TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

GV: TS. ĐỖ VIỆT HÀ

dovietha@hcmuaf.edu.vn
 CHƢƠNG 2:

Phân lập, tuyển chọn, nuô i cấy,

bảo quản giống vi sinh vật
 Cô ng tác chuẩn bị giống cho sản xuất

- Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men

- Kiểm tra khả năng hồi biến (thoái hóa, lại giống) của giống

- Hoạt hóa giống (môi trường giàu chất kích thích sinh trưởng)

- Chọn lọc chủng có hoạt tính cao

- Bảo quản giống

 Phân lập vi sinh vật

- Phân lập vsv: quá trình tách riêng các loài vsv từ quần thể
ban đầu đưa về dạng thuần khiết. VSV ở dạng thuần khiết là
giống vsv được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu.

- Nguyên tắc: tách rời các tế bào vsv, nuôi cấy các tế bào trên
trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng
rẽ tách rời nhau
- Giống vsv thuần khiết thường được phân lập từ canh trường
vsv tập trung được tạo ra bởi các điều kiện nuôi cấy chọn lọc
• Phân lập vi khuẩn: môi trường thạch NB (Nutrient Broth)
• Phân lập nấm men: môi trường thạch Hansen
• Phân lập nấm mốc: môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

VK Gram (-) hình cầu Nấm men Aspergillus Niger

- Quy trình phân lập giống vsv

1. Thu mẫu  2. Pha loãng  3. Cấy (phân lập)

 4. Nuô i  5. Kiểm tra

1. Thu mẫu: nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng
lỏng bằng cách nghiền mẫu và hòa tan mẫu trong nước cất
vô trùng. Sau đó thực hiện như mẫu là dạng lỏng, tiếp tục
pha loãng ở nồng độ cần thiết.
2. Pha loãng: Hòa loãng bằng nước cất, nước muối sinh lý
hoặc nước muối peptone (SPW, saline peptone water) chứa
0.85% NaCl và 0.1% peptone hòa tan trong nước cất. Cân
1g hoặc 1 ml mẫu hòa vào 9 ml nước vô trùng, pha loãng
nhiều lần đến nồng độ mong muốn khi tất cả các khuẩn lạc
xuất hiện trên môi trường đều riêng rẽ đồng nhất.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1g
hay
1 ml
3. Cấy phân lập: cấy mẫu trên môi trường đặc trưng

- Cấy trải lên môi trường thạch, nuôi trong tủ ấm 1-3 ngày,
tách các khuẩn lạc điển hình và làm thuần khiết một số lần
trên môi trường thạch nghiêng để tách riêng từng khuẩn lạc

- Đối với vsv hiếm khí, nếu cấy trên môi trường thạch nghiêng
hay trong đĩa petri phải cho thêm chất khử (NaS.9H2O) từ
0,05-2% hay hàn kín bằng paraffin hoặc môi trường không
có oxy

- Một số loại vi khuẩn không thích hợp khi phân lập trên môi
trường rắn, phải dùng phương pháp hòa loãng trong môi
trường dịch thể để tách riêng từng tế bào hoặc có thể dùng
phương pháp tách tế bào trên kính hiển vi
Mô i trƣờng cấy
4. Nuô i
- Môi trường đặc: từ tế bào riêng rẽ sẽ phát triển thành khuẩn
lạc (colony) có kích thước, mép, cấu tạo bề mặt khuẩn lạc là
những tính chất để định loại. Khi điều chế môi trường đặc
người ta thường bổ sung thạch (agar).

- Các loại môi trường: môi trường tự nhiên, môi trường tổng
hợp, môi trường bán tổng hợp, môi trường tuyển chọn, môi
trường làm giàu vsv, môi trường dùng để phân lập và định tên

-Tùy theo tính chất vsv mà lựa chọn điều kiện nuôi thích hợp:
vsv kỵ khíhay không kỵ khí, môi trường đặc hay lỏng, nhiệt độ
nuôi, thời gian nuôi (24-48 h đối với vi khuẩn; 72-120 h đối với
nấm men, vi nấm và xạ khuẩn),…
5. Kiểm tra
- Mức độ thuần khiết của chủng có thể được kiểm tra: mỗi
khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống
nhau trong quan sát dưới kính hiển vi hoặc tạo hộp ria từ
một khuẩn lạc đơn của chủng thuần chỉ tạo ra một loại khuẩn
lạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống với
khuẩn lạc của chủng ban đầu

- Kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa và khả năng sản xuất
 Các phƣơng pháp phân lập

 Kỹ thuật hộp ria

- Khử trùng bề mặt bàn và tay bằng cồn 70, chờ khô đốt đèn cồn.
Đĩa môi trường mới đổ hoặc bảo quản lạnh 4-8C, trước khi dùng
đặt vào tủ ấm 37C khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo.
- Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và thao tác lấy mẫu trong ống
nghiệm. Dùng ngón giữa và ngón cái (bàn tay trái) ấn vào tâm đĩa
petri, các ngón còn lại xoay và hơ mép nắp đĩa trên đèn cồn trước
khi cấy. Cầm đĩa lọt vào lòng bàn tay trái, ngón cái và ngón út tỳ vào
nắp để đẩy nắp lên sao cho nắp và đáy tạo một góc khoảng 45.

- Đưa đầu que cấy vào phết một góc nhỏ, sát thành đĩa. Thực hiện
cấy ria. Sau khi cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ
và thời gian thích hợp.
 Kỹ thuật hộp trải

- Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi
trường thích hợp.

- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp
mặt thạch.

- Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt
thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi đĩa thứ 3.

- Đặt các đĩa pêtri 1, 2, 3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp

sau một thời gian nhất định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận
được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3.
Vi khuẩn Bacillus
 Kỹ thuật hộp đổ

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển

1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong
đĩa pêtri.

- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội

đến 45 - 55C vào đĩa petri đã cấy mẫu.

- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ
vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường
cấy.

- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.

 Tuyển chọn vi sinh vật

- Sàng loc các chủng có hoạt tính sinh học: bổ sung cơ chất
tương ứng, sử dụng kháng sinh ức chế các chủng ko phù hợp
- Lựa chọn chủng có hoạt tính cao từ biến dị tự nhiên: chọn
chủng có hoạt tính cao nhất, ko có ý nghĩa tạo chủng có năng
suất cao nhất
- Lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng pp gây đột biến: gây
đột biến dưới tác động mạnh của các tác nhân (UV, tia X,
gamma, chất gây đột biến,..) tạo giống có năng suất cao
- Lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng kỹ thuật di truyền:
tạo chủng tái tổ hợp (recombinant cells) có khả năng sinh
tổng hợp và có năng suất cao
 Kỹ thuật nuô i cấy vsv

- Nhân giống cấp 1: đây là giai đoạn hoạt hóa giống, cấy
chuyển giống vi sinh vật thuần khiết từ ống giống sang môi
trường dinh dưỡng vô trùng, nhân giống trong điều kiện
phòng thínghiệm.

- Nhân giống cấp 2, 3: đây là giai đoạn nhân giống sản xuất
ở xưởng nhằm cung cấp lượng giống lớn cần thiết cho khâu
sản xuất. Lượng giống cho vào môi trường để nhân giống
chiếm 1-10% tổng khối lượng của môi trường nhân giống.
Từ giống cấp 1, 2, 3 nhân trong nồi lên men hay cơ chất đặc
(chất mang). Khi kết thúc mỗi khâu nhân giống cần kiểm tra
ngay độ thuần của giống và mật độ tế bào vi sinh vật cần
nhân

Ống giống Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3

Nồi lên men
 Bảo quản vi sinh vật

- Những lưu ý khi bảo quản vsv

• Duy trìkhả năng sống của vsv

• Số lượng tế bào khi tiến hành bảo quản
• Duy trìđặc tính di truyền của chủng vsv
• Tính thuần chủng của vsv bảo quản
• Kiểm tra chất lượng chủng vsv (tỉ lệ sống sót, mức tạp
nhiễm, đặc tính di truyền, khả năng lên men,…)
 Các phƣơng pháp bảo quản giống

- Phương pháp bảo quản (giữ giống) vsv

• Cấy truyền
• Lạnh sâu hoặc đông khô
• Bảo quản trong nitơ lỏng
• Giữ giống dưới lớp dầu khoáng
• Giữ giống trong đất, cát, silicagel
• Giữ giống trên giấy lọc, hạt ngũ cốc và gelatin
1. Cấy truyền

