BÀI 6: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT

TRÊN KÍNH HIẾN VI

I. MỤC ĐÍCH - YÊU CẦU CỦA BÀI
1. Kiến thức lí thuyết:
Củng cố và hình thành các kiến thức sau :
- Đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nám men.
- Ý nghĩa của việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật.
- Các đặc điểm sinh học đặc trưng của mỗi nhóm vi sinh vật.
2. Kĩ năng thực hành :
Củng cố và hình thành các kĩ năng sau:
- Kĩ năng sử dụng kính hiển vi quang học.
- Kĩ năng làm tiêu bản tạm thời và tiêu bản cố định.
- Kĩ năng nhuộm màu các tiêu bản.
- Kĩ năng quan sát các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi quang
học.
- Kĩ năng đo và tính kích thước tế bào vi sinh vật trên kính hiển vi.
II. HÓA CHẤT-NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ CẨN CHUẨN BỊ
1. Hóa chất
- Thuốc nhuộm Fuchsin :
1)Rượu etylic 96° 10ml.
Fuchsin kiểm 0,3g
2)Phênol (axit phênie) 5g.
Nước cất 95ml.
Trộn dung dịch 1 và 2 lại rồi pha loãng 5 lần.
- Xanh metylen 0,001%
Xanh metylen 0,1g
Nước cất 1000ml
- Xanh metylen Loefler :
Rượu etylic 300ml
Xanh metylen 20g
Hòa tan hỗn hợp trên rồi lọc trong (1)
Dịchlọc (1) 30ml.
KOH 1% 1ml.
Nước cất 1000ml.
- Dung dịch lactophinol (đựng trong lọ màu nút nhám) :
Axit phênic kết tinh và tinh khiết 10g
Axit Iactic 10g
Glyxtrin 20g
Nước cất 10ml
Cồn 96°
- Axêton
2. Nguyên liệu
- Ống thạch nghiêng cây các loài vi sinh vật sau :
+ Bacillus subtilis, Sarcina lutea,
+ Penicillium italicum, Aspergillus niger
+ Streptomyces griseus
+ Saccharomyces cerevisiae.
- Môi trường khoai tây
- đường cám dịch thể nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Môi trường nước thịt
- pepton dịch thể cấy B. coli
- Một số ống nước cất vô trùng.
- Vazolin
3. Dụng cụ
- Hộp đựng phiến kinh, lá kinh.
- Phiến kinh làm.
- Thước đo vật kính.
- Thước đo thị kính.
- Que cấy, đèn cồn, diêm quạt
- Giấy lọc
- Bocan, cầu thủy tinh.
- Bình xịt chứa nước cất.
- Tâm tre (đã sấy vô trùng) Kinh hiển vi, dầu soi kính.
III. LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI
1. Các đặc điểm của tiêu bản tạm thời
- Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh.
- Quan sát được các trạng thái sống của tế bào như : sự chuyển động của tiền
mao, sự sinh sản, sự hình thành bào tử...
- Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi
2. Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu bản
Muốn làm bất kì một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng đều phải thực hiện các
thao tác lấy giống vì sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác này diễn
ra theo trình tự sau
- Đốt đèn cồn lên.
- Đạt ống giống có vi sinh vật vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái,
lòng bàn tay ngửa ra. Ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không được để canh
trường vi sinh vật chạm vào nút bảng.
- Tay phải dùng que cấy và vô khuẩn nó trên ngọn đèn cồn. Để qua cấy thẳng
đứng trên ngọn lửa cho đến khi đầu qua cấy nóng đỏ rồi từ từ đặt và di chuyển
que cấy theo chiều nằm ngang trên nướn lửa.
- Hẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ một 1 vòng và
kéo nói ra. Gia rất nguyên như vậy cho đến khi dây nút vào.
- Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cắn.
- Khéo léo đưa que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy giống và nhẹ shing dus
que cay ra
+ Nếu ống giống là môi trường lỏng chỉ cần nhưng đầu qua cây vào canh trường
rồi rút ra
+ Nếu ống giống là môi trường đặc thì dùng que cây lấy một chút sinh khối vì
sinh vật trên mặt thạch và hòa đầu vào giọt nước Đất vô trùng trên làm kính.
Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cây một thạch lên.
- Đất qua cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đây ống nghiệm lại và để Ging vilogi
- Đưa giọt canh trưởng (hoặc sinh khối) vì sinh vật ở đầu que cấy đặt vào giữa
phiến kinh để làm vết hồi.
- Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn rồi cất vào giá
 3. Cách làm tiêu bản gọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vì sinh vật để làm vết bởi (theo trinh tự
phần 3)
- Đặt là kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí.
Muốn vậy để một mép lá kinh tiếp xúc với phiến kinh nồi từ từ họ là kinh xuống
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi
- Chú ý :
+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kinh và là kinh
ta dùng giấy thấm bớt nước đi.
+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazolin bởi quanh mép là kinh để giọt
dịch khỏi bị khô.
4. Cách làm tiêu bản giọt treo.
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích. Dùng phiến kính
đặc biệt có phần
Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt
lên phần lõm của phiến kính.
- Chú ý : Không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm.
- Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi (hình 41).
Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi
sinh vật dễ dàng hơn và lâu hơn.
5. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu
a) Nguyên tắc :
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và
được pha loàng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn còn sống và hoạt
động sau khi nhuộm màu
b) Cách nhuộm :
Có 2 cách nhuộm màu vi khuẩn sống
- Cách 1:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mitylen 0,001% lên phiến kính
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
+ Đây là kính lên giọt dịch.
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40)
- Cách 2:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính.
+ Dùng que cấy dàn đầu thành 1 vùng nhỏ rồi để khô tự nhiên.
+ Nhỏ 1 giọt dịch vi khuẩn lên vùng màu đã khô.
+ Quan sát tiêu bản với vật kính (X10) rồi (40)
IV. LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH
1. Các đặc điểm của tiêu bản cố định
Quan sát tiêu bản cố định là 1 phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh
vật học vì nó có ưu điểm sau :
- Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu
- Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng và cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng
đếm số lượng tế bào vi sinh vật..
- Không sự lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh.
2. Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định
a) Làm vết bôi :
– Chọn 1 phiến kính sạch và khổ.
- Lấy 1 giọt canh trường để vào giữa phiến kinh. Nếu canh trường đặc thì lấy 1
giọt nước vô trùng vào giữa phiến kính rồi lấy 1 chút khuẩn lạc vi sinh vật hòa
đầu với nước và dẫn đều thành 1 vùng nhỏ có diện tích khoảng 2cm
- Để vết bởi khô tự nhiên trong không khí.
+ Lượng vi sinh vật lấy vừa phải.
+ Vết bôi tròn , gọn và thật mỏng
+ Các tế bào sinh vật đều được dàn đều , dễ quan sát
b) Cố định vết bôi
- Việc cố định vết bởi nhằm các mục đích sau :
+ Giết chết vì sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xác (nếu là loại
vị sinh vật gây bệnh) bị trôi mẫu.
+ Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm thì rửa không Các cách cố
định vết bôi
- Cố định bằng nhiệt
+ Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất.
+ Dùng kẹp gỗ hay kẹp sắt để kẹp phiến kinh.
+ Hở mặt dưới của phiến kinh qua lại trên ngọn đèn cồn, tránh không để tiêu bản
nóng quá.
- Cố định bằng hóa chất
+ Cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi
cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao
. Người ta thường dùng các hóa chất là rượu và axitôn để có định viết bôi
- Cách cố định :
Có thể thực hiện một trong những cách sau :
+ Những vết bôi vào rượu. Với rượu 95 ngâm vớ bởi từ 5-15 phút. Với rượu
metylic ngâm khoảng 2-5 phút Ngâm vết bội vào dung dịch axeton trong 5 phút
+ Nhỏ vài giọt rượu 90-95" lên vết bởi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy
vài lần rồi để khô
3. Nhuộm màu tiêu bản cố định
a) Nguyên tắc :
– Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với
thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bản vững.
- Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bất màu khác nhau của các thành
phân tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp
– Có 2 cách nhuộm chính
+ Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản
+ Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.
b) Cách nhuộm :
- Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh (đặt nằm ngang miệng một bôcan)
- Nhỏ vào vết bồi vài giọt Fuchsin Zishi, để yên từ 1-2 phút.
- Rửa vết bài bằng cách nghiêng phiến kinh, dùng bình xịt cho dành nước chảy
nhẹ qua vết bồi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa
- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cốt
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x1000)
dùng dầu soi.
V. Quan sát đặc điểm sinh học của nhóm vi sinh vật
3. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc (Molds)
Nấm mốc là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo sợi phân nhánh nhiều lần có
vách ngăn hoặc không có vách ngăn. Nấm mốc có 2 loại bào tử
- Bảo từ vô tính :
- Bào tử hữu tính:
Sự hình thành bào tử của chúng rất khác nhau và đặc trưng cho từng loài

a) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát :

- Đặc điểm của sợi nấm : màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn.

- Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ
quan sinh sản.

- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.

b) Cách quan sát :

- Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu :

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch lactophenol lên phiến kính

+ Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc nấm Penicillium hoặc Aspergillus niger cấy
trên thạch nghiêng, dàn mỏng.
(840).
+ Đây là kính, quan sát trên kính hiển vi ở vật kính (X10) rồi
- Về hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách
sắp xếp của bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đinh của 2 giống nấm
mốc trên.
- Làm tiêu bản nấm mốc nhuộm màu :

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch xanh cotton lên phiến kính.

+ Lấy một ít sợi nấm dàn đều trên phiến kính.

+ Đậy lamen (lá kính).

+ Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với vật kính (x40)
+ Vẽ hình cấu tạo sợi nấm và cơ quan sinh sản.

+ Chú ý: Để có thể quan sát sợi nấm dễ dàng, đẩy đủ khi lấy giống phải rất nhẹ
nhàng, khéo léo để nấm không bị đứt.

4. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men (Yeasts)

Nấm men có cấu tạo đơn bào, không chuyển động. Tế bào có dạng hình cầu,
hình trứng, hình bầu dục, kích thước tương đối lớn. Nấm men sinh sản vô tính
theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vô tính và sinh sản hữu tính nhờ kết hợp bào tử
(+) và (-).

Một vài loài nấm men có khả năng tạo khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả.Cách nảy chồi,
khả năng tạo bào tử; hình dạng, số lượng nang bào tử cũng là đặc điểm quan
trọng trong phân loại.

a) Những đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát :

- Hình thái, kích thước tế bào nấm men.

- Sự nảy chồi của nấm men (hình 46)

- Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử.

b) Cách quan sát :

Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với xanh
metylen Loeffler.

– Yêu cầu :

+ Quan sát trên kính hiển vi ở bội giác X40, X100

+ Vẽ hình chú thích màng tế bào chất, không bào của tế bào

- Làm tiêu bản giọt treo với nấm men nuôi cấy trên môi trường dịch thể.
– Yêu cầu

+ Quan sát tiêu bản với vật kính X40

+ Quan sát sự nảy chồi của nấm men

+ Chú ý : Các tế bào phát triển là những tế bào có 1 hay nhiều chồi mọc chồng
chất lên nhau