TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÀI LIỆU HỌC TẬP

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ

PROTEIN – ENZYME
(Lưu hành nội bộ)

TS. Nguyễn Thị Lệ Thủy

ThS. Nguyễn Thị Phương Khanh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 11/2022

 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

1. Quy định thực hành trong phòng thí nghiệm

Trước khi làm thí nghiệm sinh viên phải chuẩn bị trước nội dung thí nghiệm ở
nhà, thông qua kiểm tra của thầy cô hướng dẫn ở phòng thí nghiệm rồi mới được thực
hành bài thí nghiệm .
Trong khi làm thí nghiệm: sinh viên phải làm việc đúng vị trí quy định, dưới sự
hướng dẫn và giám sát của thầy cô, không được tự ý làm thí nghiệm.
Giữ trật tự, nghiêm túc, tuân thủ quy định phòng thí nghiệm và quy tắc an toàn
hóa chất thiết bị trong suốt quá trình thực hành trong phòng thí nghiệm.
Cấm vứt giấy lọc, các hóa chất rắn, acid, kiềm, hóa chất dễ cháy nổ vào bể nước
rửa mà phải đổ vào đúng nơi quy định trong phòng thí nghiệm.
Phải giữ dụng cụ thí nghiệm sạch sẽ, không làm đổ vỡ dụng cụ thí nghiệm. Không
được mang hóa chất, dụng cụ ra khỏi phòng thí nghiệm khi chưa được sự cho phép
của thầy cô hướng dẫn.
Đọc kỹ nhãn dán hóa chất trước khi sử dụng và phải để hóa chất đúng nơi quy
định.
Sau khi thực hành xong thí nghiệm: sinh viên phải dọn dẹp sạch sẽ chỗ làm việc,
rửa sạch sẽ và trả dụng cụ đầy đủ cho phòng thí nghiệm.
2. Chuẩn bị nội dung thí nghiệm
Khi thực hiện một thí nghiệm, sinh viên phải chuẩn bị trước ở nhà, đọc và nắm
vững các vấn đề lý thuyết liên quan đến nội dung thí nghiệm trong giáo trình lý thuyết
và hướng dẫn thực hành. Sinh viên phải nắm rõ nội dung thực hành, viết trước đề
cương cho bài thực hành.
3. An toàn khi làm việc với acid
Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng acid hoặc thực hiện phản ứng
với các hơi acid tự do. Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng.

2
 Khi pha loãng, luôn luôn phải cho acid vào nước. Phải giữ để acid không bắn hoặc
mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập
tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn.
4. An toàn khi làm việc với base
Base có thể làm cháy da, mắt, gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Phải mang
găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch base đậm đặc. Phải thao tác
trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi base.
5. Cách sử dụng và bảo quản hóa chất
Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi
tên hóa chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng
phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
Khi làm việc với hóa chất, sinh viên cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai
nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo
quản hóa chất được tóm tắt như sau:

− Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu cơ, vô cơ,
muối, acid, base, kim loại, ...) hay theo một thứ tự abc để khi cần dễ tìm.

− Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước
khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.

− Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp,
cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.

− Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai
lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chỗ tối.

− Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay,
không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.

− Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi
cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp
sau khi lấy hóa chất xong.

3
 − Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm
thử hóa chất.

− Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước
khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base)

− Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống
bóp cao su.

− Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết
bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu
bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hóa chất vào
miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO, nếu là base
phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%.
Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm:

4
 Bài 1: TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ENZYME

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Định nghĩa enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và hiện diện trong mọi tế
bào sinh vật. Enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng sinh hóa bên trong và
bên ngoài cơ thể sống với tính chất đặc hiệu cao. Trong phân tử enzyme (E) có một
phần nhỏ trên cấu trúc tham gia kết hợp với cơ chất (S) gọi là trung tâm hoạt động
của enzyme.
Phản ứng được xảy ra qua ba giai đoạn: (1) cơ chất (S) tiếp xúc trực tiếp với trung
tâm hoạt động của (E), (2) hình thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES), (3) tạo thành
sản phẩm (P) và giải phóng (E) tự do. Quá trình phản ứng được trình bày theo phương
trình tóm tắt như sau:

Khả năng xúc tác của enzyme được biểu thị bằng đại lượng hoạt tính (đơn vị: IU
hoặc U) là lượng enzyme làm biến đổi 1 micromol cơ chất thành sản phẩm trong 1
phút ở 25 oC và điều kiện được chuẩn hóa.
2. Tính chất đặc hiệu của enzyme
Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu
rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng
xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng
nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Tính
đặc hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme.
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
3.1. Nhiệt độ
Bản chất hóa học của enzyme là protein nên vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác
chỉ tăng khi nhiệt độ tăng trong khoảng giới hạn nhất định, khi mà cấu trúc của
enzyme chưa bị thay đổi. Trong khoảng nhiệt độ giới hạn thì hoạt tính enzyme tăng
theo định luật Vant-Hoff, có nghĩa là khi nhiệt độ môi trường tăng 10 oC thì vận tốc
phản ứng tăng gấp hai lần.
Với cùng một loại enzyme thì khoảng nhiệt độ giới hạn sẽ khác nhau khi enzyme
được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.

5
3.2. pH
Bản chất của enzyme là một phân tử đa điện tích, trạng thái ion hóa của chúng
phụ thuộc vào pH của môi trường. Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp cho sự
hoạt động của chúng gọi là giá trị pH tối ưu (pHopt) là khoảng pH mà tại đó hoạt tính
xúc tác của enzyme mạnh nhất. Enzyme bị mất hoạt tính xúc tác tại giá trị pH môi
trường bằng với giá trị pI (điểm đẳng điện) của enzyme.
Các enzyme cùng loại từ các nguồn khác nhau sẽ có giá trị pHopt khác nhau như
-amylase của nước bọt có pHopt khoảng 7.0 trong khi đó -amylase của malt có
pHopt khoảng 4.7.
3.3. Chất ức chế và hoạt hóa
Chất ức chế enzyme (hay còn gọi là chất kìm hãm) là các chất có khả năng làm
giảm hoặc làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme. Các chất này có thể là các ion kim
loại, các phân tử chất vô cơ, hữu cơ hoặc các protein. Các chất ức chế có thể là chất
ức chế cạnh tranh, phi cạnh tranh hoặc hỗn hợp.
Chất hoạt hóa enzyme là những chất có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của
enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau.
3.4. Nồng độ cơ chất
Vận tốc phản ứng xúc tác bởi enzyme tăng khi nồng độ cơ chất tăng, đến một giá
trị nào đó khi vận tốc phản ứng đạt giá trị cực đại (Vmax) thì dù nồng độ cơ chất tăng
vận tốc phản ứng không tăng nữa, điều này được thể hiện thông qua phương trình và
đồ thị Michaelis–Menten.
3.5. Nồng độ enzyme
Khi nồng độ cơ chất dư thừa thì vận tốc phản ứng (V) tăng tỉ lệ thuận với nồng
độ enzyme ([E]) và được biểu diễn bằng phương trình : V = k.[E]
Khi nồng độ cơ chất thấp, các enzyme đã bão hòa cơ chất nên vận tốc phản ứng
không tăng nữa.
B. THỰC NGHIỆM
1. Hóa chất
-amylase trong nước bọt người pha loãng 1/10
Dung dịch hồ tinh bột 1 %
Dung dịch iod 1 % Dung dịch saccharose 1 %
Dung dịch NaCl 1 % Dung dịch NaH2PO4 0.2 M

6
 Dung dịch CuSO4 1 % Dung dịch Na2HPO4 0.2 M
Dung dịch Fehling A : hòa tan 69.2 g CuSO4.5H2O trong 500 mL nước cất, thêm
nước cất cho đủ 1000 mL, lắc kỹ, lọc rồi cho vào lọ nút nhám khô rồi đậy kín.
Dung dịch Fehling B :
- Dung dịch 1: hòa tan 346 g kali natri tartrate trong 500 mL nước cất
- Dung dịch 2: hòa tan 100 g NaOH trong 500 mL nước cất.
Trộn lẫn dung dịch 1 vào dung dịch 2, lắc đều, thêm nước cho đủ 1000 mL, lắc
kỹ, lọc rồi cho vào lọ nút nhám khô rồi đậy kín.
Thuốc thử Fehling: là hỗn hợp bao gồm hai dung dịch Fehling A và Fehling B
theo tỉ lệ thể tích 1:1
2. Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm 10 cái
Giá ống nghiệm 1 cái
Pipet 1 mL 1 cái
Becher 250 mL 1 cái
Becher 100 mL 3 cái
Ống nhỏ giọt 4 cái
Bóp silicon 1 cái
Mặt kính đồng hồ 1 cái
Bể ổn nhiệt (dùng chung)
3. Quy trình thí nghiệm
3.1. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
Chuẩn bị bốn ống nghiệm sạch và khô ráo. Đánh số thứ tự lần lượt từng ống
nghiệm. Cho vào mỗi ống nghiệm 10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1 %. Thực hiện thí
nghiệm như sau:
− Ống nghiệm thứ 1: đặt vào nước đá 0 oC
− Ống nghiệm thứ 2: đặt ở nhiệt độ phòng
− Ống nghiệm thứ 3: đặt vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50 oC
− Ống nghiệm thứ 4: đặt vào bể ổn nhiệt ở 100 oC

