TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG

KHOA KỸ THUẬT Y HỌC

TÀI LIỆU
THỰC HÀNH HÓA SINH 1
(Lưu hành nội bộ)

Giảng viên: ThS. Trần Quốc Huy

CKI.XN. Phùng Bá Trường

TP. Hồ Chí Minh năm 2023

 MỤC LỤC

Bài 1: Các kỹ thuật và kỹ năng cơ bản trong phòng thí nghiệm ....................................... 1
Bài 2: Khảo sát enzyme ..................................................................................................... 8
Bài 3: Hóa học, chuyển hóa glucid và các ứng dụng ........................................................ 12
Bài 4: Hóa học chuyển hóa lipid và các ứng dụng ............................................................ 15
Bài 5: Hóa học, chuyển hóa protid và ứng dụng ............................................................... 17
Bài 6: Hóa học, chuyển hóa hemoglobin và ứng dụng...................................................... 21
Bài 7: Phương pháp đo quang ........................................................................................... 24
BÀI 1: CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

MỤC TIÊU
1. Trình bày được các nguyên tắc cấp cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm.
2. Sử dụng thành thạo một số dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm Sinh hóa.
3. Lấy và bảo quản được mẫu bệnh phẩm đúng quy định.
4. Hiểu được nguyên tắc của phương pháp đo quang để áp dụng trong việc định
lượng các chất.
NỘI DUNG
I. CÁC KỸ THUẬT SƠ CỨU CƠ BẢN TRONG PHÒNG TN SINH HÓA
Sơ cấp cứu là biện pháp tạm thời với các trường hợp thương tích nhẹ hoặc trước khi
đưa bệnh nhân đến bệnh viện.
1. Sơ cấp cứu do phỏng
a. Phỏng do nhiệt (vật nóng như: thủy tinh, kim loại,…)
- Phỏng nhẹ: lấy vải mùng (gạc) tẩm dung dịch acid picric bão hòa hoặc dung dịch
thuốc tím KMnO4 1% đắp lên.
- Phỏng nặng: lấy vải mùng (gạc) tẩm dung dịch acid picric bão hòa hoặc dung dịch
thuốc tím KMnO4 1% đắp nhẹ lên vết phỏng, chở ngay đến bệnh viện. Tránh băng chặt và
tránh dùng vaselin hay thuốc mỡ.
b. Phỏng do hóa chất
Việc trước tiên là ngâm vết thương vào chậu nước to hoặc để vết thương dưới vòi
nước chảy thật nhẹ khoảng 3 – 5 phút nhằm làm trôi hóa chất ra khỏi da. Sao đó trung hòa
bằng hóa chất:
- Phỏng do acid: đắp vải mùng tẩm dung dịch natri bicarbonate 8%
- Phỏng do kiềm: đắp vải mùng tẩm dung dịch acid picric 3%
2. Tai nạn ở mắt
- Khi bị acid hay brom vào mắt: rửa mắt lập tức nhiều lần bằng nước sạch, sau đó tẩm
mắt trong dung dịch natri bicarbonats 1%
- Khi bị chất kiềm vào mắt: xử lý như trên rồi tẩm mắt bằng dung dịch acid boric 1%
3. Ngộ độc
Khi bị chất độc vào miệng:
- Acid: xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch natri bicarbonat 1%
- Kiềm: xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch acid boric 1%
- Các hóa chất khác: xúc miệng nhiều lần bằng nước lạnh.
Nhiễm hơi độc: Đưa nạn nhân ra nơi thoáng khí, nới rộng quần áo cho dễ thở. Cho uống 1
ly cà phê đen hoặc 1 muỗng súp sirô cafein. Hô hấp nhân tạo (nếu cần) trong lúc di
chuyển đến bệnh viện.
4. Điện giật

1
 Trước hết ngắt mọi cầu dao điện có liên quan đến phòng thí nghiệm. Nới rộng quần
áo nạn nhân sau khi đem ra nơi thoáng. Hô hấp nhân tạo trong khi chờ chuyển đến bệnh
viện (trường hợp nặng).
5. Hỏa hoạn
- Ngọn lửa nhỏ: dập tắt bằng khan, vải bố ướt hay cát.
- Nếu bị lửa cháy quần áo: lăn vài vòng dưới đất để dập tắt ngọn lửa, lấy vải ướt trùm
lên chỗ cháy và ép sát cho đến khi lửa tắt. Tránh chạy hoảng.
Lưu ý: Sinh viên phải báo ngay cho nhân viên phòng thí nghiệm hoặc giáo viên hướng
dẫn về mọi sự cố trong phòng thí nghiệm.
II. CÁC DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG VÀ CÁCH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM HÓA SINH
1. Ống nghiệm
- Thường là ống hình trụ bằng thủy tinh, có thể tích khác nhau.
- Khi đun nóng ống nghiệm trên ngọc lửa đền cồn cần lưu ý:
- Dung dịch không được quá 1/3 ống
- Ống nghiệm được kẹp bằng kẹp gỗ hay kẹp kim loại và được giữ nghiêng 45 độ, khi
đun nóng cần lắc nhẹ hoặc khuấy đều ống nghiệm
- Không đun trực tiếp ở đáy ống nghiệm mà đun ở nửa phần trên
- Miệng ống nghiệm không được hướng về phía có người vì nó có thể gây phỏng

Ống nghiệm Đun ống nghiệm

2. Ống hút (Pipette)

Có nhiều loại pipet nhưng có thể chia ra thành 3 loại chính:
- Loại pipet Pasteur bằng thủy tinh không chia vạch.
- Loại pipet chia vạch bằng nhựa hoặc bằng thủy tinh.
- Loại pipet tự động một kênh và nhiều kênh.
❖ Cách sử dụng pipet chia vạch bằng thủy tinh với quả bóp cao su:
- Đối với các loại chất lỏng, ta dùng một quả bóp cao su đặc biệt gắn vào đầu ống hút
(tránh hút bằng miệng).
- Để pipet thẳng đứng, hút dung dịch lên đến bên trên vạch ngang.
- Lấy ngón trỏ bịt đầu trên ống hút (ngón trỏ phải sạch, khô) dùng ngón trỏ để điều
chỉnh thể tích .
2
 - Nâng ống lên cao cho vạch chia độ trên ống hút ngang tầm mắt, đầu ống dựa vào
thành bình rồi cho dung dịch chảy từ từ theo thành bình đến khi đã lấy đủ thể tích cần
dùng cho thí nghiệm thì ngưng (mực nước cong tiếp xúc với vạch trên ống hút).
- Giữ ống hút thẳng đứng rồi chuyển qua bình hứng, đặt đầu ống hút chạm vào thành
bình rồi buông ngón trỏ để dung dịch chảy tự do (bình hứng phải để hơi nghiêng).
- Khi dung dịch không chảy nữa ta xoay đầu ống hút 2-3 vòng trước khi lấy ống hút ra
khỏi bình (không thổi vào ống hút để đuổi giọt thừa còn lại trong ống).
- Khi đọc thể tích cần chú ý đọc theo mặt cầu lõm của chất lỏng không màu hoặc trong
suốt như nước, đọc theo mặt cầu lồi đối với chất lỏng có màu sậm như dung dịch chưa
iod.

