albumin khác nhau
→ bổ sung vào mỗi ống lượng nước cất khác nhau →thêm vào mỗi ống 3 ml thuốc thử
Bradford → lắc đều →để yên 10 phút → đo OD bước sóng 595nm

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
0 1 2 3 4 5
Albumin 100 µl/ml ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất ml 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Nồng độ albumin µl/ml 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử Bradfotd ml 2.0
Lắc đều. để yên 10 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm

5.2 Xác định hàm lượng protein:

Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

 Ống nghiệm 1( enzyme tách chiết ): cho vào ống 1ml dung dịch enzyme tách chiết
và 2ml thuốc thử Bradford
 Ống nghiệm 2: (dùng để đối chứng) cho vào ống 1ml nước cất và 2ml thuốc thử
Braford

 Ống nghiệm 3 (enzyme công nghiệp ) : cho vào ống 1ml dung dịch enzyme công
nghiệp và 2 ml thuốc thử Bradford

→ đem đo hấp thụ λ=595 nm và ghi nhận mật độ quang sau 2 phút → suy ra hàm lượng
protein

6. Xác định hoạt độ đông tụ sữa

Hút 2ml sữa gầy 5% pha trong CaCl2 0.01 M vào ống nghiệm → đặt trong bể ổn nhiệt
370C trong 5 phút

Ống Đối chứng Pepsin công Pepsin tách Pepsin tách

nghiệp chiết từ dạ dày chiết từ dạ dày
heo cá
Dung dịch 1(ml) 2 2 2 2
Enzyme (ml) 0 0.2 0.2 0.2

Quan sát hiện tượng đông sửa theo thời gian.

7 .Kết quả và giải thích

7.1 Xác định hàm lượng protein

Dung dịch albumin sau khi cho thuốc thử Bradford vào

Ống nghiêm xác định hàm lượng protein

Đường chuẩn albumin:

 Kết quả OD

Ống 0 1 2 3 4 5
OD 0 0.169 0.237 0.329 0.338 0.370
 Đường chuẩn Albumin
0.45
y = 0.6997x + 0.0656
0.4
R² = 0.8826
0.35
0.3
OD 595nm

0.25
OD (595nm)
0.2
Linear (OD (595nm))
0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6
Nồng độ Albumin (μg/ml)

Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn albumin suy ra hàm lượng protein.

Giá trị OD đo được ở ống nghiệm chứa pepsin tách chiết là 0,980 và ống nghiệm chứa
pepsin công nghiệp là 0,228.

 Hàm lượng protein thu được dựa vào phương trình đường chuẩn là:
 Pepsin tách chiết

0,980= 0.6997 x + 0.0656

 x = 1,307 (mg).
 Pepsin công nghiệp

0,228= 0.6997 x + 0.0656

 x = 0,232 (mg).
7.2 Xác định hoạt tính emzyme pepsin
 Dung dịch sau khi cho folin 1/3 N vào

Đường chuẩn Tyrosin

0.35 y = 0.308x - 0.0017
R² = 0.9682
0.3

0.25

0.2
OD (660nm)
0.15
Linear (OD (660nm))
0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-0.05
Dung dịch trước khi lọc
 Dung dịch sau khi cho folin 1/3 N vào

Kết quả sau khi đo OD 2 ống nghiệm:

Ống 0 1 (thí nghiệm) 2 (thí nghiệm)

(kiểm chứng) (pepsin tách chiết) (pepsin công nghiệp)
OD 0 0.491 0.490

→ OD1 = ODTN1 - ODKC = 0.491 – 0 =0.491

→ OD2 = ODTN2 - ODKC = 0.490 – 0 =0.490

Từ đồ thị đường chuẩn ta suy ra lượng tyrosine trong phương trình:

y = 0.308x - 0.0017
y(∆OD1)+ 0.0017
→ x1(Tyrosine) =
0.308

0.491+ 0.0017
=
0.308
 = 1,6( mol)
y(∆OD2)+ 0.0017
→ x2(Tyrosine) =
0.308

0.490+ 0.0017
=
0.308

= 1,596( mol)

Hoạt tính pepsin được tính theo phương pháp Ansson biểu thị bằng số đơn vị
Ansson
𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛𝑒×3.2×1.82
HTC =
𝑡×𝑣
Trong đó: HTC: Số đơn vị hoạt độ Anson
v: thể tích dd đem xác định ( 0.1ml)
t: Thời gian thủy phân 10 phút
1.82 : hằng số giá trị cường độ màu ở 25oC

→ Hoạt tính enzyme pepsin tách chiết là:

1,6 ×3,2 ×1,82
HTC1 = = 9,3184
10 ×0,1

1,596 ×3,2 ×1,82

HTC2 = = 9,295
10 ×0,1

7.3 Hoạt độ đông tụ sữa

 Đông tụ sữa

 Kết quả thời gian đông tụ sữa

Đối chứng Pepsin công nghiệp Pepsin tách chiết từ Pepsin tách chiết từ
dạ dày heo dạ dày cá
0 30 phút 20 phút 20 phút

Hoạt độ đông tụ sữa được tính bằng công thức:

24 𝑆
MCA= ×
𝑡 𝐸
Trong đó: MCA là hoạt độ đông tụ sữa (U/ml).
t là thời gian đông tụ sữa (s).
S là thể tích sữa (ml)
E là thể tích enzyme (ml)
→ Hoạt độ đông tụ sữa của pepsin công nghiệp là:
24 𝑆 24 2
MCA= × = × = 0,133 (U/ml)
𝑡 𝐸 1800 0,2
→ Hoạt độ đông tụ sữa của pepsin tách chiết từ dạ dày heo là:
24 𝑆 24 2
MCA= × = × = 0,2 (U/ml)
𝑡 𝐸 1200 0,2
 → Hoạt độ đông tụ sữa của pepsin tách chiết từ dạ dày cá là:
24 𝑆 24 2
MCA= × = × = 0,2 (U/ml)
𝑡 𝐸 1200 0,2

8. Kết luận và kiến nghị

-Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định, có thể dễ dàng
bị biến tính. Do đó khi làm việc với enzyme phải chú ý tránh những điều kiện dễ làm
biến tính enzyme.
-Khi xử lý mẫu như cắt, thái, xoay nhỏ không dùng các dụng cụ đã bị rỉ sét để tránh ảnh
hưởng của các ion kim loại nặng mà dùng dụng cụ inox.
-Khi dùng dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa
bằng ly tâm lạnh sẽ tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn. Ở 1 số trường hợp, cần tiến
hành thí nghiệm 1 cách nhanh chóng để tránh hiện tượng giảm dần hoạt độ enzyme.