- Nguyên tắc: vsv vẫn còn tiếp tục phát triển và chết đi khi
các chất dinh dưỡng cạn kiệt  giảm tỷ lệ sống sót hoặc tạo
ra thế hệ vsv không còn giữ được đặc tính ban đầu
- Phương pháp: thuần khiết lại chủng vsv trên môi trường
agar, chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy lên môi trường
thạch nghiêng, sau đó nuôi trong tủ ấm 28-32C để vsv phát
triển bình thường, lấy ra cho vào tủ lạnh giữ ở 4C, hàng
tháng cấy truyền lại vào môi trường mới
- Ưu nhược điểm: phổ biến, đơn giản và tiện lợi. Tuy nhiên,
thời gian ngắn (1 tháng), tốn nhiều công sức để cấy truyền,
giống dễ mất các đặc tính di truyền, môi trường dễ mất ẩm
(cho thêm dầu thực vật 1%)
2. Lạnh đông (sâu)

- Nguyên tắc: dựa trên cơ sở vsv bị ức chế ở nhiệt độ thấp

- Phương pháp: trộn thêm chất bảo vệ (glycerol, DMSO) để
bảo vệ vsv không bị chết ở t lạnh đông do các tinh thể đá
gây ra
 Bảo quản ở -15C đến 20C  6 tháng
 Bảo quản ở -30C  9 tháng
 Bảo quản ở -40C  12 tháng
 Bảo quản ở -50C đến -60C  3 năm
 Bảo quản ở -70C  10 năm
- Ưu điểm: đơn giản, thời gian giữ lâu, đang được sử dụng
phổ biến hiện nay.
3. Đông khô

- Nguyên tắc: làm giảm ẩm độ môi trường nuôi cấy

- Phương pháp:

 Nuôi vsv trên môi trường thích hợp cho đến giai đoạn
logarit, thu tế bào và trộn với chất bảo vệ
 Chất bảo vệ: glutamate 3%; lactose 8% + pepton 1.2%;
vitamin C 0.5% + NH4Cl 0,05%; saccharose 8% + sữa
5% + gelatin 1.5%
 Dùng pipet cho 0.2-2 ml huyền phù vsv vào các ống
nghiệm, làm lạnh trong chậu tuyết CO2 + cồn etylic ở
-70C đến -80C trong 1-5 phút
  Sau đó làm khô bằng phương pháp thăng hoa, thời
gian 8-14h, độ ẩm còn lại 1-4%
 Hàn kín ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ phòng
hoặc tủ lạnh, giữ thời gian trên 20 năm
 Tùy theo loại vsv ta có các chất bảo vệ thích hợp

- Ưu nhược điểm: tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền

không bị biến đổi, thời gian giữ giống lâu, ít tốn công cấy
truyền. Tuy nhiên cần có máy sấy thăng hoa, máy hàn ống
nghiệm, chất bảo vệ thích hợp đối với từng loại vsv
4. Bảo quản trong nitơ lỏng

- Nguyên tắc: vsv bị ức chế ở nhiệt độ thấp (-150 ~ -196C)

- Phương pháp: nuôi cấy tế bào thu nhận ở pha ổn định, pha
với chất bảo vệ (glycerol, DMSO) và đông lạnh (freezing)
trước khi bảo quản trong nitơ lỏng (liquid nitrogen)

- Ưu nhược điểm: bảo quản được tất cả các loài vsv, tế bào
động thực vật. Tỷ lệ sống sót cao, thời gian giữ được lâu, bảo
quản tế bào không sống sót được bằng phương pháp đông
khô. Tuy nhiên cần phải có bồn chứa nitơ lỏng, nitơ lỏng dễ
bay hơi và tổn thất nên cần phải bổ sung thường xuyên. Nếu
bồn chứa hư hỏng sẽ dẫn đến hư mẫu bảo quản.
5. Giữ giống dưới lớp dầu khoáng

- Nguyên tắc: làm cho vsv không tiếp xúc được với không khí
(O2) nên không thể phát triển

- Phương pháp: chọn môi trường agar thích hợp cho từng
loại vsv, cho vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng 121C/20-30
min, lấy ra để nghiêng góc 45, chờ thạch đông, cấy vsv và
nuôi trong tủ ấm để vsv phát triển (2-7 ngày), đổ lớp dầu
khoáng đã được thanh trùng 121C/30 min dày 2cm vào
từng ống nghiệm, hàn kín miệng bằng nút bông và parafin,
bảo quản ở nhiệt độ thường hoặc lạnh (4C)
- Ưu điểm: đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp, thời
gian bảo quản 12 tháng, đỡ tốn công cấy truyền, giống ít bị
thoái hóa và tạp nhiễm
6. Giữ giống trong đất, cát, silicagel