Pipet

❖ Micropipette (pipet tự động) có đặc điểm:

- Có thể dùng để hút chính xác một lượng dung dịch rất nhỏ (µl).
- Có thể điều chỉnh thể tích dung dịch cần lấy một cách nhanh chống, dễ dàng và ít sai
số do thao tác.
- Sử dụng ngón cái để điều chỉnh.
3. Một số dụng cụ khác
a. Cốc cỏ mỏ (Becher)
- Cốc cỏ mỏ có nhiều loại với hình dạng và dung tích khác nhau, thường được làm
bằng thủy tinh hay polyethylene.
- Cốc cỏ mỏ được sử dụng trong phòng thí nghiệm để đựng dung dịch, khi đun nóng
phải đun cốc thủy tinh qua lưới amiăng hoặc trên bếp cách thủy. khi đun xong không để
trực tiếp lên vật lạnh để tránh làm vở cốc.
b. Bình cầu
- Bình cầu có nhiều loại với dung tích khác nhau, được làm bằng thủy tinh chịu nhiệt.
- Có hai loại bình cầu: đáy bằng và đáy tròn, cổ bình có thể ngắn hoặc dài, rộng hoặc
hẹp.
- Các bình đáy bằng được dùng để pha dung dịch, đun nóng các chất lỏng hoặc còn
dùng để làm bình rửa. Khi đun nóng phải đặt bình cầu trên lưới sắt. Những bình cầu đáy
tròn được dùng để chưng cất, để đun sôi hoặc để thực hiện những phản ứng cần đun nóng.
- Loại bình cầu có chia vạch để chỉ thể tích chính xác mà dung dịch chiếm được còn
được gọi là bình định mức.
3
c. Ống đong
- Thường được làm bằng thủy tinh hoặc polyethylene.
- Thường có dung tích từ 5ml đến 2.000ml.
- Trên ống đong có chia vạch được sử dụng để đong một lượng dung dịch gần đúng.
Muốn đo thể tích cần thiết của chất lỏng, người ta rót nó vào ống đong cho đến khi đáy
mặt khum ngang mức vạch chia cần thiết.
d. Bình tam giác (Erlen)
- Bình có hình nón làm bằng thủy tinh, có nhiều kích thước khác nhau.
- Được dùng để đựng dung dịch hay dùng trong chuẩn độ thể tích, người ta đun bình
tam giác trên bếp cách thủy.
e. Phễu lọc
- Phễu lọc được làm bằng thủy tinh, dùng để lọc và rót chất lỏng.
- Khi làm việc cần đặt phễu trên chiếc vòng cặp vào giá đỡ. Chú ý không để thân
phễu dính sát vào cổ bình vì sẽ khó rót do áp suất trong bình tăng lên. Do đó cần tạo ra
một khe hở giữa phễu và cổ bình. Khi rót chất lỏng không được đổ đầy tới miệng phễu, vì
như thế nếu phễu hơi nghiêng chất lỏng sẽ trào ra ngoài.
f. Bình định mức
- Bình định mức để pha những dung dịch có nồng độ xác định hoặc để đong một thể
tích chất lỏng thật chính xác.
- Bình định mức là bình cầu có đáy bằng có cổ dài, trên cổ có khắc một vòng tròn.
- Để nạp chất lỏng vào bình định mức ta đặt phễu vào cổ bình rồi rót chất lỏng cho tới
khi mức chất lỏng còn thấp hơn ngấn chia độ 1-2ml sau đó lấy phễu ra rồi dùng pipet nhỏ
từng giọt chất lỏng cho đến khi đáy khum của mặt chất lỏng vừa đúng tới ngấn chia độ.

4
III. CÁCH LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM
A. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU MÁU
1. Yêu cầu
- Mẫu máu phải được lấy lúc đói hoặc sau ăn ít nhất 4-6 giờ, tốt nhất là vào buổi sáng
chưa ăn uống gì, trừ nước. Trường hợp lấy máu làm nhóm xét nghiệm lipid cần nhịn ăn ít
nhất 12 giờ.
- Tránh lấy mẫu máu tại nơi tiêm truyền.
- Tránh làm mẫu máu bị tiêu huyết.
2. Chuẩn bị dụng cụ
Mẫu máu để phân tích các chỉ số hóa sinh thường là máu tĩnh mạch, có khi là máu
động mạch hoặc mao mạch.
Dụng cụ để lấy mẫu máu bao gồm:
- Bơm, kim tiêm (đã vô khuẩn).
- Dây ga rô
- Ống nghiệm đựng mẫu có dán nhãn tên, tuổi. Có chất chống đông hay không tùy
loại xét nghiệm.
- Bông tẩm cồn.
3. Chuẩn bị bệnh nhân
5
 - Tay bệnh nhân phải sạch.
- Nên lấy máu bệnh nhân vào buổi sáng sớm, lúc đói vì nồng độ các chất trong máu
lúc đó phản ánh trung thực thông số thực của bệnh nhân, tránh các yếu tố có thể gây sai
số.
- Chuẩn bị lấy máu, cho bệnh nhân nghỉ ngơi 15-20 phút, giải thích cho bệnh nhân
cách lấy máu để bệnh nhân an tâm khi tiến hành lấy máu. Nhất là trong một số xét nghiệm
như xét nghiệm khí máu (phân tích các rối loạn thăng bằng acid, bazơ), tránh gây tăng
thông khí phổi dẫn đến nhiễm kiềm hô hấp, dẫn đến các thông số định lượng sẽ bị sai
lệch.
4. Cách lấy máu
a. Lấy máu tĩnh mạch
- Thường lấy máu ở nếp gấp khuỷu tay, bệnh nhân có thể nằm hoặc ngồi, tay duỗi
thoải mái trên vật cứng.
- Lấy ống tiêm ra khỏi bao đựng, kiểm tra xem kim bơm có thông không.
- Buộc dây ga rô cách chổ tiêm 5 cm về phía trên.
- Sát khuẩn da thật kỹ và để khô.
- Đưa kim vào tĩnh mạch, mở dây ga rô.
- Kéo lui bơm tim nhẹ nhàng và rút đủ số máu cần thiết tránh tạo bọt khí.
- Tháo dây ga rô, rút kim ra, ấn nhẹ bông nơi tiêm, dán băng keo các nhân.
- Tháo kim ra, bơm máu nhẹ nhàng vào ống nghiệm, đậy nút lại.
- Bơm từ từ máu theo thành ống để tránh làm vỡ hồng cầu.
b. Cách tách huyết thanh
- Lấy máu vào ống nghiệm không có chất chống đông, đậy ống nghiệm bằng nút cao
su hoặc bông mỡ rồi để ở nhiệt độ phòng trong nhiều giờ. Nếu muốn nhanh thì có thể cầm
ống nghiệm trong lòng bàn tay hoặc để ở tủ ấm 30oC để cục huyết thanh hình thành một
cách tự nhiên và tiết ra huyết thanh nhiều nhất.
- Khi cục máu đã đông dùng que thủy tinh nhỏ nhẹ nhàng tách phần cục huyết dính
vào thành ống. Cục huyết dễ co lại và nhanh tiết ra huyết thanh. Gạn lấy huyết thanh hoặc
dùng pipette để hút huyết thanh. Nếu huyết thanh lẫn hồng cầu, đem ly tâm 2.500v/15
phút hoặc 3.000v/5 phút, sau đó dùng micropipette hút lấy huyết thanh.
5. Cách bảo quản mẫu máu
- Huyết tương tách sớm trong vòng 1 giờ sau khi lấy máu.
- Huyết thanh phải tách trước 2 giờ kể từ khi lấy máu, để ở nhiệt độ phòng, đậy kín
tránh bay hơi và nhiễm khuẩn.
- Thời gian bảo quản cho phép với huyết thanh va huyết tương là < 4 giờ ở nhiệt độ
phòng; 1-2 ngày ở 2-8oC. Muốn giữ lâu hơn cần phải để ở ngăn đá và đậy kín nút.
- Các xét nghiệm về enzyme cần làm trên huyết tương hoặc huyết thanh tươi. Định
lượng glucose máu cần làm ngay vì sau 1 giờ nồng độ glucose máu giảm 7%. Bệnh phẩm