BÀI 4 :CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE

 Bảng phân công nhiệm vụ từng thành viên:

Đánh giá của NT

STT Họ và tên Nội dung công việc
(Cho điểm)

Tổng hợp, xác định thông

1 Võ Thị Cẩm Vân số động học của enzyme
tự do, tính toán

Xác định hoạt tính của

2 Trần Thị Hồng Vân enzyme tự dó và cố định,
vẽ đường chuẩn

Cố định enzyme glucose

3 Kiều Yến Vy oxidase, xây dựng đường
chuẩn glucose
1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
- Glucose oxidase là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa 𝛽-D-glucose thành acid gluconic
với oxi là chất nhận điện tử và tạo ra hydro peroxide (H2O2)
- Enzyme glucose oxidase thường được thu nhận từ nấm mốc Penicillium notatum,
Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger.
- Ứng dụng của enzyme glucose oxidase được dùng làm thuốc thử xác định lượng
glucose có trong nước tiểu để phất hiện bệnh tiểu đường, sản xuất túi khử oxy để bảo
quản thực phẩm.
- Enzyme cố định là enzyme hòa tan được gắn vào chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau. Enzyme cố định có ưu điểm là có thể tái sử dụng nhiều lần, không bị lẫn vào sản
phẩm cuối.
2. NỘI DUNG THỰC HÀNH
2.1 Cố định enzyme glucose oxidase
- Pha dung dịch sodium alginate 3%( dung dịch A)

- Pha dung dịch enzyme GOD 1% ( đệm acetate PH 5.6 ) ( dung dịch B)

- Trộn dung dịch A và B theo tỉ lệ 1:1 được dung dịch C

→ Dùng bơm kim tiêm hút 1ml dung dịch C nhỏ từng giọt vào cốc chứa 30ml CaCl2
2%→ngâm trong 30 phút→lọc thu hạt enzyme cố định →rửa hạt bằng 5ml nước cất →
nước rửa
 Hình 1: dung dịch nước rửa

2.2 Xây dựng đường chuẩn của D-glucose

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 → cho glucose 0.09% với lượng khác
nhau vào mỗi ống → bổ sung đệm acetate PH 5.6 vào mỗi ống với lượng khác nhau .

Bảng 1 : chuẩn bị các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose

Ống 1 2 3 4 5 6
Glucose 0.09% (ml) 0 1 2 3 4 5
Đệm acetate PH 5.6(ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ glucose 0 1 2 3 4 5

Lấy 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào 6 ống nghiệm tương ứng khác→
thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS 1%→dùng giấy nhôm bịt kín đầu ống
nghiệm→đun sôi 5 phút→làm lạnh→đo hấp thu ở bước sóng 540nm ( mẫu trắng pha từ
ống đối chứng )

2.3 Xác định hoạt tính enzyme tự do và enzyme cố định

Chuẩn bị 3 ống nghiệm được ghi chú lần lượt là: Đối chứng, Enzyme tự do và Enzyme
cố định → Cho lần lượt Glucose 0,09% vào 3 ống nghiệm tương ứng ( lượng dung dịch
khác nhau cho mỗi ống) → Cho lần lượt Acetate pH=5,6 vào 3 ống nghiệm tương ứng (
lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống) → Cho lần lượt Enzyme GOD vào 3 ống
nghiệm tương ứng ( lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống) → Để yên 30 phút ở 300C
→ Lọc loại bỏ hạt đối với ống Enzyme cố định → Đun sôi trong 3 phút.
Cho 2ml thuốc thử DNS 1% vào từng ống nghiệm → Đun sôi 5 phút, làm lạnh đến
nhiệt độ phòng → Đo OD tại bước sóng 540nm.
Bảng 2 : chuẩn bị các ống nghiệm xác định hoạt tính enzyme tự do và cố định

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị Enzyme tự
Đối chứng Enzyme cố định
do
 Glucose 0,09% ml 0 1,6 1,6

Acetate pH=5,6 ml 1 0,4 0,4

𝜇𝑚𝑜𝑙
Nồng độ glucose
/ml

m hạt = 1ml
Enzyme GOD 0 1ml GOD 1% GODTD =
0,9754g

Để yên trong 30 phút ở 300C. Lọc

Dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 3 phút

Thuốc thử DNS

ml 2,0
1%

Đun sôi trong 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng

Đo OD tại bước sóng 540nm ODKC = ODM1 = ODM2 =

𝜇𝑚𝑜𝑙
Lượng glucose (x) 0 x1 x2
/ml

2.4 Xác định hàm lượng protein

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5 → cho Albumin 100 µg/ml vào từng ống
nghiệm ( lượng dung dịch khác nhau cho mỗi ống) → cho vào mỗi ống một lượng nước
cất khác nhau → cho Albumin 0.01% vào từng ống (lượng dung dịch khác nhau cho mỗi
ống) → cho thuốc thử Bradford 2ml vào từng ống → lắc đều, để yên 10 phút → đo độ
hấp thụ ở bước sóng 595nm.
Bảng 3: chuẩn bị các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn albumin

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
0 1 2 3 4 5
Albumin 100 µl/ml ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất ml 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Nồng độ albumin µl/ml 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử Bradfotd ml 2.0
Lắc đều. để yên 10 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm

Chuẩn bị 3 ống nghiệm được ghi chú lần lượt là: Ống 0, Enzyme tự do và Nước rửa
→ Cho 1ml nước cất vào Ống 0 → Cho 1ml mẫu cần xác định protein vào hai ống
nghiệm Enzyme tự do và Nước rửa → Cho 2ml thuốc thử Bradford vào cả 3 ống nghiệm
→ Lắc đều, để yên 20 phút → Đo OD tại bước sóng 595nm, Ống 0 làm mẫu trắng.

