BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

BÀI 7:
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
1. Họ và tên: Lê Phương Linh MSSV: 20200347
2. Nguyên tắc của phương pháp phân tích:
a) Một số khái niệm:
 Enzym: chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có tính đặc hiệu cao, có
khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học khác nhau.
 Enzym protease: enzym thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong
phân tử protein giải phóng các amino acid tự do hoặc các peptid phân tử
thấp.

 Đánh giá hoạt độ xúc tác của enzym bằng cách xác định tốc độ chuyển
hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng.
 Theo quy ước quốc tế, đơn vị enzym tiêu chuẩn: lượng enzym có khả
năng xúc tác chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một phút ở những điều kiện
xác định cho trước.
 Đơn vị hoạt độ protease: lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 phút ở
300C chuyển hóa được casein thành một lượng sản phẩm không bị kết tủa
bởi acid trichloacetic tương đương với 1 mol tyrosine.

b) Nguyên tắc:
  Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân protein caseinat natri (cơ chất có
thể là casein hoặc hemoglobin) bằng chế phẩm enzym có trong dung
dịch nghiên cứu rồi tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein bị thủy
phân bằng acid trichloaxetic (TCA). Định lượng sản phẩm tạo thành
trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa
vào đồ thị chuẩn của tyrosine để tính lượng sản phẩm tương ứng do
enzym xúc tác tạo nên.
 Hoạt độ protease ( HĐP) đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải
protein tới peptid và acid amin của các enzim và được biểu thị bằng số
đơn vị protease trong 1g chế phẩm. Hoạt độ riêng của chế phẩm biểu thị
bằng số đơn vị protease trên 1 mg protein của chế phẩm.
 Hoạt độ của các chế phẩm protease có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn
được xác định tại các trị số pH sau:
o Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.
o Protease kiềm: trysin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm
9-11.
o Protease trung tính: papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, …
hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8.

c. Giải thích nguyên tắc:

Bước 1. Phản ứng enzym:
casein + enzym protease (10 phút, 300C, pH=7) → amino acid + peptit ngắn, dài + casein
dư

Bước 2. Vô hoạt enzym bằng TCA, thu sản phẩm phản ứng enzym:
Acid trichloacetic:

Acid trichloacetic được sử dụng phổ biến trong quá trình sinh hóa sự kết
tủa của đại phân tử như DNA, RNA, protein.
→ TCA được thêm vào nhằm tạo kết tủa với casein dư và các peptid dài sinh
ra sau quá trình thủy phân.
→ Đồng thời, TCA cũng giúp làm bất hoạt enzym protease nhờ thay đổi trị
số pH.
Bước 3. Phản ứng giữa sản phẩm tạo thành và folin:
Dịch lọc sau thí nghiệm chứa các peptid ngắn và acid amin, trong các loại
acid amin, tyrosine chiếm đa số. Thuốc thử Folin có chứa axit phosphomolipdic
và axit phosphovolframic. Khi gặp các acid amin mạch vòng có tính khử, thuốc
thử Folin bị khử thành Molybdenum blue có màu xanh da trời hấp thụ cực đại
bước sóng 750nm.
Bước 4. Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 750nm với
dung dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng.

3. Cách tiến hành:

a) Chuẩn bị:
 Dung dịch cơ chất: casein 1% pha trong dung dịch đệm phosphate pH=7
 Dung dịch enzym: pha loãng enzym gốc trong dung dịch đệm phosphate
pH=7
 Đặt bình ổn nhiệt ở 300C, để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzym
10 phút trong bể ổn nhiệt → ổn nhiệt trước khi phản ứng
b) Tiến hành:
Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng
Các bước
Ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm chứng)
tiến hành
2ml dung dịch cơ chất
Bước 1:
2ml dịch enzyme
Phản ứng
Trộn đều để phản ứng trong 10
enzyme
phút ở 30°C
Bước 2: 2ml dịch cơ chất
Vô hoạt 4ml TCA 0,3M
Bổ sung 4ml TCA 0,3M
enzyme Trộn đều ngay lập tức
Trộn đều ngay lập tức, để yên hỗn
bằng TCA, 2ml dung dịch cơ chất
hợp trong 20 phút
thu sản phẩm Trộn đều ngay lập tức, để yên hỗn hợp
Lọc, thu được dịch lọc thí nghiệm
phản ứng trong 20 phút
enzyme Lọc, thu được dịch lọc kiểm chứng
Bước 3: 0,3ml dịch lọc thí nghiệm (dùng 0,3ml dịch lọc kiểm chứng (dùng
Phản ứng pipet) pipet)
giữa 1,5ml Na2CO3 0,5M 1,5ml Na2CO3 0,5M
sản phẩm tạo Trộn đều, để 10 phút Trộn đều, để 10 phút
thành và Thêm 0,3ml dung dịch folin. Thêm 0,3ml dung dịch folin.
Folin Trộn đều, để 20 phút. Trộn đều, để 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 750 nm với dung dịch
Bước 4:
đối sánh là mẫu kiểm chứng.