6
để làm bilirubin máu nếu chưa phân tích phải bọc giấy đen hoặc giữ tủ lạnh ngăn mát để
tránh chuyển thành biliverdin dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời.
B. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC TIỂU
1. Chuẩn bị dụng cụ
Dùng ống nghiệm to hoặc lọ có nắp. Tất cả phải sạch, khô. Có thể dùng lọ nhựa hoặc
thủy tinh có chia độ theo ml, lit,…
2. Cách lấy mẫu
a. Với các xét nghiệm định tính thông thường: dùng nước tiểu bất kỳ thời gian nào trong
ngày; lấy nước tiểu giữa dòng, bỏ phần đầu. Một số trường hợp nên lấy vào thời gian
thích hợp như:
- Viêm tiết niệu thì nên lấy sáng sớm, lúc mới ngủ dậy.
- Nghi ngờ glucose niệu nên lấy sau bữa ăn 2 giờ.
- Lấy nước tiểu 2 giờ/lần để xét nghiệm tìm urobilinogen trong bệnh tan máu, hoặc để
soi cặn addis.
b. Với các xét nghiệm định lượng: các chất thường phải thu gom nước tiểu 24 giờ. Đến
giờ ấn định cho bệnh nhân tiểu hết, bỏ phần nước tiểu đó đi. Trong 24 giờ tiếp theo hứng
tất cả nước tiểu của bệnh nhân tiểu ra vào cái bô hoặc bình sách (hứng cả phần nước tiểu
khi bệnh nhân đi đại tiện). Ngày hôm sau vào giờ thứ 24 cho bệnh nhân tiểu lần cuối cùng
vào bô hoặc bình ta được nước tiểu 24 giờ.
3. Cách bảo quản mẫu
Khi phân tích các chất trong nước tiểu nên dùng nước tiểu tươi, để ở nhiệt độ phòng
thí nghiệm, nước tiểu sau khi lấy xong nên làm ngay, chậm nhất là 1 giờ sau lấy, do để
lâu nước tiểu bị lên men bởi vi khuẩn, nhiệt độ cao cũng làm hỏng các mẫu nước tiểu.
Nếu chưa phân tích mẫu ngay có thể để mẫu ở 2-8oC trong vòng 3 ngày. Nếu để lâu hơn 3
ngày phải để ở ngăn đá tủ lạnh.

7
 BÀI 2: KHẢO SÁT ENZYME

MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc của các phản ứng trong bài.
2. Thực hiện được các phản ứng hóa học dựa trên các tính chất của enzyme.
3. Nhận định đúng và giải thích được kết quả trong từng phản ứng.
NỘI DUNG
I. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE
Thí nghiệm: Thủy phân tinh bột bằng enzyme amylase
a. Nguyên tắc
Tinh bột khi có mặt của enzyme amylase sẽ bị thủy phân thành các dextrin. Thời gian
thủy phân càng kéo dài sẽ tạo ra các dextrin với phân tử lượng càng nhỏ, cuối cùng cho
maltose rồi glucose. Các sản phẩm tạo thành ở mức độ thủy phân khác nhau sẽ cho các
màu khác nhau với dung dịch iod.
b. Tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch nước bọt: cho vào cốc có mỏ 1 ml nước bọt, thêm vào 9 ml
nước cất, lắc đều, ta được dung dịch nước bọt 1/10.
- Lấy 5 ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 2,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1
ml dung dịch nước bọt 1/10, để các ống nghiệm ở nhiệt độ thường. Sau đó lần lượt cho
vào mỗi ống 2 giọt dung dịch iod 1% với thời gian như sau:
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Thời gian Sau 1 phút Sau 5 phút Sau 10 phút Sau 15 phút Sau 20 phút
- Quan sát sự tạo màu ở các ống nghiệm, ghi nhận và giải thích.
Chú ý:
• Nếu ống thứ 5 vẫn có màu xanh phải pha lại dung dịch nước bọt ở đậm đặc hơn.
• Nếu có màu vàng ngay từ đầu, phải pha loãng nước bọt.
II. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE
1. Nhiệt độ
a. Nguyên tắc: Mỗi enzyme có một nhiệt độ hoạt động tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của
amylase động vật là 37oC. Ở 0oC hoạt tính của enzyme là thấp nhất (không bị biến tính).
b. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm , lần lượt cho vào mỗi ống:
Dung dịch hồ Để ở nhiệt độ Thêm dung dịch Để ở nhiệt độ
tinh bột 1% trong 5 phút nước bọt 1/10 trong 5 phút
Ống 1 1 ml o
0C 10 giọt 0oC
Ống 2 1 ml 37oC 10 giọt 37oC
Ống 3 1 ml 100oC 10 giọt 100oC

8
 Nhỏ 3 giọt iod (đánh số thứ tự giọt (1), giọt (2), giọt (3)) lên 1 tấm gạch men. Sau đó
dùng pipette lần lượt:
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 1 lên giọt iod (1)
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 2 lên giọt iod (2)
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 3 lên giọt iod (3)
Quan sát màu tạo thành sau 5 phút, 10 phút, 15 phút. Ghi nhận và giải thích
2. Chất hoạt hóa và chất ức chế
a. Nguyên tắc
Một số ion kim loại có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme (phần lớn là các ion
kim loại nặng); một số ion kim loại lại có tác dụng hoạt hóa enzyme như Na2+, Mg2+….
b. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống:
Dung dịch hồ Dung dịch Dung dịch Nước bọt
Nước cất
tinh bột 1% NaCl 1% CuSO4 1% 1/10
Ống 1 1 ml 1 giọt 0,5 ml
Ống 2 1 ml 1 giọt 0,5 ml
Ống 3 1 ml 1 giọt 0,5 ml
Nhỏ 3 giọt iod (đánh số thứ tự giọt (1), giọt (2), giọt (3)) lên 1 tấm gạch men. Sau đó
dùng pipette lần lượt:
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 1 lên giọt iod (1)
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 2 lên giọt iod (2)
• Nhỏ 1 giọt dung dịch ống 3 lên giọt iod (3)
Quan sát màu tạo thành sau 5 phút, 10 phút, 15 phút. Ghi nhận và giải thích.
III. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLASE TRONG NƯỚC TIỂU (PHƯƠNG PHÁP
WOHLGEMUTH)
1. Nguyên tắc
Dùng phương pháp pha loãng dần nước tiểu để tìm lượng enzyme tối thiểu phân
hủy hết 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%o ở 370C trong 30 phút.
Kiểm soát độ phân hủy của tinh bột bằng iod. Tính hoạt độ của Amylase theo đơn
vị Wohlgemuth.
Định nghĩa 1 đơn vị Wohlgemuth: là lượng Amylase có khả năng thủy phân 1ml
dung dịch hồ tinh bột 1%o ở 370C trong 30 phút.
2. Thuốc thử
- Dung dịch NaCl 9%o
- Dung dịch hồ tinh bột 1%: cân chính xác 1g tinh bột, hòa tan trong nước sôi cho
tan, thêm nước cất vừa đủ 1 lít, bảo quản với acid benzoic, để trong tủ lạnh.
- Dung dịch iod N/50
3. Tiến hành