Bảng 4: chuẩn bị các ống nghiệm xác định hàm lượng protein

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị Enzyme tự
Ống 0 Nước rửa
do

Nước cất ml 1 0 0

Mẫu cần xác định 1ml enzyme

1ml nước rửa
protein tự do

Thuốc thử Bradford ml 2,0

Lắc đều, để yên 20 phút, đo OD tại bước sóng 595nm

Lượng protein (x) 𝜇𝑔 /ml x3 x4

2.5 Xác định thông số động học của enzyme tự do

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5→cho glucose 0.09% với lượng khác nhau vào
mỗi ống→tiếp tục cho vào mỗi ống đệm acetate PH 5.6 với lượng khác nhau→được nồng
độ glucose tương ứng→bổ sung 1ml GOD 1% vào mỗi ống→để yên 5 phút→dừng phản
ứng bằng cách đun sôi 3 phút→lọc lấy 1ml dịch→bổ sung 3ml thuốc thứ DNS 1% vào
mỗi ống →tiếp tục đun sôi 5 phút→làm lạnh→ đo OD ở bước sóng 540nm.

Bảng 5 :chuẩn bị các ống nghiệm xác định thông số động học của enzyme tự do

Ống 0 1 2 3 4 5
Glucose 0.09% 0 1 2 3 5 5
Đệm acetate PH 5.6 5 4 3 2 1 0
Nồng độ glucose 0 1 2 3 4 5
GOD 1% 1 1 1 1 1 1
Để yên trong 5 phút ở 37 C0

Dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 3 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Dịch lọc 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử DNS 1% 3 3 3 3 3 3
Đun sôi trong 5 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng
Đo OD với bước sóng 540 nm

2.6 Xác định thông số động học của enzyme cố định

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 5→cho glucose 0.09% với lượng khác nhau
vào mỗi ống→tiếp tục cho vào mỗi ống đệm acetate PH 5.6 với lượng khác nhau→được
nồng độ glucose tương ứng→bổ sung 1ml GOD cố định vào mỗi ống→để yên 5
phút→dừng phản ứng bằng cách đun sôi 3 phút→lọc lấy 1ml dịch→bổ sung 3ml thuốc
thứ DNS 1% vào mỗi ống →tiếp tục đun sôi 5 phút→làm lạnh→ đo OD ở bước sóng
540nm.

Bảng 6 :chuẩn bị các ống nghiệm xác định thông số động học của enzyme cố
định

Glucose 0.09% 0 1 2 3 5 5
Đệm acetate PH 5.6 5 4 3 2 1 0
Nồng độ glucose 0 1 2 3 4 5
GOD cố định 1 1 1 1 1 1
Để yên trong 5 phút ở 37 C0

Dừng phản ứng bằng cách đun sôi trong 3 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Dịch lọc 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử DNS 1% 3 3 3 3 3 3
Đun sôi trong 5 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng
 Đo OD với bước sóng 540 nm

3.KẾT QUẢ

3.1 Đường chuẩn glucose

Hình 2: Dung dịch sau khi cho thuố thử DNS 1% vào và đun sôi 5 phút

 Kết quả OD:

Ống 1 2 3 4 5 6
Nồng độ glucose 0 1 2 3 4 5
OD(540nm) 0 0.224 0.523 0.798 1.049 1.345

 Đường chuẩn glucose :

 Đường chuẩn Glucose
1.6 y = 0.2832x - 0.0382
1.4 R² = 0.9945

1.2
1
0.8 OD (540nm)
0.6 Linear (OD (540nm))
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6
-0.2

3.2 Xác định hoạt tính của enzyme tự do và enzyme cố định

Hình 3: dung dịch sau khi thêm enzyme GOD

 Hình 4: dung dịch sau lọc và cho thuốc thử DNS 1% vào

Đơn vị Đối chứng Enzyme tự Enzyme cố

do định

Nồng độ 𝜇mol/ml 0 1,6 1,6

glucose

OD540nm 0 1.978 0.939

Lượng 𝜇mol/ml 0 7.12 3.45

glucose(x)

Dựa vào đường chuẩn glucose y = 0.2832x – 0,0382 với R2 = 0,9945 với y là giá trị
OD540nm và x là nồng độ glucose. Suy ra được nồng độ glucose của enzyme tự do và
enzyme cố định.

- Hoạt tính của enzyme tự do:

 𝑈𝐼 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢−𝑥1
A( )= = -0.184
𝑚𝑙 𝑡ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑝ℎả𝑛 ứ𝑛𝑔

- Hoạt tính của enzyme cố định

𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢−𝑥2
B(UI/g)= = - 0.062
𝑡ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑝ℎả𝑛 ứ𝑛𝑔

- Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme

𝐵∗𝑚
H= = 0.329
𝐴∗𝑉1

Trong đó:
H: Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme
m: Khối lượng hạt enzyme cố định thu được(g)
V1: Thể tích dung dịch enzyme GOD tự do(ml)
3.3 Xác định hàm lượng protein

Hình 5: dung dịch Albumin

 Kết quả OD đường chuẩn albumin:
Ống 0 1 2 3 4 5

OD 0 0.169 0.237 0.329 0.338 0.370

 Hình 6: dung dịch sau khi cho thuốc thử Bradford vào

Đối chứng Enzyme tự do Nước rửa

OD595nm 0 1.559 0.237

 Lượng 0 2.13 0.25
protein(x)

Dựa vào đường chuẩn albumin( đã dựng ở bài 2) y= 0,6997x+0,0656 với y là giá trị
OD595nm và x là nồng độ protein
- Hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme tự do:
Y1(mg protein)=X3xV1x10-3=2.13x10-3
- Hàm lượng protein có trong dung dịch nước rửa:
Y2(mg protein)=X4xV2x10-3=0.25x10-3
- Hàm lượng protein có trong hạt enzyme cố định:
Y(mg protein)=Y1-Y2=(2.13x10-3)-(0.25x10-3)=1.88x10-3
Trong đó;
V1: Thể tích dung dịch enzyme GOD đem đi cố định(ml)
V2: Thể tích dung dịch nước rửa(ml)
3.4 Xác định các thông số động học của enzyme cố định và enzyme tự do
3.4.1 Enzyme tự do

Hình 7 : dung dịch sau khi cho GOD 1% vào

 Hình 8 : dung dịch sau lọc và cho thuốc thử DNS 1% vào

Dựa vào đồ thị chuẩn, tính lượng sản phẩm tương đương với giá trị OD.