- Nguyên tắc: giảm ẩm  giảm quá trình trao đổi chất vsv

- Chuẩn bị vật liệu:

+ Cát: rửa sạch nhiều lần, sấy khô, sàng bỏ hạt lớn, ngâm
trong HCl đậm đặc và sau đó đun sôi 1-2h, rửa lại nhiều lần
cho trung tính (NaOH, Na2CO3), sấy khô 100C/3-4h, cho
vào ống nghiệm thanh trùng trong tủ sấy 160-180C/2-3h
hoặc thanh trùng autoclave 130C/90phút
+ Đất: nghiền mịn, rây lấy hạt nhỏ 1mm, thêm 1-2% CaCO3
để trung hòa đất chua, hoặc thêm 2% cát (than hoạt tính) để
tạo độ tơi xốp, cho vào ống nghiệm 1-2g, đậy nút bông và
thanh trùng autoclave 121C/1h, và lập lại lần 2 sau 24h
+ Silicagel: nghiền mịn cỡ 1mm, xử lý vô trùng như cát
- Chuẩn bị bào tử và trộn bào tử
+ Vsv được nuôi trên môi trường agar thích hợp để tạo nhiều
bào tử, thời gian đối với vi khuẩn 7 ngày, nấm mốc 7-8 ngày,
xạ khuẩn 14 ngày
+ Bằng thao tác vô trùng cho 1-2g cát, đất, silicagel vào ống
nghiệm vsv đã hình thành bào tử, trộn đều bằng que cấy,
tránh làm cát bị ướt và vón cục
+ Cho cát và bào đã trộn vào ống nghiệm khác, đậy nút bông,
sấy ở 40C hoặc sấy chân không, cho thêm chất hút ẩm
CaCl2 trong 2-3 ngày cho cát thật khô
+ Dùng parafin đã thanh trùng đổ kín lớp bông để tránh hút
ẩm, bảo quản phòng mát hoặc nhiệt độ 4C, giữ được một
đến nhiều năm.
7. Giữ giống trên giấy lọc, hạt ngũ cốc và gelatin
- Nguyên tắc: giảm ẩm  giảm quá trình trao đổi chất
+ Ngũ cốc: chọn hạt tốt như bắp, lúa,.. rửa sạch cho vào
nước sôi với tỷ lệ 100g hạt/30ml ngâm trong 30 phút, gạn
bỏ nước, rải lên khay sạch để ráo. Sau đó cho vào bình
tam giác (15-16 g/bình 250ml) đậy nút bông, thanh trùng
121C/40min, thanh trùng 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h.
Bào tử hoặc thể sinh dưỡng của vsv đem hòa vào trong
nước vô trùng, dùng pipet hút cho vào mỗi bình 3ml, lắc
đều, nuôi ở t0 thích hợp trong 8-10ngày, lắc đều thường
để tránh các hạt dính lại
Làm khô trong tủ hút chân không đến độ ẩm 8%, kiểm tra
độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi gắn
parafin trên nút bông, bảo quản phòng mát
+ Giấy lọc: bảo quản vsv có bào tử, giấy lọc được cắt nhỏ
1-3 cm, cho vào ống nghiệm đậy nút bông thanh trùng
121C/1h, cho vào tủ sấy 100C/3h. Nuôi vsv cho có bào
tử 3-5 ngày, dùng pipet hút cho vào mỗi miếng giấy lọc 1
giọt, đậy nút bông và cho vào tủ ấm 2-3 ngày đến khi giấy
khô, phủ parafin, bảo quản phòng mát hoặc tủ lạnh, giữ
nhiều năm.
+ Gelatin: trộn tế bào đã chuẩn bị vào môi trường nước
thịt-gelatin (10g gelatin + 5% inosite và 0,25% vitamin C).
Cho từng giọt vào dĩa petri (8 giọt/dĩa), sấy khô trong tủ hút
chân không, sử dụng P2O5 để hút ẩm. Cho vào ống
nghiệm, giữ ở nhiệt độ lạnh (4C) hoặc lạnh đông (-200C).
Khi sử dụng lấy ra cho vào môi trường lỏng thích hợp nuôi
trong 24h ở 37C sau đó mới cấy vào môi trường agar,
chọn khuẩn lạc điển hình