9
Lấy 8 ống nghiệm đánh số tứ 1 đến 8
- Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch NaCl 9%o.
- Cho vào ống 1: 1ml nước tiểu. Tráng ống hút bằng cách hút lên hút xuống 1 – 2
lần. Trộn đều.
- Hút 1ml của ống 1 sang ống 2. Cũng tráng và trộn đều như trên.
- Hút 1ml của ống 2 sáng ống 3. Tiếp tục làm như vậy cho đến ống số 7. Đến ống
số 7 hút 1ml bỏ đi. Như vậy nước tiểu ở các ống theo thứ tự đã được pha loãng theo tỷ lệ:

1/16
- Thêm nhanh vào mỗi ống đúng 2ml hồ tình bột 1%o, lắc đều. Để cách thủy ở
37 C trong 30 phút.
0

- Lấy ra, cho nhanh vào mỗi ống 1 giọt dung dịch iod N/50, lắc đều.
- Quan sát màu của các ống ở ngay thời điểm trên.
+ Các ống nào mà tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành glucose, maltose thì
không màu.
+ Các ống tinh bột bị thủy phân dở dang ở dạng dextrin có màu trung gian.
+ Ống còn tinh bột có màu xanh dương.
4. Kết quả
- Chọn ống để biểu diễn kết quả: chọn ống có màu trung gian hay không màu ngay
trước ống có màu xanh dương trước hiện ra.
Thí dụ: ống 5 là ống đầu tiên có màu xanh. Ống biểu diễn kết quả là ống 4. Ống 4 chứ
1/16ml nước tiểu.
1/16ml nước tiểu có khả năng thủy phân 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%o. Vậy 1ml
nước tiểu sẽ thủy phân 2 x 16 ml nước tiểu.
Nước tiểu có hoạt độ Amylase là 32 đơn vị Wohlgemuth.
Hoạt độ Amylase theo đơn vị Wohlgemuth = Độ pha loãng nước tiểu của ống biểu diễn
kết quả x 2
5. Biện luận
Bình thường: từ 16 đến 32 đơn vị (có thể thay đổi từ 8 – 64 đơn vị)

10
 Amylase là một nhóm enzyme thủy phân tinh bột hoặc glycogen, cắt đứt liên kết
glucozid 1 – 4, tạo thành sản phẩm trung gian gọi là dextrin và cuối cùng thành maltose,
glucose. Dextrin này cũng cho màu sắc khác nhau khi tác dụng cới iod.
Amylase huyết thanh có nguồn gốc chính từ tuyến nước bọt và tuyến tụy, được lọc
ở cầu thận và bài tiết qua nước tiểu. Vì vậy, hoạt độ amylase trong nước tiểu cũng phản
ánh hoạt độ amylase trong huyết thanh.
Trong viêm tụy cấp, amylase niệu có thể tăng quá 200đv, đôi khi tới 4.000 –
5.000đv. Trị số tối đa đạt vào lúc 12 – 24 giờ, sau khi xuất hiện những triệu chứng đầu và
trở lại bình thường sau 2 – 3 ngày. Vì trị số amylase trong nước tiểu rất hay thay đổi, nên
nếu chỉ định lượng trong mẫu nước tiểu thì kết quả sẽ ít chính xác hơn khi kết hợp với
định lượng amylase trong huyết thanh.
Trường hợp có suy thận, định lượng amylase (huyết thanh và nước tiểu) đều không
có giá trị chẩn đoán.
Amylase giảm chỉ có ý nghĩa rất ít.

11
 BÀI 3: HÓA HỌC, CHUYỂN HÓA GLUCID VÀ CÁC ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc của các phản ứng trong bài.
2. Thực hiện được các phản ứng hóa học dựa trên các tính chất của các loại đường
đã học và các hiện tượng xảy ra.
3. Áp dụng tính chất khử của đường để định lượng glucose và tìm đường trong nước
tiểu.
4. Nhận định đúng và biện luận được kết quả định lượng glucose trong huyết thanh.
NỘI DUNG
I. KHẢO SÁT MONOSACARIDE VÀ DISACARIDE
Thí nghiệm 1: Phản ứng Fehling (phản ứng khử)
a. Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm mạnh, đun nóng, các MS có nhóm aldehyde đều
có tính khử, dễ dàng khử các muối kim loại nặng như Cu++, Pb++, Ag+, … Các nối đôi bị
cắt đứt tạo những hỗ hợp đường – acid.
Cu2+
MS Base mạnh Cu+ hh đường - acid