Tính vận tốc phản ứng ở nồng độ cơ chất tương ứng:

dP 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚

𝑉= =
𝑑𝑡 𝑇ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑥ú𝑐 𝑡á𝑐

T=5 phút=300 giây

Giá trị Các ống nghiệm

ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5
OD tại =540 0.376 0.600 1.028 1.242 1.455
Lượng sản phẩm (P) 1.463 2.254 3.765 4.520 5.273
Vận tốc phản ứng (V) 0.005 0.008 0.013 0.015 0.018
Bảng 7: Ghi nhận số liệu xác định vận tốc phản ứng:

Các ống nghiệm

Giá trị
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
 Nồng độ cơ
1 2 3 4 5
chất (S)
1
1 0.5 0.33 0.25 0.2
𝑆
Vận tốc phản 0.005 0.008 0.013 0.015 0.018
ứng (V)
1
200 125 76.92 66.67 55.57
𝑉
Bảng 8: Ghi nhận số liệu vẽ đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

250
y = 181.75x + 21.953
R² = 0.9862
200

150
1/V

100

50

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
1/S

1 1
Sừ dụng phần mềm Exel ta được phương trình biểu diễn theo :
𝑆 𝑉

y = 181.75x + 21.953, với R² = 0.9862, do đó:

𝐾𝑚
a = 181.75 = (1)
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
b = 21.953 = (2)
𝑉𝑚𝑎𝑥

Giai hệ phương trình (1) và (2) ta được Km = 8.28 M; Vmax = 0.05(M-1).

 3.4.2 Enzyme cố định ( lấy số liệu nhóm 3 )

Hình 9 : dung dịch sau khi cho GOD cố định vào

Dựa vào đồ thị chuẩn, tính lượng sản phẩm tương đương với giá trị OD.

Tính vận tốc phản ứng ở nồng độ cơ chất tương ứng:

dP 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚

𝑉= =
𝑑𝑡 𝑇ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑥ú𝑐 𝑡á𝑐

T=5 phút=300 giây

Giá trị Các ống nghiệm

ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5
OD tại =540 0.446 0.883 1.448 1.875 2.572
Lượng sản phẩm (P) 1.710 3.253 5.248 6.756 9.217
Vận tốc phản ứng (V) 0.006 0.011 0.017 0.023 0.031
Bảng 9: Ghi nhận số liệu xác định vận tốc phản ứng:

Các ống nghiệm

Giá trị
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
 Nồng độ cơ
1 2 3 4 5
chất (S)
1
1 0.5 0.33 0.25 0.2
𝑆
Vận tốc phản 0.006 0.011 0.017 0.023 0.031
ứng (V)
1
166.67 90.91 58.82 43.48 32.26
𝑉
Bảng 10: Ghi nhận số liệu vẽ đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

Đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V

180
y = 166.09x + 2.6928
160
R² = 0.996
140
120
100
1/V

80
60
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
1/S

1 1
Sừ dụng phần mềm Exel ta được phương trình biểu diễn theo :
𝑆 𝑉

y = 166.09x + 2.6928, với R² = 0.996, do đó:

𝐾𝑚
a = 166.09 = (1)
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
b = 2.6928 = (2)
𝑉𝑚𝑎𝑥

Giai hệ phương trình (1) và (2) ta được Km = 61.68 M; Vmax = 0.37 (M-1).

3. THẢO LUẬN
 -Khối lương phân tử của enzyme glucose oxidase là 192000 Dalton, glucose oxidase
hoạt động trong khoảng pH 2,7-8,5, nhiệt độ tối ưu trong khoảng 30-500C, nếu nâng nhiệt
độ đến 800C trong 2 phút thì enzyme bị biến tính.

-Khi nhỏ dung dịch C vào trong dung dịch CaCl2 thì có sự tạo thành các hạt gel:
enzyme được hòa tan trong dung dịch sodium alginate, sau đó dung dịch gel này được
polyme hóa với sự có mặt của tác nhân tạo mạng lưới nên khi nhỏ dung dịch C vào CaCl2
sẽ tạo khối dưới dạng viên có đường kính trung bình là 3-4mm.

-Hạt enzyme cố định được có dạng hình cầu

-So sánh hoạt tính enzyme tự do và enzyme cố định

Hoạt tính của enzyme cố định nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do vì:

Ảnh hưởng của điện tích chất mang: Khi gắn enzyme vào chất mang thì cấu trúc
enzyme có sự thay đổi nên sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản ứng xảy ra
yếu hơn.

Do enzyme bị nhốt vào trong gel: Khi nhốt enzyme vào trong gel, gel sẽ bao lấy phân
tử enzyme tạo thành một vật cản đối với cơ chát của enzyme. Do đó, sự tiếp xúc giữa
trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất gặp khó khăn hơn so với sự tiếp xúc giữa cơ
chất với enzyme tự do.

BÀI 5 : THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME TỪ THỰC
VẬT( tiếp theo bài 2 )

 Bảng phân công công việc

Đánh giá của NT

STT Họ và tên Nội dung công việc
(Cho điểm)

1 Võ Thị Cẩm Vân Tổng hợp,xác định hàm

 lượng protein

Hứng phân đoạn, tính

2 Trần Thị Hồng Vân
toán

Xác định hoạt tính

3 Kiều Yến Vy
Bromelain

I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT:
Bromelin là tên gọi chung cho các enzyme phân giải protein chứa nhóm sulfhydryl
được tách chiết chủ yếu từ các mô của thực vật thuộc họ Bromeliaceae, tiêu biểu nhất là
dứa. Hai loại bromelin được công nhận là bromelin tách chiết từ thân ( stemvbromelin –
SBM –EC 3.4.22.32 ) và từ trái ( fruit bromelin – FMB – EC 3.4.22.33 ). Ngoài ra,
bromelin còn có thể được tách chiết từ phụ phẩm của dứa như vỏ, lõi, lá, chồi ngọn.
(Ketnawa,2011).