7
 Sau 10 phút lấy các ống nghiệm ra và lần lượt cho vào mỗi ống 10 giọt dung dịch
nước bọt pha loãng 1/10. Lắc đều và tiếp tục đặt từng ống nghiệm ở nhiệt độ như trên
thêm 10 phút.
Sau đó, dùng ống nhỏ giọt lần lượt lấy 2 giọt dung dịch phản ứng trong mỗi ống
nghiệm và nhỏ lên mặt kính đồng hồ. Tiếp theo lấy 1 giọt dung dịch iod 1 % lần lượt
nhỏ lên từng dung dịch thí nghiệm có sẵn trên mặt kính đồng hồ và quan sát hiện
tượng thí nghiệm.
❖ Lưu ý quan trọng: Trong trường hợp cả bốn ống nghiệm có cùng một hiện
tượng thì phải làm lại thí nghiệm và thay đổi thời gian phản ứng cho phù hợp.
3.2. Sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Chuẩn bị bảy ống nghiệm sạch và khô ráo. Đánh số thứ tự lần lượt từng ống
nghiệm. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí sau: (lưu ý: tiến hành thí nghiệm
theo từng hàng ngang của bảng bố trí thí nghiệm)

pH 5.6 6.0 6.4 6.8 7.2 7.6 8.0

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7
Dung dịch
NaH2PO4 0.2 M 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 0
(mL)
Dung dịch
Na2HPO4 0.2 M 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0
(mL)

Nước cất (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Lắc đều từng ống nghiệm

Dung dịch hồ
tinh bột 1 % 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(mL)
Dung dịch NaCl
1 1 1 1 1 1 1
1 % (giọt)
Dung dịch nước
1 1 1 1 1 1 1
bọt 1/10 (giọt)

8
 Lắc đều và để yên các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, dùng
ống nhỏ giọt lần lượt cho vào mỗi ống nghiệm 3 giọt dung dịch iod 1 %. Lắc đều và
quan sát hiện tượng thí nghiệm.
3.3. Sự ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme
Chuẩn bị ba ống nghiệm sạch và khô ráo. Đánh số thứ tự lần lượt từng ống
nghiệm. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí sau:

Ống nghiệm 1 2 3
Dung dịch nước bọt
3 3 3
1/10 (mL)
Dung dịch NaCl
1 0 0
1 % (giọt)
Dung dịch CuSO4
0 1 0
1 % (giọt)
Nước cất (giọt) 0 0 1

Lắc đều từng ống nghiệm

Dung dịch
5 5 5
hồ tinh bột 1 % (giọt)

Để yên các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, dùng ống nhỏ
giọt lần lượt cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt dung dịch iod 1 %. Lắc đều và quan sát
hiện tượng thí nghiệm.
3.4. Tính chất đặc hiệu của enzyme
Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch và khô ráo. Đánh số thứ tự lần lượt từng ống
nghiệm. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí sau:

Ống nghiệm 1 2

Dung dịch nước bọt 1/10 (giọt) 5 5

Dung dịch hồ tinh bột 1 % (giọt) 10 0

Dung dịch saccharose 1 % (giọt) 0 10

Lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ 37 oC

Dung dịch thuốc thử Fehling (ml) 1 1

9
 Lắc đều cả hai ống nghiệm. Sau đó, đun cách thủy cả hai ống nghiệm cho đến khi
thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch ở một trong hai ống nghiệm thì ngừng đun. Làm
nguội và quan sát hiện tượng.
C. CÂU HỎI
1. Em hãy viết phương trình phản ứng thủy phân tinh bột trong các thí nghiệm ?
2. Trong thí nghiệm “sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme”, khi cho
dung dịch iod 1 % vào hỗn hợp phản ứng nếu:
a. Em hãy cho biết cần thay đổi thông số nào của phản ứng thủy phân tinh bột và
thay đổi như thế nào để làm lại thí nghiệm trong trường hợp tất cả ống nghiệm đều
có màu xanh đậm? Giải thích ?
b. Em hãy cho biết cần thay đổi thông số nào của phản ứng thủy phân tinh bột và
thay đổi như thế nào để làm lại thí nghiệm trong trường hợp tất cả ống nghiệm đều
mất màu hoặc có màu vàng rơm như nhau? Giải thích
3. Em hãy cho biết tại sao phải pha dung dịch iod trong KI ? Viết phương trình phản
ứng ?
4. Em hãy cho biết vai trò của thuốc thử Fehling trong thí nghiệm “tính chất đặc
hiệu của enzyme”. Viết phương trình phản ứng xảy ra ? Giả sử, trong quá trình thực
hiện phản ứng nếu kết tủa đỏ gạch xuất hiện ở cả hai ống nghiệm thì em hãy cho biết
nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này ?

10
 Bài 2: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA UREASE

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Urease là enzyme tham gia quá trình xúc tác thủy phân ure

Khi có sự hiện diện của formon, hexamethylene tetramine được tạo thành và giải
phóng acid carbonic.

Dùng dung dịch base để định phân acid carbonic tạo thành, từ đó tính được lượng
ure bị thủy phân.

B. THỰC NGHIỆM
1. Hóa chất
Dung dịch ure 2 %
Dung dịch NaOH 0.05 N
Dung dịch formon 10 %
Thuốc thử phenolphtalein 0.5 %
2. Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm 12 cái
Giá ống nghiệm 1 cái
Pipet 5 mL 2 cái
Pipet 10 mL 2 cái
Becher 250 mL 1 cái
Becher 100 mL 4 cái
Phễu lọc 1 cái
Erlen 250 mL 3 cái

11
 Cối + chày 1 bộ
Bể ổn nhiệt (dùng chung)
3. Quy trình thí nghiệm
3.1. Chiết xuất dung dịch urease từ hạt đậu nành
Bước 1: cân 3 g đậu nành đã tách béo. Dùng cối và chày sứ nghiền nhuyễn đậu
nành thành bột.
Bước 2: hòa bột đậu nành vào 30 mL nước cất, khuấy đều rồi để yên cho lắng
trong 15 phút. Lọc lấy dung dịch.
Bước 3: cho tiếp 30 mL nước cất vào phần bã đậu nành, khuấy đều rồi để yên
cho lắng trong 15 phút. Lọc lấy dung dịch.
Bước 4: lặp lại thao tác thí nghiệm ở bước 3.
Bước 5: gom chung dung dịch lọc ở cả ba lần lại với nhau và gọi là dung dịch
urease (lưu ý: thể tích dung dịch urease tối thiểu cần phải có là 70 mL).
3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme
Chuẩn bị mười hai ống nghiệm sạch và khô ráo, chia làm 2 dãy thí nghiệm. Đánh
số thứ tự lần lượt từng ống nghiệm trong mỗi dãy. Tiến hành thí nghiệm theo bảng
bố trí sau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Dung dịch ure

0 1 2 3 4 5
2 % (mL)

Nước cất (mL) 5 4 3 2 1 0

Dung dịch
5 5 5 5 5 5
urease (mL)

Đặt dãy thí nghiệm thứ nhất vào bể ổn nhiệt ở 40 oC, dãy thí nghiệm thứ hai vào
bể ổn nhiệt ở 30 oC với thời gian thủy phân là 20 phút. Sau 20 phút, lần lượt thêm vào
mỗi ống nghiệm 5 mL dung dịch formol 10 % trung tính, lắc đều và để yên thêm 2
phút. Sau đó, cho toàn bộ hỗn hợp phản ứng trong mỗi ống nghiệm vào từng erlen
250 mL, tráng mỗi ống nghiệm ba lần mỗi lần bằng một ít nước cất và trút toàn bộ
dung dịch vào erlen chứa hỗn hợp phản ứng. Thêm vào mỗi erlen 5 giọt dung dịch
phenolphtalein 0.5 %, lắc đều và định phân nhanh bằng lượng acid H2CO3 tạo thành