OH-

CuOH
to

Cu2O đỏ gạch

Những DS có chứa nhóm –OH bán acetal tự do cũng cho phản ứng này.
b. Tiến hành
Lấy 5 ống nghiệm lần lượt cho vào mỗi ống:
Ống nghiệm Thuốc thử Fehling Đường MS
Ống 1 1 ml 0,5 ml Glucose 1%
Ống 2 1 ml 0,5 ml Fructose 1% Đun sôi cách thủy
Ống 3 1 ml 0,5 ml Lactose 1% 5 phút
Ống 4 1 ml 0,5 ml Saccarose 1%
Ống 5 1 ml 0,5 ml Hồ tinh bột 1%
- Quan sát, nhận xét kết quả và giải thích hiện tượng xảy ra.
- Ứng dụng tìm đường trong nước tiểu: thực hiện các bước tương tự như trên với ống
nghiệm 6 là nước tiểu.
Thí nghiệm 2: Phản ứng Molish
a. Nguyên tắc
Các loại glucid đều cho phức màu tím với dung dịch naphtol trong acid sulfuric đậm
đặc.
12
 Thuốc thử Molish: dung dịch Naphtol 1% trong alcol 900
b. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm lần lượt cho vào mỗi ống:
Ống nghiệm Đường MS Thuốc thử Molish H2SO4 đậm đặc
Ống 1 1 ml Glucose 1% 3 giọt 1 ml
Ống 2 1 ml Fructose 1% 3 giọt 1 ml
Ống 3 1 ml Hồ tinh bột 1% 3 giọt 1 ml
Chú ý:
❖ Khi cho acid sulfuric đậm đặc vào các ống nghiệm phải nghiêng ống nghiệm, cho
từ từ dọc theo thành ống và không được làm xáo trộn 2 lớp dung dịch.
❖ Phản ứng dương tính khi có xuất hiện vòng màu tím ở bề mặt phân cách giữa 2 lớp
chất lỏng.
- Quan sát, nhận xét cường độ màu ở các ống nghiệm và giải thích hiện tượng xảy ra.
- Nêu ý nghĩa của phản ứng Molish.
II. PHẢN ỨNG MÀU CỦA POLYSACARIDE
Thí nghiệm 3: khảo sát tinh bột
a. Nguyên tắc
Tinh bột không tan trong nước lạnh, trong nước nóng tạo thành dung dịch keo gọi là
hồ tinh bột. Tinh bột kết hợp với iod tạo dung dịch màu xanh tím.
b. Tiến hành
Cho vào 1 ống nghiệm 1 ml hồ tinh bột 1%, thêm vào 1 giọt thuốc thử iod. Quan sát
thấy xuất hiện màu xanh. Đem đun sôi vài phút trên ngọn đèn cồn đến khi mất màu xanh,
làm lạnh trong cốc nước lạnh đến khi xuất hiện lại màu xanh.
- Ghi nhận và giải thích hiện tượng?
III. PHẢN ỨNG TÌM GLUCOSE TRONG NƯỚC TIỂU
Thí nghiệm 4: phương pháp Benedict
a. Nguyên tắc: glucose có nhóm aldehyde sẽ khử Cu2+ thành Cu+ trong môi trường kiềm
đun nóng, tạo kết tủa đồng (I) oxyd Cu2O có màu đỏ gạch.
Thuốc thử: thuốc thử Benedict:
Dung dịch A: Natri citrate 173g
Natri carbonat (Na2CO3) 200g
Nước cất đun nóng 700ml
Dung dịch B: CuSO4.5H2O 17.3g
Nước cất 100ml
Đổ dung dịch B từ từ vào A, lắc đều. Thêm nước cất vừa đủ 1000ml. Đun sôi cách thủy.
Thuốc thử phải không có tủa đỏ. Bảo quản được lâu dài.
b. Tiến hành:
Cho vào 1 ống nghiệm: 2 ml thuốc thử Benedict (hoặc thuốc thử Fehling), thêm tiếp
vào 0,5 ml nước tiểu. Đun sôi cách thủy. Quan sát và ghi nhận lại sự chuyển màu.
13
Kết quả:
- Phản ứng âm tính (-): thuốc thử trong, màu lam
- Phản ứng dương tính (+): thuốc thử có màu xanh lá, có ít tủa < 5g/l
- Phản ứng dương tính (++): đun sôi 1 phút có kết tủa vàng sẫm hoặc đỏ gạch 5-10 g/l
- Phản ứng dương tính (+++): đun sôi, tủa đỏ gạch nhiều 10-20 g/l
- Phản ứng dương tính (++++): có kết tủa màu nâu sẫm ngay lúc mới bắt đầu sôi > 20 g/l
Ý nghĩa: người ta gọi phản ứng Benedict là phản ứng bán định lượng vì thông qua phản
ứng định tính này, người ta có thể ước chừng được lượng glucose có trong nước tiểu.
Thuốc thử Fehling chỉ có thể định tính glucose trong nước tiểu (có hoặc không có glucose
trong nước tiểu).
IV. PHẢN ỨNG SELIWANOFF (ĐẶC HIỆU CHO CETOZ)
a. Nguyên tắc
Fructose và những cetohexose khác tạo thành Hydroxymetyl-furfural, khi đun nóng với
acid vô cơ, chất này tác dụng với Resorcinol cho phức màu đỏ.
Các Aldose cũng có thể tạo thành Hydroxylmetyl – furfural khi đun nóng với acid, nhưng
phản ứng xảy ra rất chậm, nên phản ứng Seliwanoff có tính đặc hiệu cho cetose.

Phức hợp
màu đỏ

b. Thuốc thử
Thuốc thử Seliwanoff: Resorcinol (hay Resorcin) 0.05g
HCl pha loãng 1/3 100ml.
c. Tiến hành: lần lượt cho vào 2 ống nghiệm
Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2
Thuốc thử Seliwanoff 1ml 1ml
Dung dịch đường 0.5ml Frucotse 1% 0.5ml Glucose 1%
Đun sôi cách thủy 10 phút
Nhận xét, giải thích kết quả

14
 BÀI 4: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA LIPID VÀ CÁC ỨNG DỤNG
MỤC TIÊU
1. Thực hiện được các phản ứng hóa học chứng minh được tính chất hòa tan của
lipid.
2. Áp dụng tính chất của lipid để tìm các thể ceton trong nước tiểu.
3. Biện luận các được các kết quả phản ứng và giải thích được các hiện tượng xảy ra.
4. Nhận định đúng và biện luận được kết quả định lượng cholesterol trong máu.
NỘI DUNG
I. KHẢO SÁT TÍNH HÒA TAN
a. Nguyên tắc: Lipid thuộc nhóm các hợp chất không tan hoặc ít tan trong nước và dung
môi phân cực, dễ tan trong các dung môi hữu cơ (không phân cực). Mức độ hòa tan của
lipid phụ thuộc vào mức độ phân cực của dung môi theo tỉ lệ nghịch.
b. Tiến hành:
Lấy 3 ống nghiệm lần lượt cho vào mỗi ống:
Ống nghiệm Dầu ăn Etanol Aceton Nước cất
Ống 1 3 giọt 1 ml
Ống 2 3 giọt 1 ml
Ống 3 3 giọt 1 ml
Nhận xét và giải thích kết quả ở 3 ống.
II. KHẢO SÁT CHOLESTEROL: phản ứng Liebermann
a. Nguyên tắc:
Phản ứng màu của cholesterol dựa trên cơ chế chung, dưới tác dụng khử nước của
acid sulfuric, 2 phân tử cholesterol bị mất đi 2 phân tử nước và kết hợp lại với nhau ở vị
trí C3 tạo ra một hợp chất có công thức thô là C54H88 rồi sau đó phản ứng với 2 phân tử
H2SO4 để sinh ra hợp chất màu đỏ. Nếu có mặt anhydride acetic thì sẽ sinh ra hợp chất
màu xanh lục đặc trưng, trong đó chỉ có một gốc acid sulfuric.

Cholesterol
b. Tiến hành:
Lấy 2 ống nghiệm lần lượt cho vào mỗi ống:
Ống nghiệm Cholesterol Acid sulfuric Anhydride acetic
Ống 1 0,5 ml 10 gọt 1 ml
Ống 2 0,5 ml 10 gọt
Lắc đều, để trong tối 10 phút

15
 Quan sát màu tạo thành ở 2 ống nghiệm.
III. TÌM CÁC THỂ CETON TRONG NƯỚC TIỂU
a. Nguyên tắc: Natri nitroprussiat tác dụng với các thể ceton trong môi trường kiềm cho
phức chất có màu tím.
OH-
Ceton + Natri nitroprussiat Phức chất có màu tím
b. Tiến hành:
Cho vào 1 ống nghiệm:
- 10 giọt nước tiểu
- 2 giọt acid acetic đđ
- 2 giọt Natri nitroprussiat 10%
Trộn đều, nghiêng ống nghiệm 45 độ, nhỏ từ tù theo thành ống khoảng 10 giọt
ammoniac đậm đặc (không được lắc).
Sau vài phút nếu có ceton sẽ thấy vòng màu tím ở mặt phân cách 2 lớp dung dịch.
Biện luận:
- Bình thường không có các thể ceton trong nước tiểu.
- Ceton xuất hiện trong nước tiểu trong những trường hợp: bệnh tiểu đường nặng
hoặc điều trị bằng insulin không đủ liều, bệnh nhân đe dọa bị hôn mê; nhịn đói lâu ngày,
nôn nhiều; vận động cơ nhiều, cushing,…
IV. PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA
a. Nguyên tắc: Dưới tác dụng của dung dịch kiềm, Glycerid bị thủy phân tạo thành
Glycerol và muối Natri/Kali của acid béo (xà phòng)
H2 C O C R1 H2 C OH R1COOK

O
to
HC O C R2 3KOH HC OH R2COOK

H2C O C R3 H2 C OH R3COOK
O

Triglycerid Glycerol Xà phòng

b. Tiến hành.
Chuẩn bị 2 bình erlen 250ml. Thêm vào 10ml NaOH và 2ml dầu ăn
Đem đun sôi cách thủy khoảng 30 phút, vừa đun vừa lắc nhẹ.
Khi dung dịch trở nên quánh, thêm nước cất nóng để hòa tan xà phòng (vưa đủ 6ml)
Lấy 2ml dung dịch trong erlen cho vào một ống nghiệm khác, thêm vào 5ml nước cất.
Lắc mạnh sẽ thấy xuất hiện bọt xà phòng.
Ghi nhận kết quả thí nghiệm.