Bromelin tách chiết từ thân có trọng lượng phân tử trong khoảng 26- 37 kDa, hoạt
động tốt trong khoảng pH tối ưu 6-7 và khoảng nhiệt độ tối ưu 50-600C. Trong khi đó,
bromelin tách chiết từ trái có trọng lượng phân tử trong khoảng 24,5- 32 kDa, hoạt động
tốt trong khoảng pH tối ưu 3-8 và khoảng nhiệt độ tối ưu 37-700C. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của bromelin có sự chênh lệch nhỏ, bromelin
trong phân tử khoảng 23,4-35,73 kDa, trong tái khoảng 31kDa, ngoài ra ở dứa còn có các
loại protease khác như ananain (23,42-23,43 kDa), cososain (23,56-24,51 kDa). Điểm
đẳng điện của bromelin trong thân và trái lần lượt ở pH = 9,5 và 4,6. Bromelin được bảo
quản ở -200C vẫn giữ nguyên hoạt tính trong thời gian nhất định.

Bromelin được tách chiết từ dứa bằng cách nghiền nhuyễn, xay, ly tâm loại bỏ các
mảnh vỡ tế bào. Sau đó, dịch enzyme thô được tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác
nhau như kết tủa, trích ly hai pha lỏng, lọc màng, hệ thống micelle ngược ( reverse
micellar system ), các kỹ thuật sắc kí.

Với hoạt tính phân giải protein tốt, bromelin được ứng dụng thương mại rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm và đồ uống, làm mềm thịt, trong mỹ phẩm cũng như dệt
may. Bên cạnh đó, bromelin được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong trị liệu như khả
năng ức chế ngưng tụ tiểu huyết cầu, chống phù nề, chống huyết khối và tiêu sợ huyết,
kháng viêm, chống hoạt động khối u, tăng cường hấp thu các loại thuốc, hỗ trợ tiêu
hóa,tăng cường làm lành vết thương,...

II. NỘI DUNG THỰC HÀNH:

1. Thẩm tích:

Mục đích: loại muối (NH4)2SO4 khỏi dịch tủa protein.

Cách tiến hành:

 Hút dịch enzyme cho vào túi thẩm tích, kép chặt hai đầu túi.
 Treo túi thẩm tích chứa dịch enzyme ngập trong cốc 1000ml lạnh chứa nước cất.
 Thực hiện thẩm tích: đặt cốc trêm máy khuấy từ ở nhiệt độ 0-40C. Cứ sau 30 phút,
thay nước cất, đồng thời hút 500μl dịch trong cốc cho vào 200μl BaCl2 5%, quan sát hiện
tượng kết tủa để kết thúc quá trình thẩm tích (thòi điểm không tạo kết tủa).
2. Sắc ký lọc gel:

Mục đích: loại bỏ các protein tạp trong dịch kết tủa protein.

Cách tiến hành:

Nguyên tắc

Kỹ thuật lọc gel Sephadex dùng để tách các phân tử có kích thước và trọng lượng
phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ
nhỏ lọt vào bên trong lỗ gel thì bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi đó những
phân tử lớn hơn nằm kẹt ở các kẽ hở giữa các hạt gel sẽ di chuyển nhanh hơn và được
giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ
 Cột gel sephadex
 Ống nghiệm (được tẩy trùng bằng sulfo-cromic và sấy khô)

Hóa chất

 Dung dịch NaN3 0,02%

 Gel Sephadex G50: cân lượng gel khô thích hợp (1g gel khô nở khoảng 12-15ml)
ngâm trong 500 ml NaN3 0,02% trong 2h để gel trương nở hoàn toàn sau đó mới nhồi
vào cột
 Dung dịch đệm phosphate pH 7,6: trộn 1770 ml dung dịch Na2 HPO4 1/15M và 230 ml
dung dịch KH2PO4 1/15M. Đo và chỉnh lại pH cho đúng.

Tiến hành thí nghiệm

- Cân 1,5g gel G50 bỏ vào cột sắc kí

- Pha NaN3 0,02 % ( cân 1g pha thành 500 ml)
- Cho gel vào cột sắc kí đổ NaN3 vào ngâm gel

Chuẩn bị cột

Rửa cột bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, để
khô.
Cho vào đáy cột 1 lớp bông gòn thủy tinh và lớp giấy lọc bên trên để tạo mặt phằng.

Nhồi gel vào cột

Đóng khóa cột. Dùng becher cho từ từ dung dịch gel ngâm trong NANO3 0,02% vào
cột. Gel cho vào cột phải liên tục tránh hiện tượng phân lớp.

Khi gel đã cao hơn 10cm có thể mở khóa từ từ để cho lượng nước dư trong gel chảy
bớt đi. Tiếp tục nhồi cột cho đến khi lớp gel cao khoảng 4/5 chiều dài cột.

Sau khi nhồi cột xong, cắt miếng giấy lọc đặt lên mặt gel nhằm tránh hiện tượng xáo
trộn bề mặt gel khi cho mẫu vào cột.
 Cho dung dịch đệm vào để chạy ổn định cột trong 15-20 phút. Chỉnh tốc độ dòng
khoảng 2ml/6-8phút.

Nạp mẫu vào cột

Chọn mẫu Bromelain thu ở phần I có hoạt tính riêng cao để tiếp tục tinh sạch qua cột
gel Sephadex, trước khi nạp vào cột chỉnh lại nồng độ protein cho thích hợp khoảng 1-
1,5mg/ml.
Hút 0,5ml dịch Bromelain cho vào cột theo một trong hai cách:
Cách 1: Đưa mẫu vào dòng dung môi. Tức là đợi lớp dung dịch bên trên vừa chạm
mặt gel, ta dùng pipet cho lượng thể tích mẫu cần thiết vào cột.
Cách 2: Đợi lớp dung dịch bên trên vừa chạm bề mặt gel. Khóa cột. Cho lượng mẫu
cần thiết vào cột. Mở khóa cho dung dịch chạy tiếp.

