Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong

1 Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT
Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP

GIEO CẤY VI SINH VẬT
A. Môi trường dinh dưỡng
I. Khái niệm chung
1. Mục đích, ý nghĩa:

- Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh
vật. Môi trường dinh dưỡng được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên
cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật.
2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:

- Môi trường dinh dưỡng là một hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật.
Trong thành phần của môi trường dinh dưỡng cần phải có các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon,
Hydro, Oxi, Nitơ), các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt,..),
một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden,..). Những nguyên
tố trên cần thiết phải ở dạng những hợp chất dễ hấp thu đối với vi sinh vật. Cacbon được các vi
sinh vật dị dưỡng hấp thu dễ hơn cả ở dạng glucoza. Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡng còn hấp
thu đường, rượu, axit hữu cơ và các hợp chất khác. Nguồn Nitơ có thể là các chất đạm, pepton,
axit amin, muối amon, nitrat. Các nguyên tố còn lại dưới dạng muối. Môi trường dinh dưỡng còn
cần phải có đủ các chất kích thích sinh trưởng như biotin, vitamin, đặc biệt là các axit amin
không thay thế.
- Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối về thành phần (đẳng trương về nồng độ các chất hòa
tan) và có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu.
- Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
3. Cách gọi tên

- Môi trường dinh dưỡng thường được gọi tên theo tên tác giả - người phát hiện ra nó. Thí dụ:
Môi trường Sapek, Saburo,... Song đúng hơn là gọi tên theo nguồn thức ăn N và C. Thí dụ môi
trường thạch thịt – pepton, môi trường Xenlluloza
II. Phân loại môi trường

1. Phân loại môi trường theo thành phần: Căn cứ vào thành phần môi trường, người
ta chia chúng thành các loại sau
Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

a. Môi trường tự nhiên được chế tạo từ các sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật như
thịt, trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha,... Thành phần hóa học của những môi
trường này phức tạp và không được xác định cụ thể. Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu
và các điều kiện tiến hành chế tạo môi trường. Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật,
tích lũy sinh khối, giữ các giống thuần sạch, các mục đích dự đoán, chúng không lợi cho việc
nghiên cứu sinh lý hoặc các quá trình trao đổi chất.
b. Môi trường tống hợp được chế tạo từ các hợp chất hóa học hữu cơ và vô cơ với nồng
độ định trước một cách chính xác. Tùy theo bộ các cấu tử, môi trường tông hợp có thể phức tạp
(môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho các vi khuẩn tự
dưỡng). Người ta dùng chủng để nghiên cứu sự trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng
hợp một chất nào đó (VD: axit amin). Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp
Sapek để nuôi cấy nấm mốc.
c. Môi trường bán tổng hợp là môi trường chung giữa hai loại trên
2. Phân loại theo mục đích sử dụng

a. Môi trường phổ dụng (môi trường cơ sở hay môi trường chuẩn) là những môi trường
thích hợp để nuôi cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch
nha,...)
b. Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo sự phát triển ưu thế của
một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó, ít thuận lợi hoặc hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển
của các vi sinh vật khác. Các môi trường chọn lọc chủ yếu được dùng để phân lập vi sinh vật từ
các môi trường sinh sống tự nhiên của chúng hoặc được dùng để nuôi cấy tích lũy. VD: môi
trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn.
c. Môi trường chuẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) cho phép phân biệt khá nhanh
chóng một loài vi sinh vật này với loài khác và xác định những giống thuần khiết trên cơ sở
nghiên cứu những tính chất sinh hóa của chúng. Các môi trường chỉ thị được ứng dụng trong vi
khuẩn học lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và trong việc định tên vi sinh vật. Thông
thường trong các môi trường này người ta cho vào một số thành phần chỉ thị màu và nhờ sự thay
đổi của chất đó mà người ta có thể xác định được từng loài vi sinh vật.
VD: Trong quá trình sống, vi sinh vật thường tiết ra một loại enzyme nhất định. Dưới tác dụng
của các enzyme này các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong môi trường bị phân hủy thành các
dạng đơn giản hơn như axit và muối của chúng. Các chất này làm thay đổi độ pH của môi
trường, do đó dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu.