16
 BÀI 5: HÓA HỌC, CHUYỂN HÓA PROTID VÀ ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc của các phản ứng.
2. Thực hiện một số phản ứng hóa hoc dựa trên các tính chất hóa học và vật lý của
acid amin, peptid, protein đã học.
3. Áp dụng tìm protein trong nước tiểu và định lượng protein trong huyết thanh.
4. Nhận biết, biện luận và giải thích kết quả.
NỘI DUNG
- Thí nghiệm 1: Phản ứng Ninhydrin
- Thí nghiệm 2: Phản ứng Biuret
- Thí nghiệm 3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu
- Thí nghiệm 4: Phản ứng tủa protein bởi acid mạnh và không đun nóng
- Thí nghiệm 5: Tìm protein trong nước tiểu bằng 2 phương pháp: Đông kết và
Heller
- Thí nghiệm 6: Phản ứng định lượng protein toàn phần trong huyết thanh
Thí nghiệm 1: Phản ứng Ninhydrin
1. Nguyên tắc
Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng với Ninhydrin 0,2% sẽ cho
màu xanh tím.
Protid t0
Dung dich: Peptid + dung dịch Ninhydrin 0,2% xanh tím
Acid amin

Ninhydrin là một chất oxy hóa nên có thể tạo nên phản ứng carboxyl oxy hóa của
acid amin với H2O, để cuối cùng cho ra CO2, NH3 và một aldehyde ngắn đi một carbon so
với acid amin gốc và Ninhydrin bị khử. Sau đó, Ninhydrin bị khử lại tác dụng lại với NH 3
vừa được phóng thích và kết hợp với một phân tử Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm
ngưng kết có màu xanh tím.
Đây là phản ứng chung cho các Protid và acid amin tự do. Phản ứng này cho phép
nhận dạng tất cả các acid amin có nhóm NH2 và COOH tự do. Ngoại trừ prolin và OH
Prolin tác dụng với Ninhydrin cho màu vàng.

17
 O

C OH H
C R C COOH
C OH
NH2
O
Ninhydrin acid amin

COOH O

R C NH R C COOH NH3
acid imin to
-3H2O
Đo lượng khí CO2
R CHO CO2
aldehyd

O O

C OH H H HO C
C N C
C H HO C
H
O O Ninhydrin
Hydrindatin
-3H2O

O NH4 O O O

C C +NH3 C C
C N C C N C
C C C H C

O O O O

Phức màu xanh Phức màu tím

2. Tiến hành
Dung dịch A Ống 1 Ống 2 Ống 3
Acid amin tự do 1ml
Dd peptid (glutathione) 1ml
Dd lòng trắng trứng 1ml
Ninhydrin 0,2% 1ml 1ml 1ml

Đun sôi. Câu hỏi: quan sát, nhận xét và giải thích

Thí nghiệm 2: phản ứng biuret (xác nhận liên kết peptid)
1. Nguyên tắc
Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phức chất màu tìm hồng,
phản ứng xảy ra do các liên kết peptid.
Sở dĩ gọi là phản ứng Biuret là do chất Biuret (có nhóm CO-NH, giống như một
liên kết peptid) cũng cho phản ứng tương tự, tạo phức hợp có màu giống như protein.
Sự tạo thành Biuret:

18
2. Tiến hành
Cho vào ống nghiệm
Dung dịch lòng trắng trứng 1ml
Dung dịch NaOH 40% 0,5ml
Dung dịch CuSO4 3 giọt
Lắc đều
Câu hỏi: quan sát màu, nhận xét và giải thích
Thí nghiệm 3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu
1. Nguyên tắc
Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trong đó các tiểu phân
protein tích điện cùng dấu và mang lớp áo nước (hydrat hóa). Nhờ tích điện cùng dấu nên
các tiểu phân protein đẩy nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cách nhau, vì vậy
dung dịch keo protein tương đối bền vững.
Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein do chuyển động sẽ gặp nhau,
dính vào nhau tạo thành những hạt to và kết tủa.
1.1. Làm mất protein bằng cách:
- Thêm chất điên giải như NaCl, (NH4)2SO4,..
- Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pHi đẳng điện của protein. Các tiểu
phân protein khi đã mất điện tích chỉ còn lớp áo nước thì dễ bị kết tủa nếu làm mất lớp áo
nước thì protein sẽ kết tủa.
1.2. Làm mất lớp áo nước của protein
- Thêm chất khử vào môi trường chứa protein (ví dụ: alcohol, aceton,
(NH4)2SO4,..)
- Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid hay kiềm mạnh hoặc
muối kim loại nặng.
2. Thuốc thử
Dung dịch acid acetic 1% và 10%
Dung dịch NaCl bão hòa
19
 Dung dịch NaOH 10%
3. Tiến hành
Dung dịch ống 1 2 3 4 5
Lòng trắng trứng đã thẩm tích 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1ml
Acid acetic 1% 2 giọt
Acid acetic 10% 5 giọt 5 giọt
NaCl bão hòa 2 giọt
NaOH 10% 2 giọt
Đun sôi cách thủy cả 5 ống

Câu hỏi: Nhận xét, giải thích kết quả từng ống và giải thích ống nào tủa, ống nào
không tủa?
Thí nghiệm 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và không đun nóng
1. Nguyên tắc
Các acid vô cơ mạnh (HNO3, H2SO4, HCl,…) và các acid hữu cơ (acid
trichloracetic, acid Sulfosalicylic) có tác dụng làm biến tính và kết tủa đại đa số protein.
2. Tiến hành
- Acid vô cơ: cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng, để nghiêng ống
nghiệm 450, nhỏ từ từ lên thành ống nghiệm cho chảy xuống 1 ml HNO3 đậm đặc. Quan
sát hiện tượng ở mặt phân cách 2 dung dịch
- Acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm
Dung dịch lòng trắng trứng 2ml
Dung dịch TCA 3% 1ml
Trộn đều, quan sát dung dịch
Thí nghiệm 5: Tìm protein trong nước tiểu
Để làm phản ứng này, sinh viên xem lại nguyên tắc thí nghiệm 3 và 4, vì đây là
ứng dụng của 2 phản ứng đã học trên
1. Phương pháp đông kết: tủa protein bằng dung dịch acid yếu + đun nóng.
Cho vào ống nghiệm 5 ml nước tiểu, đem đun sôi trong 2 phút.
Sau đó cho thêm vào khoảng 3 – 5 giọt acid acetic 1%.
Nếu trong nước tiểu có protein sẽ thấy trầm hiện (tủa).
2. Phương pháp Heller: tủa protein bằng acid mạnh và không đun
Cho vào ống nghiệm 2 ml nước tiểu. Sau đó nghiện ống nghiệm và cho vào từ từ
1ml HNO3 đậm đặc.
Quan sát ở mặt phân cách 2 chất lỏng này sẽ thấy protein kết tủa như một đám mây mờ.
Chú ý: nếu nước tiểu quá cô đặc hoặc có acid uric thì cũng cho kết quả giống như
trên (dương tính giả). Trường hợp này có thể tránh bằng cách pha loãng nước tiểu 3 – 4
lần