Thu mẫu

Khi mẫu enzym vừa thấm hết vào bề mặt gel, cho dung dịch đệm liên tục vào cột gel
để rửa giải. Dịch rửa giải bên dưới sẽ được hứng vào các ống nghiệm. Hứng 3 ống
nghiệm, mỗi ống 3ml. Đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp Braford và
hoạt tính Bromelain theo phương pháp Anson.

3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:

- Lấy 3 ống nghiệm có 1ml dịch enzyme rửa giải của mỗi phân đoạn → cho 2ml
Bradford
- Ống đối chứng chứ 1ml nước cất và 2ml Bradford
- Đem đo OD với bước sóng 595nm và ghi nhận kết quả sau 2 phút
- Từ giá trị OD, dựa vào đường chuẩn albumin suy ra hàm lượng protein
4. Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Ansson cải tiến:

Nguyên tắc: bromelin là một enzyme thuộc nhóm protease. Khả năng thủy phân của
bromelin được thực hiện với cơ chất protein (hemoglobin, casein, albumin) tạo ra các sản
phẩm tan trong dung dịch TCA là các peptide có chứa tyrosin. Việc định lượng tyrosin
bằng pahnr ứng maufvoiws thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân của
enzyme.
Cách tiến hành: chuẩn bị 9 ống nghiệm theo bảng sau.

Các ống nghiệm

Hóa chất Đơn vị
ống tyrosin ống mẫu ống không

Dung dịch Hb 2% ml 2,5 2,5 2,5

Để yên 35,50C trong 5 phút

Trichloacetic acid 5% ml 5,0 0 5,0

HCl 0,2N ml 0 0,5 0,5

Tyrosin 1/400N ml 0,5 0 0

Dịch enzyme bromelin ml 0 0,5 0

Lắc đều, để yên ở 35,50C trong 10 phút.

Trichlororacetic acid
ml 0 5 0
5%

Dịch enzyme bromelin ml 0,5 0 0,5

Lắc đều, để yên 10 phút ở 250C. Lọc

Dung dịch lọc ml 2,5 2,5 2,5

NaOH 0,5N ml 5 5 5

Thuốc thử Folin 1/3 ml 1 1 1

Lắc đều, để yên 15 phút

Đo OD tại bước sóng 578nm hoặc

ODT ODM ODC
660nm

Bảng 1: Chuẩn bị các ống nghiệm đo hoạt tính bromelin

Ống mẫu ta làm 6 ống nghiệm với các phân đoạn 4 , 5, 6, 7, 8, 9.

Tính kết quả:

 Hoạt tính enzyme bromelin được biểu thị là số μg tyrosin sinh ra do sự thủy phân
Hemoglobin của enzyme có trong 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa bromelin trong 1
phút ở 35,50C và pH = 6,0.

Hoạt tính này được tính theo công thức:

450∗ 𝛥𝑂𝐷𝑀 1 𝑋1
HT= * *
𝛥𝑂𝐷𝑇 10 𝑋2

Trong đó:

HT: hoạt tính enzyme bromelin (UI/ml).

X1: thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml).

X2: thể tích dung dịch chứa enzyme (ml).

ΔODT = ODT - ODC

ΔODM = ODM - ODC
5. Xác định hoạt tính riêng bromelain

Hoạt tính riêng của bromelain được tính theo công thức sau :
𝐻𝑇
HTR =
𝑚

Trong đó:

HTR : Hoạt tính riêng của bromelain ( UI/g)

HT : Hoạt tính enzyme bromelain ( UI/g )

m : Hàm lượng protein ( g)

6. Xác định hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch ( puritrification fold )

Ta chọn phân đoạn 4 để tính hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch do các phân
đoạn khác
Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của bromelain được tính theo công thức
𝐻𝑇𝑡𝑠
P= × 100
𝐻𝑇𝑡ℎ

Trong đó :

P : Hiệu suất thu hồi ( %)

HTts : hoạt tính bromelain sau khi tinh sạch ( UI/ ml)

HTth : hoạt tính bromelain trong dịch enzyme thô ( UI/ ml)
𝐻𝑇𝑅𝑡𝑠
PS =
𝐻𝑇𝑅𝑡ℎ

Trong đó :

PS : Mức độ tinh sạch

HTRts : hoạt tính riêng bromelain sau khi tinh sạch ( UI/ ml)

HTRth : hoạt tính riêng bromelain trong dịch enzyme thô ( UI/ ml)

III. KẾT QUẢ VÀ TÍNH TOÁN:

1. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:
 Kết quả OD

Ống 0 1 2 3 4 5
OD 0 0.142 0.264 0.387 0.425 0.552
 Đường chuẩn Albumin
0.6
y = 1.0663x + 0.0284
R² = 0.9811
0.5

0.4
OD 595 nm

0.3 OD (595nm)
Linear (OD (595nm))
0.2

0.1

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Nồng độ Albumin (μg/ml)

Phân 1 2 3 4 5 6 7 8 9
đoạn
OD 0,171 0,281 0,553 0,883 0,551 0,574 0,353 0,416 0,024
Bảng 3: kết quả đo OD của các phân đoạn

Dựa vào đường chuẩn ta tính được hàm lượng protein trong từng phân đoạn như sau:

Phân đoạn 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hàm lượng 0,134 0,237 0,492 0,802 0,490 0,512 0,304 0,363 -4,126×10-3
protein

2. Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Ansson cải tiến:

Phân đoạn ODC ODM ODT

4 0 0,248 0,308

5 0 0,479 0,453

6 0 0,053 0,178
7 0 0,088 0,188

8 0 0,602 0,283

9 0 0,681 0,343

Bảng 2: Kết quả đo hoạt tính bromelin

 Ống nghiệm chuẩn bị đo hoạt tính từ phân đoạn 4 đến phân đoạn 9

Ta có:

ΔODT = ODT - ODC

ΔODM = ODM - ODC

Phân 4 5 6 7 8 9
đoạn
∆ ODT 0,308 0,435 0,178 0,188 0,283 0,343
∆ ODM 0,248 0,479 0,053 0,088 0,602 0,681
Hoạt tính này được tính theo công thức :
450 × ∆ ODM 1 𝑋1
HT = × ×
∆ ODT 10 𝑋2

Trong đó

HT : hoạt tính enzyme bromelain ( UI/ ml)

X1 : Thể tích dung dịch tyrosin chuẩn ( ml) (X1= 0,5 )

X2 : Thể tích dung dịch chứa enzyme ( ml) ( X2= 0,5 )

Phân đoạn 4 5 6 7 8 9
HT ( UI/ ml) 36.23 47.58 13.40 21,06 95,72 89,34

3. Xác định hoạt tính riêng bromelain

Ta có:
𝐻𝑇
HTR =
𝑚

Trong đó:

HTR : Hoạt tính riêng của bromelain ( UI/g)

HT : Hoạt tính enzyme bromelain ( UI/g )

m : Hàm lượng protein ( g)

Phân 4 5 6 7 8 9
đoạn
HTR 69684,539 86851,02 310971,193 69289,474 262978,022 - 2165390,08

4. Xác định hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch ( puritrification fold )

Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của bromelain được tính theo công thức
𝐻𝑇𝑡𝑠
P= × 100
𝐻𝑇𝑡ℎ

Trong đó :

P : Hiệu suất thu hồi ( %)

HTts : hoạt tính bromelain sau khi tinh sạch ( UI/ ml)

HTth : hoạt tính bromelain trong dịch enzyme thô ( UI/ ml)

Phân đoạn 4 5 6 7 8 9
Hiệu suất thu hồi 147, 087 112,004 397,758 55,437 251, 93 235,14
 𝐻𝑇𝑅𝑡𝑠
PS =
𝐻𝑇𝑅𝑡ℎ

Trong đó :

PS : Mức độ tinh sạch

HTRts : hoạt tính riêng bromelain sau khi tinh sạch ( UI/ ml)

HTRth : hoạt tính riêng bromelain trong dịch enzyme thô ( UI/ ml)

Phân đoạn 4 5 6 7 8 9
Mức độ tinh sạch 5,973 7,445 26,656 5,939 22,542 - 185,616

IV. YÊU CẦU VÀ THẢO LUẬN:

 Nguyên tắc sử dụng muối (NH4)2SO4 để tủa protein: khi bổ sung muối vào dung
dịch protein, muối sẽ lôi kéo các phân tử nước chen giữa các phân tử protein và các phân
tử protein sẽ tụ lại với nhau, sau đó tiến thành ly tâm lọc bỏ dịch nổi và thu cặn đáy.
 Nguyên tắc của quá trình thẩm tích: dịch chứa enzyme được đặt trong một túi
thẩm tích, túi thẩm tích được cấu tạo bằng màng bán thấm (thường là màng celophan) sau
đó túi thẩm buộc 2 đầu và được đặt vào trong một dung dịch đệm không chứa chất hòa
tan cần loại bỏ (nước cất). Chất hòa tan khếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng
độ từ cao đến thấp, chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau do đó
phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm, thỉnh thoảng phải thay dung dịch đệm. Dùng
dung dịch BaCl2 quan sát hiện tượng kết tủa để kết thúc quá trình thẩm tích.
 Dùng BaCl2 để thử dung dịch đệm, nếu có xuất hiện kết tủa thì quá trình thẩm tích
hoàn thành và ngược lại nếu chưa xuất hiện kết tủa thì tiếp túc quá trình thẩm tích.
 Loại muối dung dịch bromelin trước khi thực hiện sắc ký lọc gel vì: quá trình sắc
ký là loại bỏ các protein tạp trong dịch kết tủa protein. Quá trình sắc ký thực hiện với
những phân tử có kích thước nhỏ vài micromet mà khi tủa bằng muối có kích thước rất
lớn, vì vậy cần loại bỏ muối trước khi thực hiện sắc ký thì quá trình sẽ diễn ra nhanh hơn,
tiết kiệm thời gian và protein thu nhận được sau sắc ký sẽ tinh sạch hơn, không bị lẫn tạp
các protein khác.
 Giải thích các bước tiến hành đo hoạt tính bromelin:

Cho cơ chất protein là dung dịch hemoglobin 2% sau đó để yên trong 35,50C trong 5 phút
để biến tính protein bằng nhiệt độ. Sau đó cho trichloacetic acid 5%, HCl 0,2N, tyrosin
1/400N, dịch enzyme bromelin lắc đều, để yên 35,50C trong 10 phút đây là quá trình
enzyme bromelin thủy phân protein. Tiếp tục cho trichlororacetic 5%, dịch enzyme
bromelin, lắc đều để yên 10 ở 250C và lọc để tiếp tục quá trình thủy phân protein sau đó
lọc để loại bỏ cặn có những thành phần protein chưa thủy phân, enzyme dư. Dung dịch
lọc được cho thêm NaOH 0,5N và thuốc thử Folin1/3, NaOH là đệm kiềm để cho thuốc
thử Folin hoạt động tốt. Sau đó tiến hành đo OD và đọc kết quả.

Bài Chủ Động :

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ CÁC CHẤT HOẠT HÓA - ỨC
CHẾ ENZYME PECTINASE

1.Mục đích
- Xác định được nhiệt độ ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme pectinase

- Xác định được các chất hoạt hóa và ức chế enzyme pectinase

2. Cơ sở lí thuyết

-Pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong
trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chính. Những enzyme này vì vậy mà có một vai
trò hết sức quan trọng trong bảo quản trái cây và rau quả.

-Phân loại enzyme pectinase : được chia làm 2 nhóm chính là hydrolase, transeliminase
với đặc điểm chung là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng
của các sản phẩm tạo thành.

