PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật hiếu khí có khả

năng sinh tổng hợp amylase

1. Mở đầu
- Trong tự nhiên, vi sinh vật thường tồn tại trong hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên
cứu hoặc sử dụng vào thực tế cần phải phân tách để thu được canh trường chỉ chứa loài đó. Quá
trình tách một vi sinh vật ra khỏi hỗn hợp gọi là phân lập.
- Mục đích của bài thí nghiệm là phân lập chủng vi sinh vật hiếu khí có khả năng phân hủy tinh
bột. Các chủng phân lập được sẽ được sử dụng trong bài tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh
enzym amylase cao
- Phương pháp phân lập sử dụng môi trường chọn lọc chứa tinh bột

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

- Mẫu phân lập: Tương bần, bánh men
- Môi trường phân lập: môi trường Czapek trên hộp petri thay đường saccharose bằng tinh bột
tan
- Dụng cụ:
+ Pipette 1000, 100, và hộp đầu côn (02/nhóm)

+ Bình tam giác: 02/nhóm

+ Effendorf: 20/nhóm

+ Hộp pettri nhựa: 3/nhóm

+ Falcon 50: 01/nhóm

+ Que trang
+ Votex
+ Tủ nuôi tĩnh

2.2. Phương pháp

- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường
+ 02 Bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý
+ 01 Ống falcon 50 mL chứa 40 mL nước muối sinh lý
+ 120 mL Môi trường Czapek đặc thay đường saccharose bằng tinh bột tan
+ Tất cả bình tam giác, ống falcon, môi trường, hộp đầu côn, ống effendorf, que trang cần
thanh trùng tại 110oC, 30 phút
+ Sau thanh trùng, sinh viên chuẩn bị 06 hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột
- Phân lập
+ Đối với mẫu bánh men cần nghiền nhỏ trước khi thực hiện
 + Lấy 1 lượng bánh men hoặc tương bần cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 99 mL nước
đã vô trùng, lắc đều
+ Pha loãng trong ống effendorf (nồng độ pha loãng thảo luận trên lớp). Pha loãng theo hệ
số 10
+ Sử dụng pipette hút 100 L ra hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột, sử dụng que
trang trang đều
+ Nuôi cấy trên trong tủ nuôi tĩnh tại 30oC, 2 ngày, quan sát khuẩn lạc, nhận xét

Hình 0.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật hiếu khí

- Chú ý :
+ Sau các thao tác phân lập ở trên sẽ thu được canh trường tập trung chứa các chủng vi sinh vật có
khả năng phân giải tinh bột ; để thu được canh trường thuần khiết cần tiến hành thêm bước cấy
tách riêng từng khuẩn lạc vi sinh vật quan tâm trên môi trường riêng và tiến hành kiểm tra độ thuần
khiết.
+ Trong quá trình phân lập để hướng tới thu riêng từng loại vi sinh vật như vi khuẩn, hoặc nấm có
thể bổ sung kháng sinh để ức chế các loài không quan tâm : bổ sung cycloheximide ức chế nấm ;
bổ sung tetracycline ức chế vi khuẩn.

3. Báo cáo thí nghiệm

1. Mục đích của bài thí nghiệm
2. Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc.
- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không).
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm.

2
 PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật yếm khí
1. Mở đầu:
- Một trong những yếu tố quan trọng mà vi khuẩn và nhiều loại vi sinh vật khá nhạy cảm đó là sự
có mặt của oxy.
+ Những vi sinh vật chỉ phát triển khi có O2 được gọi là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
+ Vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện sẽ phát triển ngay cả khi có O2 nhưng chúng thường phát triển
tốt hơn khi không có khí này
+ Vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt sẽ chỉ phát triển khí không có O2.
- Trong bài thí nghiệm này, sinh viên sẽ làm quen với việc phân lập vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện;
sử dụng phương pháp đổ thạch hai lớp.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

- Nguồn phân lập: Sữa chua uống Yakult (Lactobacillus caseii)
- Môi trường phân lập: Môi trường MRS (thành phần môi trường xem phụ lục)

- Dụng cụ sử dụng

+ Pipette 1000, 100, và hộp đầu côn (02/nhóm)

+ Effendorf: 20/nhóm
+ Hộp Petri nhựa: 6/nhóm
+ Vortex
+ Bể ổn nhiệt

2.2. Phương pháp thực hiện

Chuẩn bị dụng cụ và môi trường nuôi cấy

- Chuẩn bị môi trường MRS cho 6 hộp Petri (~120 ml), thanh trùng
- Môi trường thạch Agar 1.5% (~ 60 mL), sau thanh trùng và giữ ấm tại 45-500C trong bể ổn nhiệt
- Dụng cụ bao gồm effendorf, đầu côn, que trang, nước được thanh trùng trước khi tiến hành thí
nghiệm
- 40 ml nước muối sinh lý trong ống falcon 50 ml, thanh trùng

Phân lập
- Hút vào các ống effendorf, mỗi ống 0,9 mL nước muối sinh lý đã vô trùng
- Hút 0,1 mL sữa chua vào ống effendorf đã chứa 0,9 mL nước muối sinh lý vô trùng; tiến hành
pha loãng tới nồng độ 10-1, 10-2,10-3

3
 Hình 0.1: Sơ đồ phân lập vi sinh yếm khí

- Sử dụng pipette để cấy 100 l dịch đã pha loãng lên bề mặt hộp petri, sử dụng que trang trang
đều

- Đổ lên trên lớp thạch dinh dưỡng thứ nhất, lớp thứ hai thach agar, đợi thạch đông.