12
bằng dung dịch NaOH 0.05 N. Ghi nhận thể tích NaOH dùng trong quá trình chuẩn
độ acid H2CO3.
❖ Lưu ý quan trọng:
− Formol dễ bay hơi và độc, làm tổn thương hệ hô hấp do đó khi thao tác
với formol phải đeo găng tay và khẩu trang, đậy kín các mẫu thí nghiệm và khi chuẩn
độ xong phải đổ bỏ ngay dung dịch chuẩn độ và xả nước nhiều.
− Acid carbonic là acid dễ bay hơi do đó cần phải chuẩn độ nhanh và tránh
làm thất thoát trong quá trình phản ứng.
C. CÂU HỎI
1. Tại sao phải trung hòa dung dịch formon 10 % thành dung dịch formon trung tính
trước khi sử dụng ? Vai trò của dung dịch formon trong thí nghiệm ?
2. Trên cùng một hệ trục tọa độ, vẽ hai đường cong biểu diễn sự biến thiên của
lượng cơ chất bị thủy phân (y) theo nồng độ cơ chất ban đầu [S] ở hai nhiệt độ khảo
sát 30 oC và 40 oC (dùng phần mềm excell)
3. Trên cùng một hệ trục tọa độ, vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của 1/v theo 1/[S]
ở hai nhiệt độ thủy phân. Biết rằng vận tốc của phản ứng thủy phân được tính như
1 𝑑(𝑆) 20
sau : = = (dùng phần mềm excell)
𝑉 𝑑𝑡 𝑦

4. Từ đồ thị ở câu 3, xác định giá trị Km và Vmax ở hai điều kiện nhiệt độ khảo sát

13
 Bài 3: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Nguyên tắc phương pháp Heinkel
Amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột, phân giải amylose và amilopectin
của tinh bột thành dextrin, glucose, ... Hàm lượng tinh bột còn dư lại được định lượng
bằng phản ứng tạo màu với iod và được đo độ hấp thụ tại bước sóng 560 nm.
Hoạt tính amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy phân bởi 1 mL dịch
enzyme (hay 1 mg nguyên liệu chứa enzyme) trong 1 phút ở điều kiện 30 oC, pH 6.
B. THỰC NGHIỆM
1. Hóa chất
Dung dịch NaH2PO4 0.05 M
Dung dịch Na2HPO4 0.05 M
Dung dịch đệm phosphate 0.05 M pH 6: 87.7 mL dung dịch NaH2PO4 0.05 M và
12.3 mL Na2HPO4 0.05 M thêm nước cất cho đủ 100 mL. Đo lại pH bằng máy pH
Dung dịch hồ tinh bột 1 % trong đệm phosphate pH 6
Dung dịch hồ tinh bột 10 mg/mL
Dung dịch iod 1 %: 1 g iod và 2 g KI, định mức thành 100 mL dung dịch, bảo
quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần
Dung dịch HCl 1 %
Dung dịch NaCl 0.1 %
2. Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm 10 cái
Giá ống nghiệm 1 cái
Pipet 5 mL 2 cái
Becher 250 mL 1 cái
Becher 100 mL 4 cái
Erlen 250 mL 3 cái
Cối + chày 1 bộ

14
 Bể ổn nhiệt (dùng chung)
3. Quy trình thí nghiệm
3.1. Chiết xuất dung dịch -amylase từ hạt lúa nảy mầm
Cân 10 g hạt lúa đã nảy mầm cho vào cối sứ và nghiền nhuyễn trong một ít nước
cất. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 100 mL, tráng cối sứ vài lần mỗi lần
với một ít nước cất và cho vào bình định mức. Thêm nước cất vào bình định mức và
định mức lên đến vạch. Lắc thật kỹ. Để yên dung dịch 15 phút. Li tâm 3000 vòng/phút
trong 10 phút, sau đó thu lấy phần dịch trong có chứa amylase.
3.2. Xây dựng đồ thị đường chuẩn
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Hồ tinh bột
0 1 2 3 4 5
10 mg/mL (mL)
Đệm phosphate pH 6
5 4 3 2 1 0
(mL)
Nồng độ tinh bột
0 2 4 6 8 10
(mg/mL)

