TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BỘ MÔN VI SINH – HÓA SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

VI SINH VẬT THỰC PHẨM

Họ và tên sinh viên: Tống Thị Thư

MSSV: 20190577
Mã lớp: 701439

Hà Nội, 2022
2
 1. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI
SINH VẬT
1. Mở đầu
Khả năng tồn tại và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc rất lớn vào các chất dinh dưỡng và các
yếu tố sinh trưởng ở trong môi trường nuôi cấy. Trong phòng thí nghiệm, các nhà khoa học sử
dụng nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau được để nuôi cấy và nghiên cứu vi sinh vật.
Trong bài thí nghiệm này, sinh viên được giới thiệu và thực hành các kỹ năng sau đây: - Chuẩn
bị các loại môi trường và khử trùng môi trường để gieo cấy vi sinh vật.
- Làm quen với các kỹ thuật thường quy trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật bao gồm việc
chuẩn bị môi trường và các phương pháp gieo cấy vi sinh vật từ nhiều loại canh trường khác
nhau, cấy chuyền vi sinh vật từ canh trường vi khuẩn và nấm men sang môi trường mới.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu:

- Canh trường chứa vi sinh vật
- Bình tam giác
- Ống nghiệm
- Đĩa Petri
- Que cấy
- Que trang
- Đèn cồn
- Hoá chất pha môi trường Czapek (xem phụ lục thành phần môi trường) - Cân điện tử

2.2. Phương pháp tiến hành

3
Hình 1.1. Sơ đồ thí nghiệm

4
a. Pha chế môi trường dinh dưỡng
- Cân đong chính xác theo đơn (tính thành phần cho 300 ml môi trường Czapek)
- Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng
nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn, hoà tan.
- Kiểm tra và hiệu chỉnh pH môi trường (trong trường hợp cần thiết). Dùng lượng nước còn lại
tráng rửa cổ bình, phễu, v.v. Thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể tích bình. Chú ý:
- Một số thành phần môi trường có thành phần nhỏ nên pha tạo dung dịch có nồng lớn sau đó
tính lượng thể tích cần sử dụng trong môi trường
- Một số thành phần dễ phân huỷ bởi nhiệt như vitamine, kháng sinh... không nên bổ sung từ đầu
trước quá trình thanh trùng. Các thành phần này được pha thành dịch, lọc vô trùng và phối trộn
vào môi trường sau thanh trùng

b. Lọc môi trường

- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lòng trắng trứng
- Dùng phễu lọc nóng
c. Bổ sung chất đông dính
- Bổ sung chất đông dính 2% khối lượng theo thể tích môi trường -
Gia nhiệt cho tan chất đông dính, chú ý tránh để trào môi trường

d. Phân phối môi trường

- Môi trường thạch nghiêng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm (~ 5 -6 ml)
- Môi trường thạch đứng 1/3 thể tích ống nghiệm (~ 10 ml)
- Môi trường lỏng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm
- Chú ý: Môi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng môi trường, thể tích
dịch từ 15 -20 ml).

Hình 1.2. Phân phối môi trường vào dụng cụ đựng

d. Khử trùng môi trường bằng hơi nước bão hòa áp suất.
- Xem phần hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng

5
e. Bảo quản và kiểm tra môi trường
- Bảo quản môi trường: Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-5 oC tránh quá khô, nóng, nhiều ánh
sáng. - Kiểm tra bằng cách để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32 oC trong vài ngày. Nếu
thấy môi trường bị vẩn đục hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.

f. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

- Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối bằng cách thao tác xung quanh ngọn lửa đèn cồn
hoặc trong các tủ cấy vô trùng.
Ngọn lửa đèn cồn tạo dòng không khí nóng vô trùng đối lưu trong phạm vi khoảng 20 cm quanh
ngọn lửa đèn cồn như trong hình sau:

Hình 1.3. Phạm vi làm việc bên ngọn lửa đèn cồn

Một số phương pháp gieo cấy

Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vô trùng.
Dụng cụ: Que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang
Khi gieo cấy vi sinh vật từ canh trường giống sang mội trường dinh dưỡng vô trùng, tùy vào mục
đích thí nghiệm, loại canh trường giống (lỏng hoặc đặc), loại và dụng cụ chứa môi trường dinh
dưỡng (thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường trong hộp Petri, môi trường lỏng trong ống
nghiệm, môi trường lỏng trong bình tam giác) mà các dụng cụ cấy và kỹ thuật cấy khác nhau
được sử dụng. Các bước cấy được thực hiện như sau :
+ Vệ sinh khu vực cấy, bật ngọn lửa đèn cồn (hoặc đèn khí nếu thao tác trong tủ cấy)
+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua ngọn
lửa đèn cồn.
+ Chờ que cấy nguội, đưa que cấy đã vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm
nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy. Lấy
canh trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng và thực hiện thao
tác cấy như mô tả chi tiết ở dưới đây.