4. Xử lý số liệu:
 Mẫu thí nghiệm: 2ml dịch enzym + 2ml casein + 4ml TCA
 Giá trị OD750nm của mẫu đem phân tích:
Lần 1: OD750nm = 0.231
Lần 2: OD750nm = 0.272
→ Giá trị OD750nm trung bình của dung dịch phân tích sau 2 lần đo:
(OD750nm lần 1+ OD750nm lần 2)/2 = (0.231+0.272)/2 = 0.252

a) Thiết lập công thức tính:

Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn có dạng:

y = 1.0629x + 0.0016 (R2 = 0.9999)
Với trục y = OD750nm , trục x= [Tyrosine] (mg/ml). Thay vào phương trình
đường chuẩn vừa tìm được ở trên các giá trị OD750nm ta có công thức :
y−0.0016
Nồng độ đường khử có trong mẫu thí nghiệm là: x = 1.0629
(μmol/ml)

b) Tính toán:
y = 0.252 → x = 0.236
 Với nồng độ tyrosine bằng 0.236μmol/ml
→ Hàm lượng tyrosine có trong 8ml dung dịch là:
0.236 x 8 = 1.888 μmol
Trong 10 phút hỗn hợp thu được 1.888 μmol tyrosine
→ Trong 1 phút 2ml dịch enzym thu được 1.888/10 μmol tyrosine
→ Trong 1 phút 1ml dịch enzym có số đơn vị hoạt độ là 0.0944 μmol
tyrosine
Enzym được pha loãng 5000 lần
→ Hoạt độ của enzym protease là 472U/ml

5. Một số lưu ý khi làm thí nghiệm:

* Chú ý khi làm thí nghiệm với enzym:
 Enzym là những protein có hoạt tính xúc tác nên không bền vững, rất
nhạy cảm đối với các tác động lý hóa vì vậy cần tránh các yếu tố có thể
gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, muối
kim loại nặng, tránh tạo bọt vì một số enzym có thể bị kìm hãm trên bề
mặt phân chia. Các điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ) phải ở trong giới
hạn enzym có thể tồn tại bền vững và giữ được cố định trong suốt thời
gian phản ứng. Thường người ta tiến hành trong dung dịch đệm với pH
ổn định và tối ưu hóa với enzym đã cho và ở 300C trong máy ổn nhiệt.
 Phản ứng enzym được tiến hành trong điệu kiện dư cơ chất . Sau khi
dừng phản ứng lượng cơ chất bị chuyển hóa không quá 20%.
 Thời gian xác định hoạt độ enzym thường là 10 phút. Hoạt tính enzym
cho kết quả cao nhất ở khoảng thời gian đầu và càng kéo dài hoạt tính
càng giảm. Vì vậy, thời gian thường xác định ở khoảng enzym bền và cho
hoạt tính cao nhất. Tùy từng loại enzym sẽ cho khoảng thời gian hoạt tính
cao nhất khác nhau.
VD: enzym xúc tác phản ứng oxy hóa – khử rất nhanh bị mất hoạt tính →
30 giây
enzym xenlulase hoạt độ thấp → cần đến 1 giờ
 Khi xác định hoạt độ enzym, phải làm mẫu kiểm chứng song song mẫu
thí nghiệm. Mục đích cần làm mẫu kiểm chứng:
o enzym vô hoạt có lẫn sản phẩm không bị kết tủa bởi TCA
o cơ chất, dung dịch đệm cũng có chứa sản phẩm không bị kết tủa bởi
TCA
o casein có khả năng tự thủy phân
* Chuẩn bị:
  Pha loãng dung dịch enzym từ enzym gốc → đồng biến với lượng sản
phẩm tạo thành sao cho lượng sản phẩm tạo thành nằm trong giới hạn đo
xác định.
 Pha loãng enzym trong dung dịch đệm phosphate để duy trì pH=7 ổn định
(với enzym protease).
 Nhiệt độ thích hợp cho phản ứng thường ở khoảng đồng biến là 300C.
* Tiến hành:
 Phải vô hoạt enzym bằng TCA vì nếu không enzym sẽ tiếp tục phân giải
→ sai số do lượng sản phẩm thu được sẽ nhiều hơn khoảng thời gian xác
định ban đầu.
 Thêm Na2CO3 vì Na2CO3 cung cấp môi trường kiềm ổn định hơn NaOH.
Khi tan trong nước, natri cacbonat bị thủy phân mạnh tạo môi trường
bazơ. Na2CO3 → 2Na+ + CO32-

CO32- + H2O → HCO3- + OH-

 Dựa theo định nghĩa đơn vị hoạt độ để tính toán chính xác nhất.