Lấy 0.1 mL dung dịch từ các ống nghiệm, thêm 0.1 mL dung dịch NaCl 0.1 %,
0.2 mL dung dịch đệm phosphate, 0.1 mL nước cất và 0.5 mL dung dịch acid HCl 1
%. Lắc đều. Tiếp theo thêm 9 mL dung dịch iod đã pha loãng 500 lần. Lắc đều. Đo
độ hấp thụ của từng ống tại bước sóng 560 nm.
3.3. Xác định hoạt tính của -amylase từ hạt lúa nảy mầm
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí
sau:

Nghiệm thức Mẫu thử thật Mẫu đối chứng

( 3 ống nghiệm ) ( 3 ống nghiệm )
Dung dịch hồ tinh bột 1 % (mL) 1 1

Dung dịch NaCl 0.1 % (mL) 1 1

Dung dịch đệm phosphate (mL) 2 2

Lắc đều, để ổn nhiệt ở 30 oC trong 15 phút

15
 Dung dịch enzyme (mL) 1 0

Lắc đều, để ổn nhiệt ở 30 oC trong 30 phút

Dung dịch HCl 1 % (mL) 5 5

Dung dịch enzyme (mL) 0 1

Lấy 1 mL dung dịch từ mẫu thí nghiệm trên cho vào ống nghiệm khác, thêm vào
9 mL dung dịch iod đã pha loãng 500 lần. Lắc đều. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 560
nm. Từ đồ thị đường chuẩn, suy ra số mg tinh bột đã bị phân giải.
Hoạt tính của -amylase trong 1 mL dịch enzyme được tính theo công thức:

𝐗. 𝐊 Trong đó:
𝐭. 𝐯 X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn
K: hệ số pha loãng
t: thời gian enzyme phản ứng (phút)
v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng (mL)

C. CÂU HỎI
1. Em hãy cho biết có thể thu nhận -amylase từ hạt lúa chưa nảy mầm hay không ?
Tại sao ?
2. Ý nghĩa của mẫu đối chứng trong thí nghiệm xác định hoạt tính -amylase ?
3. Hãy cho biết tại sao ở mẫu đối chứng, dung dịch enzyme được thêm vào sau khi
cho HCl 1 % vào hỗn hợp phản ứng ?
4. Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột (mg/mL) và
giá trị độ hấp thụ (OD) (dùng phần mềm excell), trên đồ thị thể hiện phương trình
hồi quy tuyến tính và giá trị R2. Từ đồ thị đường chuẩn suy ra số mg tinh bột bị
thủy phân. Tính hoạt tính của -amylase trong dịch chiết thu được từ hạt lúa nảy
mầm.

16
 Bài 4+5: QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH
HOẠT TÍNH ENZYME TỪ THỰC VẬT

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Thu nhận enzyme
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: sự tích
điện của phân tử protein, mức độ hydrate hóa, nhiệt độ…Khi thay đổi các yếu tố này
sẽ làm ảnh hưởng đến giá trị tích điện của phân tử protein và ảnh hưởng đến lớp vỏ
hydrate của chúng, khi đó các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành khối
lớn, tách khỏi dung dịch, thường gọi là kết tủa protein.
Như vậy để kết tủa protein, có thể thay đổi giá trị pH của dung dịch đển giá trị pI
của protein hoặc thêm muối trung tính, dung môi hữu cơ (aceton, ethanol) ở nồng độ
cao. Trong đó, dung môi hữu cơ và muối trung tính là những yếu tố tạo kết tủa protein
thuận nghịch.
2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
Trong cấu tạo của hầu hết các protein đều có sự hiện diện của tyrosin và
tryptophan. Hàm lượng của các acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Khi cho
protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành phức chất có màu. Cường độ màu
của phức chất tỉ lệ thuận với hàm lượng protein và được đo bằng phương pháp quang
phổ hấp thụ tại bước sóng 750 nm.
Trong phản ứng Lowry cường độ màu của phức chất có thể tăng lên khi có sự
hiện diện của muối amonium, phenol, vòng imidazol, pimiridin, acid uric, các ion
kim loại…cường độ màu giảm khi có mặt ethanol, acetone, TCA, acid pecloric
(HClO4)… vì vậy để đạt cường độ màu chính xác của dung dịch protein với thuốc
thử Folin đòi hỏi protein phải tinh sạch.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung dịch mẫu
chứa vài chục microgam protein. Tuy nhiên, phương pháp này không dùng để định
lượng protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatin.
3. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson
Casein bị thủy phân trong môi trường base dưới tác dụng của protease tạo thành
peptide và các acid amin vòng là tyrosin và tryptophan. Hàm lượng tyrosin được xác
định bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.