6
+ Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và đặt tất cả lên giá.
Chú ý : sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng lại, hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn.
Gieo cấy vào môi trường lỏng :
- Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng lấy một lượng nhỏ canh
trường, chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm
hoặc bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy đi vào môi trường.

- Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường
lỏng rồi bơm vào môi trường lỏng vô trùng.
Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng :
- Thạch nghiêng thường được sử dụng để lưu giữ vi sinh vật trong thời gian dài do thạch
nghiêng có lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, hơi nước thất thoát trong quá trình bảo quản
lâu dài ít hơn so với canh trường trong hộp Petri.
- Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vòng hoặc que cấy thẳng có thể được
sử dụng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuống đáy thạch nghiêng,
dịch chuyển que cấy dần trên mặt thạch đến khi cách phần thạch ở gần miệng ống nghiệm
khoảng 0.5 – 1 cm.
Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để canh trường sau đó phủ kín mặt thạch, hoặc có
thể theo đường thẳng, hoặc những đường song song. Phương pháp cấy này được gọi là cấy theo
vết cấy cạn dần. Dùng que cấy đâm sâu vào thạch đứng :
- Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hoặc vi sinh vật vi hiếu khí (đối
với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, các dụng cụ nuôi cấy và các kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt cần được
sử dụng), vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển ở đáy sâu của lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí
phát triển trên bề mặt thạch, nơi có oxy khuếch tán nhiều hơn.
- Thạch đứng cũng được sử dụng để xác định khả năng di chuyển của vi sinh vật cần
nghiên cứu. Vi sinh vật không có khả năng di động có xu hướng phát triển ngay ở đường cấy
thẳng đứng. Vi sinh vật có khả năng di chuyển (nhờ có tiên mao) có xu hướng phát triển từ
đường cấy thẳng đứng ra phía thành ống nghiệm.

7
Hình 1.4: Cấy đâm sâu vào môi trường thạch đứng theo dõi đặc tính di chuyển của vi sinh vật

- Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường rồi đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch
đứng vô trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch, rồi đâm sâu xuống đáy ống nghiệm bằng động
tác dứt khoát rồi rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm. d. Cấy trên thạch hộp
- Hộp Petri chứa một lớp mỏng môi trường dinh dưỡng (3 – 5 mm). Nhờ có bề mặt nuôi
cấy lớn, hộp Petri được sử dụng để phân lập vi sinh vật (kỹ thuật yêu cầu tách các vi sinh vật
khỏi nhau và phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt). Tuy nhiên do lớp môi trường mỏng và
bề mặt bay hơi lớn, hộp Petri không được sử dụng để giữ vi sinh vật trong một thời gian dài như
canh trường trong thạch nghiêng.
Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, có thể sử dụng các cách sau :
+ Sử dụng que cấy vòng (que cấy thẳng sẽ cào xước mặt thạch nên không được sử dụng), cấy
theo bốn đường zigzag ở bốn góc hộp, hoặc theo các đường song song, sao cho mật độ tế bào vi
sinh vật được cấy giảm dần từ góc cấy đầu tiên đến góc cấy cuối cùng. Nếu cần thiết, có thể cần
đốt nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau mỗi góc cấy, que cấy vô trùng sau đó dùng để kéo vi
sinh vật từ góc cấy trước đó sang góc cấy tiếp theo (Streak technique).

Hình 1.5: Cách cấy trên hộp petri bằng phương pháp vết cấy cạn dần

Một số cách cấy khác trên môi trường hộp petri như (các cách này sẽ được thực hành ở các bài
sau) + Cấy chẩm điểm : sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống rồi cấy chấm điểm lên 3, 4

8
hoặc 5 điểm trên môi trường trong hộp Petri thành 3 cạnh của tam giác đều, 4 đỉnh của hình
vuông, hoặc 4 đỉnh của hình vuông và một điểm tâm hình vuông.
+ Dùng que trang : khi cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp Petri, dùng
pipette hút một lượng canh trường (50 – 100 µl) lên mặt thạch, rồi dùng que trang vô trùng dàn
đều đến khi mặt thạch se lại.
Canh trường mới được cấy cần được nuôi trong điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng
độ oxy) một thời gian để vi sinh vật phát triển. Kiểm tra canh trường trước khi cất bảo quản ở
nhiệt độ thấp (4- 10oC).

3. Báo cáo thí nghiệm

1. Mục đích của bài thí nghiệm:
2. Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
a. Dụng cụ thí nghiệm
b. Phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

Hình 1.6: Nhận xét đặc điểm hình thái khuẩn lạc.

9
10