- Nuôi cấy 37oC trong vòng 2-4 ngày.

3. Báo cáo thí nghiệm

1. Mục đích của bài thí nghiệm
2. Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc.
- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không).
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm.

4
 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI TRÊN
ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)

1. Mở đầu
- Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là phương pháp định lượng gián tiếp vi sinh vật dựa trên sự
phát triển của các tế bào vi sinh vật thành các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng rắn khi mẫu
nghiên cứu được trải trên bề mặt của môi trường (spread plate technique) hoặc khi mẫu nghiên
cứu được trộn với môi trường dinh dưỡng khi còn ở dạng lỏng và đổ vào dụng cụ nuôi cấy sau đó
để đông lại (pour plate technique). Phương pháp này chỉ xác định được mật độ vi sinh vật sống
trong mẫu.
- Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường lỏng hoặc
g môi trường rắn.
- Nếu số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm lớn (105 – 1012 tế bào/ml), trước khi tiến hành
trải đĩa hoặc đổ đĩa, mẫu nghiên cứu phải được pha loãng. Mẫu được pha loãng tới số khuẩn lạc
trong khoảng 30 – 300 trên mỗi đĩa petri 90 mm.
- Để xác định mật độ vi sinh vật có trong mẫu không khí, một phương pháp đơn giản thường được
sử dụng là phương pháp có nguyên tắc dựa trên ước tính của Omelianxki: trên một diện tích rộng
100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật có
trong 10 lít không khí.

3. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

- Mẫu nghiên cứu cần xác định hàm lượng vi sinh vật ở trạng thái: rắn, lỏng và khí
- Môi trường nuôi cấy: môi trường phổ dụng TSA
- NaCl
- Bình tam giác, micropipette 1 mL, 100 µL
- Ống Eppendorf 1.5 mL, đầu tip 1 mL, 100 µL vô trùng
- Que trang

2.2 Phương pháp

a. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, vô trùng môi trường và dụng cụ cần thiết:
- Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2
- Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi hấp áp
lực và sấy khô.

b. Định lượng vi sinh vật trong mẫu vật rắn và lỏng

Chuẩn bị và pha loãng mẫu:

5
 - Hút 900 uL nước muối sinh lý đã vô trùng vào mỗi ống Eppendorf 1.5 mL. Số lượng ống
Eppendorf cần chuẩn bị phụ thuộc vào sơ đồ pha loãng được thảo luận trên lớp.
- Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước muối
sinh lý vô trùng, mẫu đã được pha loãng 1:100. Lắc để trộn đều mẫu. Đối với mẫu sinh vật
kỵ khí, để hạn chế vi sinh vật kỵ khí trong mẫu tiếp xúc với oxy, bước pha loãng đầu tiên
nên được thực hiện trong ống Eppendorf. Mẫu trong bình tam giác được lắc đều cho vi
sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng.
- Pha loãng lần lượt theo hệ số 10 vào các ống Eppendorf chứa sẵn nước muối sinh lý bằng
cách hút 100 uL của dịch pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa muối sinh lý mới. Trộn
mẫu trên máy vortex ngay sau khi hút mẫu vào.

Hình 0.1. Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu phẩm rắn. Mức độ pha loãng tùy thuộc vào mẫu cụ thể
được sử dụng trong buổi thí nghiệm

Cấy mẫu:
- Kí hiệu tên mẫu, độ pha loãng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa Petri
chứa môi trường dinh dưỡng
- Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri
- Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến
khi mặt thạch se lại
- Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để nuôi trong
24 – 48h để khuẩn lạc hình thành

6
Kiểm tra mẫu:
- Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch, lựa chọn những đĩa có số lương khuẩn
lạc trong khoảng 30 – 300 để đếm chính xác số lượng khuẩn lạc, ghi lại số lượng khuẩn lạc
trên đĩa có độ pha loãng tương ứng vào sổ thí nghiệm và sử dụng những giá trị này để tính
toán.
- Tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ đồ pha
loãng.
b) Đối với mẫu không khí: sử dụng phương pháp lắng của Omelianxki
- Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi trường
dinh dưỡng vô trùng
- Đặt hộp Petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu. Chú ý lựa
chọn những khu vực có không khí tĩnh, không có gió.
- Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút).
- Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ
- Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch
- Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật trong
1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki.