17
B. THỰC NGHIỆM
1. Hóa chất
Ethanol tinh khiết
Dung dịch albumin 0.1 %
Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0.1 N và định mức thành 100 mL
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch natri citrat 1 % và định
mức thành 100mL
Dung dịch C (khi dùng mới pha): gồm hỗn hợp hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1
(v/v)
Thuốc thử Folin pha loãng 10 lần
Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hoà tan 5.96 g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250 mL
Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hoà tan 0.9072 g KH2PO4 trong nước thành 100 mL
Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177 mL dung dịch Na2HPO4 1/15 M
và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH.
Dung dịch casein 1 %: đun sôi cách thuỷ 1 g casein trong đệm Sorensen đến tan hoàn
toàn rồi sau đó định mức bằng đệm Sorensen cho đủ 100 mL
Dung dịch TCA 5 %: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 mL
Dung dịch NaOH 0.5 N: hoà tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 mL
Dung dịch HCl 0.2 N: trộn 4.25 mL HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 mL
Dung dịch tyrosin 20 mM: khuấy nghiền 0.118 g tyrosin trong dung dịch HCl 0.2 N
vừa đủ 50 mL
Dung dịch tyrosin chuẩn 1 mM trong dung dịch HCl 0.2 N: pha loãng 5 mL tyrosin
20 mM trong HCl 0.2 N thành 100 mL.
2. Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm 10 cái
Giá ống nghiệm 1 cái
Pipet 5 mL 2 cái
Becher 250 mL 1 cái
Becher 100 mL 4 cái
Erlen 250 mL 3 cái

18
 Cối + chày 1 bộ
Bể ổn nhiệt (dùng chung)
3. Quy trình thí nghiệm
3.1. Thu nhận bromelin từ quả thơm
Cân 200 g thơm (dùng cả phần vỏ và lõi), cắt nhỏ cho vào cối sứ và giã nhuyễn.
Tiếp theo, cho toàn bộ hỗn hợp lên lớp bông gòn mỏng và vắt thật kỹ, bỏ phần bã quả
thơm và thu phần dịch nước thơm. Lấy phần dịch này ly tâm ở 3000 vòng / phút trong
15 phút. Gạn lấy phần dung dịch. Ghi nhận thể tích dung dịch nước thơm thu được.
Lượng nước thơm này chia ra thành hai phần:
➢ Phần thứ nhất:
Xác định hàm lượng bromelin theo phương pháp Lowry (phần 3.2) và hoạt tính
bromelin theo phương pháp Anson (phần 3.3)
➢ Phần thứ hai:
Cho từ từ 150 mL ethanol 99o vào becher có chứa sẵn 50 mL dung dịch nước
thơm, khuấy đều và để yên trong nước đá trong 60 phút. Sau đó, ly tâm hỗn hợp ở
3000 vòng / phút trong 15 phút. Gạn bỏ phần dịch lỏng phía trên để thu nhận kết tủa.
Hòa tan kết tủa trong nước cất và định mức thành 10 mL dung dịch gọi là dung
dịch enzyme và ký hiệu là dung dịch A. Dung dịch này được dùng để xác định hàm
lượng và hoạt tính của enzyme sau quá trình tinh sạch.
3.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn albumin
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo. Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Nồng độ protein
0 50 100 150 200 250
(g/mL)

Dung dịch
albumin 0.1 % 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
(mL)

Nước cất (mL) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5

19
 Lấy 0.4 mL dung dịch protein từ các ống nghiệm trên, thêm vào 2 mL dung dịch
C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm tiếp 2 mL thuốc thử Folin,
lắc đều 5−10 phút. Thêm nước cất cho đủ 5 mL. Đo độ hấp thụ ở bước sóng  750
nm. Ghi nhận kết quả.
3.2.2. Xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo, chia thành hai dãy, mỗi dãy 3 ống
nghiệm. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí thí nghiệm sau:

Mẫu thử thật Mẫu thử không

Ống nghiệm
(3 ống nghiệm) (3 ống nghiệm)