20
 BÀI 6: HÓA HỌC, CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc của phản ứng trong bài
2. Thực hiện phản ứng theo kỹ thuật
3. Trình bày được vai trò của một số thuốc thử sử dụng trong bài
4. Nhận định đúng và biện luận được kết quả các phản ứng vừa làm.
NỘI DUNG
1. Phản ứng tìm sắc tố mật trong nước tiểu (kỹ thuật Fouchet)
2. Phản ứng tìm muối mật trong nước tiểu (phản ứng HAY)
3. Phản ứng tìm máu trong nước tiểu

Thí nghiệm 1. Phản ứng tìm sắc tố mật trong nước tiểu (kỹ thuật Fouchet)

Sắc tố mật có nghĩa rộng để chỉ các sắc tố của quá trình thoái hóa Hb.
Sắc tố mật trong nước tiểu là bilirubin trong nước tiểu (bilirubin trực tiếp).
1. Nguyên tắc
Dùng BaCl2 để kết tủa bilirubin dưới dạng muối không tan Bari Bilirubinat.
Phản ứng xảy ra như sau:
BaCl2 + Bilirubin Bari Bilirubinat (không tan)
Oxy hóa muối này bằng FeCl3, biến Bilirubin thành Biliverdin có màu xanh ve.
2. Thuốc thử
- Dung dịch BaCl2 10% 100ml
- Dung dịch amonisulfat bão hòa (=76%) 50ml
- Thuốc thử Fouchet:
Acid Tricloacetic 25% 100ml
Dung dịch FeCl3 10% 10ml
3. Tiến hành
Trong ống nghiệm cho
- Nước tiểu: 5ml
- BaCl2: 2,5 ml
- Amonisulfat bão hòa 2 – 3 giọt
Lắc đều, lọc lấy tủa, mở rộng giấy lọc, nhỏ vào chính giữa một giọt thuốc thử Fouchet,
nếu có Bilirubin sẽ xuất hiện quanh giọt thuốc thử một vòng màu xanh ve.
- Nhận định kết quả
- Quan sát, nhận xét, giải thích hiện tượng?
4. Biện luận kết quả
- Bình thường không có bilirubin trong nước tiểu

21
 - Bệnh lý: nếu có bilirubin thì đó là bilirubin trực tiếp. Gặp trong các trường hợp
bệnh lý gây vàng da tại gan và sau gan. Thí dụ: viêm gan siêu vi, viêm gan do ngộ độc
hóa chất, vàng da do tắc đường dẫn mật.

Thí nghiệm 2: Phản ứng tìm muối mật trong nước tiểu (phản ứng HAY)

1. Nguyên tắc
Các muối kiềm của acid mật làm giảm rõ rệt sức căng bề mặt của nước tiểu. Dùng
lưu huỳnh thăng hoa để phát hiện hiện tượng này.
2. Thuốc thử: bột lưu huỳnh thăng hoa
3. Tiến hành
- Cho vào ống nghiệm 10ml nước tiểu, rắc nhẹ nhành lên mặt một dùm lưu huỳnh
thăng hoa.
- Phản ứng dương tính: khi lưu huỳnh rơi xuống đáy ống nghiệm.
- Nếu có lượng nhỏ muối mật thì sau 15 phút lưu huỳnh chỉ dàn thành lớp mỏng
mà không rơi xuống đáy ống nghiệm và phải gõ nhẹ thành ống, lưu huỳnh mới rơi xuống
đáy.
- Nếu gõ nhẹ mà lưu huỳnh không rơi xuống đáy thì phản ứng âm tính.
Phản ứng này không đặc hiệu, dương tính kể cả khi nước tiểu có thymol, phenol.
4. Nhận định kết quả
- Quan sát cần chú ý gì trong ống nghiệm
- Nhận định kết quả trên lâm sàng
- Giải thích cơ chế tại sao khi có muối mật trong nước tiểu thì lưu huỳnh rơi xuống
đáy ống nghiệm.
5. Biện luận
- Sắc tố mật, muối mật là hai thành phần quan trọng của mật, liên quan chủ yếu
đến bệnh gan mật.
- Vai trò của muối mật: nhũ tương hóa lipid trong thức ăn, giúp tiêu hóa các chất
mỡ và vitamin tan trong mỡ.
- Phản ứng tìm sắc tố mật, muối mật trong nước tiểu giúp chẩn đoán các bệnh về
mật, viêm gan: sắc tố mật, muối mật không xuống ruột được nên tràn ra máu vả ra nước
tiểu.

Thí nghiệm 3: Phản ứng tìm máu trong nước tiểu (phản ứng Mayer)

1. Nguyên tắc
Hemoglobin (ngay cả khi bị biến tính) có tác dụng như Peroxydase giải phóng oxy
hoạt động từ Hydroxyl (nước oxy già). Oxy già có khả năng oxy hóa một số thuốc thử để
cho những màu đặc biệt (ví dụ: phenolphthalein bị khử, pyramidin, pyridine,…)
22
 Đối với Phenolphtalein, O2 này sẽ oxy hóa dạng khử của phenolphthalein phức
màu đỏ.
2. Thuốc thử
- Cồn acetic 2%: acid acetic 2ml
Cồn 90 0
100ml
- H2O2 12 thể tích
- Thuốc thử Mayer:
Phenolphtalein 1g
KOH 20g
Bột kẽm 10g
Nước cất 100ml
Đun sôi tới khi mất màu, lọc nóng, để lọ thủy tinh, cho thêm bột kẽm để bão quản.
3. Tiến hành kỹ thuật
Đun sôi nước tiểu để loại bỏ một số peroxidase. Cho vào ống nghiệm:
Nước tiểu đã đun sôi 1ml
Cồn acetic 1ml
Thuốc thử Mayer 0,3ml
H2O2 12V 1 giọt
Nếu có máu hay Hb trong nước tiểu thì sẽ xuất hiện màu đỏ trong 2 phút.
Chú ý:
- Phản ứng rất nhạy, do vậy màu phải xuất hiện ngay. Nếu sau 2 phút mới có màu
thì coi như phản ứng âm tình (tức là không phải do Hb tác dụng).
- Muốn phân biệt Hb hay hồng cầu thì phải ly tậm soi cặn lắng nước tiểu, nếu có
hồng cầu thì kết luận có máu trong nước tiểu.
4. Biện luận kết quả
- Bình thường không có máu hay Hb trong nước tiểu
- Trong một số trường hợp bệnh lý:
+ Có thể tiểu ra Hb như trong thiếu máu thiếu G6PD, truyền nhầm nhóm
máu,…
+ Có thể tiểu ra máu (hồng cầu) như: sạn đường tiểu, lao đường tiêỉ, ung thư
bọng đái, ung thư thận,…

23
 BÀI 7: PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc phương pháp đo quang
2. Thao tác đúng định lượng xét nghiệm trên máy đo quang

1. NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

1.1. Định luật cơ bản về sự hấp thụ ánh sáng (định luật Beer – Lambert)
Chiếu 1 chùm tia đơn sắc có bước sóng 𝜆, cường độ I0 vào 1 dung dịch màu đồng
nhất có nồng độ C, chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua là I. Khi đi qua dung
dịch, một phần ánh sáng bị hấp thu (Ih), một phần bị phản xạ (Ip), phần còn lại I đi qua
dung dịch.
I0 = Ih + Ip + I
Vì phần phản xạ Ip rất nhỏ nên có thể coi như I0 = Ih + I
Dựa trên thực nghiệm Beer – Lambert đã chứng minh và nêu ra định luật
Những lớp chất có chiều dày đồng nhất trong những điều kiện khác như nhau, luôn luôn
hấp thu một tỉ lệ như nhau của chùm tia rọi vào những lớp chất đó.
Beer – Lambert mô tả sự liên hệ giữa các yếu tố trên bằng một định luật biểu diễn như sau
𝐼 = 10𝑘𝑙𝑐 ℎ𝑎𝑦 𝐿𝑜𝑔 𝐼0 = 𝑘𝑙𝑐
𝐼0 𝐼
Với k = hệ số hấp thu, phụ thuộc vào bản chất của chất màu và dung môi, bước sóng của
chum tia và nhiệt độ.
𝐼
= 𝑇 (𝑇𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒)
𝐼0
Với T: độ truyền quang hay độ thấu quang thường tính %
𝐼0
𝐿𝑜𝑔 = 𝐷 (𝐷. 0 = 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑒 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒) = 𝑚ậ𝑡 độ 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑔 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑑ị𝑐ℎ
𝐼
D = Log100%T
D= klc
Định luật Beer – Lambert chỉ đúng với chùm tia đơn sắc
Theo công thức trên, trong cùng một điều kiện, khi k và l không đổi, ta nhận thấy
mật độ quang tỉ lệ thuận với nồng độ cùa dung dịch. Do đó nếu so sánh nồng độ chưa biết
của một dung dịch với một nồng độ mẫu.
Ta có:
D=klC
D0=klC0
=> 𝐷 = 𝐶 𝑣ớ𝑖 𝐷 = 𝐷. 𝑂 = 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑒 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒
𝐷0
𝐶
0
Nếu biết được mật độ quang của ống đo (D), mật độ quang của ống mẫu (D0) và nồng độ
của ống mẫu (C0) ta tính đươc nồng độ C của ống muốn đo
24
 𝐷
𝐶 𝑥 𝐶0
𝐷
= 0
Trong đó
C: Nồng độ chất muốn đo
C0: Nồng độ chất chuẩn (mẫu)
D: Mật độ quang chất muốn đo
D0: Mật độ quang chất chuẩn (mẫu)
1.2. Phương pháp định lượng đo quang
Dựa trên cơ sở mật độ quang của dung dịch của một chất phụ thuộc vào nồng độ của
chất đó, ta dùng máy quang phổ kế (photometre) để đo mật độ quang của chất mà ta cần
xác định nồng độ.
Chuyển chất X cần xác định nồng độ, không màu thành hợp chất có màu đặc biệt
RX bằng thuốc thử thích hợp
R + X ---→ RX (X không màu, muốn đó; RX có màu)
Đặc điểm chủ yếu của máy này là ánh sáng sau khi đi qua dung dịch, được chiếu lên
trên tế bào quang điện để chuyển thành dòng điện mà cường độ của nó được đo nhờ 1
điện kế nhạy.
Trong các phép định lượng đo quang, người ta thường đo O.D (mật độ quang) của
các dung dịch màu đối chiếu với ống trắng bằng ống chứng. Ống trắng là ống chứa thuốc
thử như ống đo, trừ chất ta cần xác định.
1.3. Phương pháp đo mật độ quang trong hóa sinh
- Phương pháp đo điểm cuối (end point)
- Phương pháp đo động học (kinetic)
- Phương pháp đo factor
Tùy theo xét nghiệm của nhà sản xuất mà bộ KIT có thể có 1 trong 3 phương pháp trên để
tính ra kết quả.
2. ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG HUYẾT THANH
Xét nghiệm đo lượng glucose trong huyết thanh hoặc huyết tương để xác định lượng
glucose trong máu ở trong giới hạn bình thường, nhằm mục đích tầm soát, chẩn đoán và
theo dõi bệnh tiểu đường và tiền tiểu đường.
a. Nguyên tắc:
Phương pháp glucose oxidase được mô tả theo sơ đồ phản ứng sau:
Glucose oxidase
Glucose Acid gluconic + H2O2
Perroxidase
2H2O2 + Phenol + PAP Quinoneimine (tím) + 4H2O

Glucose oxidase (GOD) oxy hóa glucose thành acid gluconic và peroxyd hydrogen
(H2O2). Peroxyd hydrogen tạo thành bị enzyme peroxidase (POD) phân hủy và giải phóng

25
oxy. Oxy giải phóng sẽ oxy hóa 4-aminophenazon và phenol tạo phức chất quinoneimine
có màu tím. Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng glucose.
Đo độ hấp thu hợp chất quinoneimine (tím) ở bước sóng λ = 500 nm
b. Tiến hành:
Ống trắng Ống chuẩn Ống thử

Thuốc thử enzym

1000 μl 1000 μl 1000 μl

Huyết thanh 10μl

Dung dịch chuẩn 10μl
Lắc đều, ủ 10 phút ở 20 – 250C hoặc 10 phút ở 370C. Đo ở bước sóng
500nm. Phức màu bền trong vòng 60 phút
- Tính kết quả:
Abs (mẫu thử)
Kết quả = x nồng độ chuẩn (d/dL)
Abs (Chuẩn)

❖ Giá trị sinh học:

Huyết thanh/huyết tương mg/dL mmol/L
Sơ sinh, 1 ngày 40-60 2,2-3,3
Sơ sinh > 1 ngày 50-80 2,8-4,4
Trẻ em 60-100 3,3-5,6
Người lớn 74-106 4,1-5,9
60-90 tuổi 82-115 4,6-6,4
>90 tuổi 75-121 4,2-6,7
❖ Sinh lý:
- Tăng sau khi ăn, xúc động, lạnh
- Giảm khi nhịn đói lâu ngày
❖ Bệnh lý:
- Mức độ glucose cao thường gặp trong bệnh tiểu đường, nhưng nhiều bệnh và
nguyên nhân khác cũng có glucose máu cao. Dựa trên các khuyến cáo của Hiệp hội
Tiểu đường Hoa Kỳ:
Glucose máu lúc đói (FBG):
Nồng độ glucose Giải thích kết quả
70 – 99 mg/dL (3,9 – 5,5 mmol/L) Bình thường
100 – 125 mg/dL (5,6 – 6,9 mmol/L) Tiền tiểu đường
> 126 mg/dL (7,0 mmol/L) lặp lại > 2 lần thử nghiệm Bệnh tiểu đường

26
 - Một số bệnh khác cũng làm glucose máu cao như: suy thận mạn, cường giáp
(bệnh Basedow), ung thư tuyến tụy, viêm tụy, căng thẳng cấp tính (chấn thương,
đau tim, đột quỵ).
- Glucose máu thấp có thể là dấu hiệu của hạ đường huyết, khi sụt giảm glucose
máu < 40 mg/dL ảnh hưởng đến thần kinh, não.
- Hạ glucose máu có thể được nhìn thấy trong: suy thượng thận, uống rượu quá
mức, bệnh gan nặng, suy tuyến yên, suy tuyến giáp, chích insulin quá liều.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội (2010), Thực tập Hóa sinh, Nhà xuất bản
Y học.
2. Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y dược Cần thơ (2022), Giáo trình thực tập Hóa
sinh.
3. Lê Thị Mai Dung (2020), Các phương pháp và kỹ thuật Hóa sinh sử dụng trong xét
nghiệm Y khoa, Nhà xuất bản Y học.

27