3. Báo cáo thí nghiệm:

Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
1. Mục đích
2. Vật liệu và phương pháp
3. Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch,
báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính toán mật độ vi sinh vật trong mỗi
mẫu

7
 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN
(SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER)
Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên

1. Mở đầu
Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là phương pháp định lượng vi sinh vật được sử dụng
rất nhiều trong thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường. MPN xác định mật độ vi sinh vật
trong mẫu phẩm một cách gián tiếp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng trong các
tổ hợp gồm 3-5 ống nghiệm ở các độ pha loãng hơn kém nhau 10 lần. Tổng hợp kết quả ống dương
tính đối với sự phát triển của vi sinh vật là cơ sở để tính toán giá trị mật độ vi sinh vật trong mẫu.
Trong bài này, sinh viên kiểm tra sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.
Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo, động
vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v.v. Nước tự nhiên có thể bị ô nhiễm
phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nước
thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh hoạt
hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao. Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên,
việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến hành. Coliform được xem là vi sinh vật
chỉ thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường không có mặt trong môi trường nước tự nhiên, môi
trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người,
(2) Chúng có khả năng sống lâu trong môi trường nước tự nhiên hơn các loài vi sinh vật khác có
nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và (4)
việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản. Coliform là nhóm các vi khuẩn hiếu
khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose sinh ra acid
và giải phóng khí ở 35°C sau 48±2 h.
Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm
giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hoàn thành.
+ Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự có
mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48±2 h ở nhiệt độ
35°C.
+ Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm giả định
được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: môi trường
thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn
Gram dương (những loài cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).
+ Thí nghiệm hoàn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường ở thí nghiệm
xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm,
hình que, và không sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform).
Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men
lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number).

8
Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy
mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng
chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống
kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các
mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc
phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu
- Mẫu nước
- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL
- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL
- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra
trong quá trình lên men lactose

2.2. Phương pháp

Chuẩn bị môi trường
Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức
sau
Bảng 0-1 Thành phần môi trường

Thành phần Nồng độ kép Nồng độ đơn

Peptone 10g 5g
Lactose 10g 5g
Cao thịt bò 6g 3g
Nước 1000 mL 1000 mL
pH được điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp
ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
Bảng 0-2. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm

Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Số lượng ống
F1 Nồng độ kép 10 mL 3
F2 Nồng độ đơn 10 mL 3
F3 Nồng độ đơn 10 mL 3

Các ống chứa môi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút.
Lấy mẫu:

9
Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo tiêu
chuẩn Việt Nam hoặc quốc tế (WHO – World Health Organization) về lấy mẫu nước. Nước được
chứa trong các bình được khử trùng trước, có nắp kín, vận chuyển về phòng thí nghiệm và lưu giữ
trong tủ lạnh cho đến khi phân tích. Tùy vào loại nước và mức độ ô nhiễm dự đoán của nước mà
chúng được pha loãng khác nhau trước khi được cấy vào môi trường nuôi cấy.
Cấy mẫu:
Trước khi cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều để đảm bảo vi sinh vật
phân bố đồng đều.
Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp
3 ống F1.
Dùng micropipette cấy 1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3
ống F2.
Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp
3 ống F3.
Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35oC.

Hình 0.1. Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu nước vào các tổ hợp ống chứa môi trường lactose

Kiểm tra kết quả và xác định mật độ vi khuẩn coliform trong mẫu nước:
Sau 48 ± 2 giờ, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống. Các ống được coi là
dương tính nếu ít nhất 3 mm khí được quan sát trong ống Durham. Ghi lại số lượng ống dương
tính trong mỗi tổ hợp ống, ta có bộ gồm 3 số. Ví dụ: nếu số ống dương tính trong tổ hợp F1 là 3,
tổ hợp ống F2 là 2 và tổ hợp ống F3 là 2, ta có bộ ba số 3-2-2.

10
Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn sau đây, giá trị MPN trên 100 mL nước sẽ
được xác định. Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy mẫu, giá trị MPN của mẫu nước thu
thập sẽ được tính toán dựa vào hệ số pha loãng ban đầu.
Bảng 0-3. Giá trị MPN trên 100 mL nước và giới hạn độ tin cậy 95% khi bộ ba ống được cấy
với 10 mL, 1 mL, và 0.1 mL mẫu nước

Giới hạn MPN ở độ tin cậy

Số lượng ống cho kết quả dương tính
MPN/100 95%
3 ống cấy 3 ống cấy 3 ống cấy 0.1 mL
Dưới Trên
10 mL 1 mL mL
0 0 1 3 <1 9
0 1 0 3 <1 13
1 0 0 4 <1 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 49
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 149
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 379
3 1 0 48 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800

11
3. Báo cáo thí nghiệm:
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
1. Mục đích
2. Vật liệu và phương pháp
3. Kết quả và thảo luận: sinh viên báo cáo số ống dương tính ở mỗi tổ hợp, từ đó suy ra giá
trị MPN của nhóm vi khuẩn có khả năng lên men lactose sinh khí trong mẫu nước và nhận
xét về mật độ nhóm vi khuẩn này trong mẫu nước.

Tài liệu tham khảo

World Health Organization (1997). Annex 6: Multiple-tube method for thermotolerant (faecal)
coliforms, In Guidelines for drinking-water quality, 2nd Edition.
Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA & Clark DP (eds) (2011) Brock Biology of Microorganisms,
12th edition. Benjamin Cummings
Benson, T (2001) Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology. 8th
Edition, The McGraw-Hill, New York.

12