Dung dịch protein phân tích

0.4 0
(mL)

Nước cất 0 0.4

Dung dịch C (mL) 2.0 2.0

Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Thuốc thử Folin (mL) 2.0 2.0

Lắc đều trong 5−10 phút. Thêm nước cất cho đủ 5 mL

Đo độ hấp thụ ở bước sóng  750 nm. Ghi nhận kết quả
3.2.3. Cách tính toán kết quả
Từ đồ thị đường chuẩn, so sánh giá trị độ hấp thụ của mẫu phân tích. Từ đó suy
ra hàm lượng protein có trong mẫu phân tích, ký hiệu là a (g/mL)
Hàm lượng protein (P−mg protein/g mẫu) được tính theo công thức:

a. 10−3 . n Trong đó:

P= a: hàm lượng protein suy ra từ đường chuẩn (g/mL)
m
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu phân tích
3.3. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson
3.3.1. Xây dựng đường chuẩn tyrosin
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí
thí nghiệm sau:

20
 Ống nghiệm
Hóa chất
1 2 3 4 5 6

Dung dịch tyrosin chuẩn (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Nồng độ tyrosin (M) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Dung dịch HCl 0.2 N (mL) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Dung dịch NaOH 0.5 N (mL) 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin (mL) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

Đo độ hấp thụ tại bước sóng 600 nm

3.3.2. Xác định hàm lượng tyrosin trong mẫu phân tích
Chuẩn bị sáu ống nghiệm sạch và khô ráo, chia thành hai dãy, mỗi dãy 3 ống
nghiệm. Tiến hành thí nghiệm theo bảng bố trí thí nghiệm sau:

Ống nghiệm
Hóa chất Mẫu thử thật Mẫu thử không
(3 ống nghiệm) (3 ống nghiệm)

Dung dịch casein 1 % (mL) 5 5

Dung dịch TCA 5 % (mL) 0 5

Dung dịch enzyme (mL) 1 0

Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Dung dịch TCA 5 % (mL) 5 0

Dung dịch enzyme (mL) 0 1

Lắc đều trong 5−10 phút. Lọc lấy phần dung dịch

Lấy 2 ống nghiệm sạch và khô ráo, ký hiệu lần lượt là A và B. Lấy 1 mL dịch lọc
từ mẫu thử thật cho vào ống nghiệm A, 1 mL dịch lọc từ mẫu thử không cho vào ống

21
nghiệm B. Tiếp theo thêm lần lượt vào mỗi ống 2 mL dung dịch NaOH 0.5 N và 0.6
mL thuốc thử Folin. Lắc đều trong 10 phút để thực hiện phản ứng. Đo độ hấp thụ ở
bước sóng  600 nm. Ghi nhận kết quả.
3.3.3. Cách tính kết quả
Hoạt tính protease (UI) được tính theo công thức:

𝐗. 𝐕. 𝐊 Trong đó:
𝐭. 𝐦. 𝐯 X: số micromol tyrosin trong v (mL) suy ra từ đường chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng trong ống nghiệm (mL)
K: hệ số pha loãng
t: thời gian enzyme phản ứng (phút)
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
v: thể tích dịch lọc đem phân tích (mL)

C. CÂU HỎI
1. Em hãy cho biết có sự khác biệt về hàm lượng và hoạt tính bromelin thu nhận từ
các bộ phận khác nhau của quả thơm (vỏ quả, thịt quả, chồi quả) ?
2. Qua kết quả thí nghiệm, em hãy cho biết hàm lượng và hoạt tính của bromelin thay
đổi như thế nào trước và sau khi tinh sạch ? Giải thích ?
3. Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng protein (g/mL)
và giá trị độ hấp thụ (OD) (dùng phần mềm excell), trên đồ thị thể hiện phương
trình hồi quy tuyến tính và giá trị R2. Từ đồ thị đường chuẩn suy ra lượng protein.
Tính hàm lượng của protease trong dịch chiết thu được từ quả thơm?
4. Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa lượng tyrosin (M) và giá trị
độ hấp thụ (OD) (dùng phần mềm excell), trên đồ thị thể hiện phương trình hồi
quy tuyến tính và giá trị R2. Từ đồ thị đường chuẩn suy ra lượng tyrosin tạo thành.
Tính hoạt tính của protease trong dịch chiết thu được từ quả thơm.

22