3. Hóa chất- thiết bị - dụng cụ - mẫu vật

Bảng 1 : Bảng dự trù dụng cụ, hóa chất, thiết bị và mẫu vật

A. HÓA CHẤT

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Pectin Lỏng

2 3,5 - acid dinitrosalicylic (DNS) Rắn

3 Đệm citrate Lỏng

4 Đệm phosphat Lỏng

5 Enzyme pectinase Lỏng

6 Nước cất 2 lần Lỏng

B. DỤNG CỤ

STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Bình tia

2 Cốc 100 ml

3 Cốc 250 ml
 4 Ống nghiệm Φ 18

5 Giá ống nghiệm

8 Pipet 10 ml

9 Quả bóp cao su

10 Nồi nhôm

C. THIẾT BỊ

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVL GHI CHÚ

1 Bếp điện

2 Máy đo quang phổ Vùng Vis

3.2 Cách pha hóa chất

- Chiết suất pectin từ vỏ quýt :

+100 g vỏ khô sạch được trộn với 1 L nước nóng, và sau đó thêm 500 ml 0,72%
HCl. Hỗn hợp được ủ ở 700C trong 9 giờ, sau đó tách pha lỏng. Cuối cùng, ethanol đã
được thêm vào một thể tích tương đương với việc khuấy nhẹ để kết tủa pectin, sau đó
được ly tâm ở 3000 vòng / phút và sấy khô qua đêm ở 800C. Nồng độ pectin được xác
định bằng cách sử dụng nhớt kế Ubbelohde 3 ở 250C, trong đó 1 g pectin khô được hòa
tan trong 100 ml NaCl 0,9%.

- Pha thuốc thử DNS 1%:

+ Dung dịch A: cân 5 g DNS hòa tan trong khoảng 200 ml nước cất 50oC.

+ Dung dịch B: cân 8 g NaOH hòa tan trong 50 ml nước cất.

+ Dung dịch C: hòa tan 150 g muối potassium sodium tartrate trong 150 ml nước cất.
 Cho lần lượt dung dịch B,C vào dung dịch A. Dung dịch được bảo quản trong bình thủy
tinh sẫm màu.

Lưu ý: Chuẩn lại DNS bằng cách lấy 3 ml thuốc thử DNS thêm 3 giọt phenolphtalein,
rồi nhỏ từ từ dung dịch HCl 0,1N tới khi mất màu. Nếu dùng hết 5 ÷ 6 ml HCl 0,1N là
được.

- Pha dung dịch đệm acetate PH 5.6

+ Để pha dung dịch đệm acetate: cân 27.2 g sodium acetate hòa tan với 50ml nước cất

+ Hút 10 ml acid acetic cho vào dung dịch trên và định mức đến 100 ml

4. Nội dung thực hiện

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động enzyme pectinase

Cách tiến hành: các bước thực hiện thể hiện trong bảng 2

Đơn Các ống nghiệm

Hóa chất
vị 1 2 3 4 5 6 7

Pectin (1%) ml 1 1 1 1 1 1 1

Dung dịch đệm acetate ml 1 1 1 1 1 1 1

Để yên 370C, 10 phút

Dung dịch enzyme ml 1 1 1 1 1 1 1

Nhiệt
độ
Giữ ở nhiệt độ 370C 400C 450C 500C 550C 600C
phòn
g

Để yên 30 phút

3,5-axit dinitrosalysillic ml 1 1 1 1 1 1 1
 Lắc đều, đun 1000C, 10 phút

Nước cất ml 8 8 8 8 8 8 8

Đo OD tại λ=540nm

Bảng 2: Chuẩn bị các ống nghiệm để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính
enzyme pectinase

4.2 Các chất hoạt hóa và ức chế enzyme pectinase : cụ thể là ion kim loại

Cách tiến hành: các bước thực hiện thể hiện trong bảng 3

Đơn Các ống nghiệm

Hóa chất
vị 1 2 3 4 5

Pectin (1%) ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Dung dịch đệm ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Để yên 370C, 10 phút

Dung dịch enzyme ml 1 1 1 1 1

Để yên ở 370C 30 phút

Thêm các ion kim loại hòa tan, lắc đều, để yên 30 phút

Các ion lần lượt là Mg,Ca,Fe,Ba,K

3,5-axit dinitrosalysillic ml 1 1 1 1 1

Lắc đều, để yên 1000C 10 phút

Nước cất ml 8 8 8 8 8
 Đo OD tại λ=540nm

Bảng 3: Chuẩn bị các ống nghiệm để xác định ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt
tính enzyme pectinase

5. Kết quả

5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase

 Kết quả OD tại bước sóng 540 nm :

Nhiệt Nhiệt 37OC 40 OC 45 OC 50 OC 55 OC 60 OC

độ độ
phòng
Kết quả 0.583 0.712 0.512 0.573 0.679 0.352 0.556
OD
 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt đố đến hoạt động của enzyme
pectinase :

5.2 Các chất hoạt hóa và ức chế enzyme pectinase : cụ thể là ion kim loại

 Kết quả OD tại bước sóng 540 nm:

Ion kim Mg Fe Ba K Ca
loại

Kết quả -0.109 -0.086 1.045 0.070 0.856

OD

 Đồ thị biểu diễn các chất hoạt hóa và ức chế enzyme pectinase :
6. Kết luận

-Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase được thể hiện trong hình
…từ đó cho thấy hoạt động tối đa của enzyme là ở 37OC và hoạt động ít nhất ở khoảng
55 OC.
-Thí nghiệm này cũng cho thấy các ion Ba2+ , Ca2+, K+ tăng cường hoạt động của enzyme
pectinase , ion Mg2+ và Fe2+ ức chế nhẹ hoạt động của enzyme .

7. Tài liệu tham khảo

RESEARCH ARTICLE - Effect of Various Parameters on Activity of Pectinase Enzyme

- Khan I. G and Barate D. L. - P.G. Department of Microbiology, Shri Shivaji College of
Arts, Commerce and Science, Akola-444001, (M.S)

8. Kế hoạch thực hiện của tổ

Thời gian( ngày/giờ) Nội dung Ghi chú

28.5.2019 Khảo sát ảnh hưởng của

nhiệt độ và các ion kim
T1-T5 Sáng Thứ 3
loại đến hoạt động của
enzyme pectinase