3. Phân loại theo tính chất lý học

Tùy theo độ chắc cứng của môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp
a. Môi trường lỏng là môi trường thức ăn dưới dạng dung dịch. Nó được ứng dụng để
phát hiện các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của vi sinh vật, để tích lũy sinh khối hoặc các sản phẩm
trao đổi chất, để giữ và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển trên các môi trường đặc.
b. Môi trường đặc là môi trường lỏng có thêm các chất đông dính, được ứng dụng để tách
các giống thuần khiết (nhận từng khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái
khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống.
Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine và silica-gel. Các chất này không làm
thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ trong suet của môi trường.
- Thạch là một loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ một số loại tảo biển họ
Floridae. Hầu hết vi sinh vật không sử dụng thạch như nguồn cơ chất dinh dưỡng. Trong nước,
thạch tạo thành dạng gel, nóng chảy ở 1000C và đông ở gần 400C. Thạch có tính trung tính,
không làm thay đổi pH của môi trường song nó bị ảnh hưởng pH môi trường, những môi trường
có độ axit pH thấp thạch khó đông đặc hơn hơn bởi nó bị thủy phân từng phần. Thạch thường
được bổ sung vào môi trường với số lượng 1,5 – 2%. Trong trường hợp cần thiết có thể nâng
nồng độ thạch lên 3%.
- Gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn của động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng
nên dễ vữa hơn so với thạch. Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH môi trường nên ít được
sử dụng hơn thạch, Nhiệt độ nóng chảy của gelatine 25-27OC và đông đặc ở 18-20OC. Thường
để thu nhận những khuẩn lạc lớn trong phân loại nấm men.
- Bản silica-gel được dùng làm chất nền đặc cho các môi trường tổng hợp có thành phần xác định
chặt chẽ bởi vì nó có bản chất vô cơ.
- Môi trường xốp được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp. Thuộc loại này có kê nấu
nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng.
III. Cách làm môi trường

Quá trình tiến hành gồm các bước sau:
1. Pha chế
Cân đong chính xác theo đơn.
Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ
hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi sau cùng là các chất đông dính. Thử pH môi trường.
Dùng lượng nước còn lại tráng rửa cổ bình, phễu,... Thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể
tích bình. Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng. Dán
nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người chuẩn bị.
2. Lọc
Môi trường cần trong suốt nên sau khi pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn bằng một trong những
phương pháp sau:
- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lòng trắng trứng
- Dùng phễu lọc nóng
3. Phân phối môi trường

Môi trường được phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm,.. sau thanh trùng vào ống
nghiệm hoặc hộp petri.
Thạch nghiêng khoảng 5ml
Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm
Hộp petri tráng đều dầy 3mm.
4. Khử trùng môi trường

Tất cả môi trường đều phải vô trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ
thanh trùng.
a. Phương pháp Pasteur
Chủ yếu dùng để diệt những vi sinh vật không sinh bào tử bằng cách đun nóng phân đoạn ở nhiệt
độ 60-750C trong 15 đến 30 phút hay ở 800C trong thời gian 10-15 phút. Phương pháp Pasteur
ứng dụng cho những sản phẩm hay môi trường dưới tác động của nhiệt độ cao bị ảnh hưởng sâu
sắc, mất đi những phẩm chất và giá trị dinh dưỡng. Nó được dùng rộng rãi trong công nghiệp
thực phẩm
b. Phương pháp Tinđan

Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần
cách nhau 24 giờ. Trong thời gian giữa hai lần hấp cần để môi trường ở nhiệt độ thích hợp cho
các bào tử còn sống sót có thể phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng. Trong lần thanh trùng

tiếp theo các tế bào dinh dưỡng này sẽ bị tiêu diệt. Phương pháp này cho hiệu suất vô trùng cao
hơn phương pháp Pasteur.
c. Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp
suất lớn hơn áp suất của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo.
- Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực.
5. Bảo quản và kiểm tra môi trường

Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-50C tránh quá khô, nóng, nhiều ánh sáng. Kiểm tra bằng cách
để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-320C trong vài ngày. Nếu thấy môi trường bị vẩn đục
hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.

B. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

1. Định nghĩa: Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn
với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết
cho nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này
sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống.
Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối
Dụng cụ: Que cấy nhọn hoặc vòng, pipet, que trang,..
2. Một số phương pháp gieo cấy
a. Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác

Tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng).
b. Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng

- Theo hình chữ chi
- Theo hình vòng xoắn
- Theo những đường song song
- Theo một đường thẳng
- Theo từng chem.
c. Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng
d. Cấy trên thạch hộp

- Hình chữ chi trên toàn mặt thạch
- Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp
- Theo các đường song song
- Chấm điểm
e. Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ

- Dung pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọt
canh trường trên mặt thạch

7 Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

A. PHÂN LẬP VI SINH VẬT
Vi sinh vật thường tồn tại trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu dưới dạng một
hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên cứu hoặc sử dụng vào thực tế bất kỳ loài nào ta
phải phân lập để thu được canh trường chỉ chứa loài đó. Quá trình tách một vi sinh vật ra khỏi
hỗn hợp gọi là phân lập. Tùy mức độ thuần khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung
hay canh trường thuần khiết.
I. Canh trường tập trung
1. Định nghĩa
Canh trường tập trung là canh trường trong đó một loài (hoặc vài loài) vi sinh vật xác định chiếm
tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng.
Từ canh trường tập trung ta có thể phân lập canh trường thuần khiết hoặc có thể sử dụng nó trong
sản xuất hoặc thí nghiệm.
2. Phương pháp phân lập canh trường tập trung

Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc điều kiện chọn lọc, tức môi trường hoặc điều kiện chỉ thích
hợp cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển.
Để có môi trường chọn lọc, ta có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH, nhiệt độ
môi trường, lưu lượng khí được cấp... Ví dụ: tách vi sinh vật ưa nóng hoặc lạnh bằng cách nuôi ở
nhiệt độ 50-600C hoặc 10-150, để tách các vi sinh vật yếm khí khỏi các vi sinh vật hiếu khí, ta
nuôi trong điều kiện yếm khí. Tuỳ đặc tính sinh lý của từng loài mà ta có những môi trường và
điều kiện chọn lọc khác nhau.
II. Canh trường thuần khiết
1. Định nghĩa
Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế
bào ban đầu. Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện từ canh trường tập trung.
2. Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết.
a. Phương pháp pha loãng môi trường lỏng

Phương pháp này do Pasteur đưa ra đầu tiên, tiến hành như sau:

- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn
- Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất
- Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai
- Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn...
Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên cho
canh trường thuần khiết.
Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó thường
được dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác.
b. Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc

Nguyên tắc của phương pháp này là tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường đặc. Cách
tiến hành như sau:
- Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng dần đến mức độ nhất định trong
các ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng. Tuỳ trường hợp mà
pha loãng nhiều hay ít hoặc không pha loãng. Nói chung nên pha loãng để các tế bào tách rời
nhau và khi gieo cấy các khuẩn lạc mọc tách biệt.
Hình 1: Sơ đồ quy trình pha loãng Pasteur

Sơ đồ phân lập trên môi trường đặc (có pha loãng trước)
Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các cách
sau:
+ Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần - cấy thưa và đưa nhanh
Hình 2: Các phương pháp cấy theo vết cấy cạn dần
+ Dùng pipet đưa một lượng canh trường nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đều
vật gieo cấy trên mặt thạch hộp
+ Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vô trùng và làm nguội đến 450C, sau đó đổ vào hộp petri.
Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng biệt.
Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập. Sau 1 - 2 ngày,
đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở
khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch. Mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống. Sau đó nuôi ở
nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết.
- Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo.
- Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ một tế bào ban đầu
mà nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng lẻ nhưng để để
quá thời gian chúng lại dính liền nhau. có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần,
đồng thời làm tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách.
c. Phương pháp tách từng tế bào

Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử
nấm mốc. Có thể thực hiện theo cách sau:
+ Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:
+ Pha loãng canh trường vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn. Pha
loãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật.

+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur)
Micromanipulateur là một dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc dưới sự kiểm tra trực tiếp qua
kính hiển vi. Nó bao gồm các kim nhỏ, micropipet, giá đỡ và các bộ phận cơ học tinh vi có thể di
chuyển các kim và pipet để lấy riêng ra từng tế bào vi sinh vật trong giọt canh trường rồi đem
nuôi cấy riêng biệt ta sẽ được canh trường thuần khiết.
Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi cẩn thận, khéo léo.
III. Phân lập vi sinh vật yếm khí

Nói chung có thể phân lập theo các phương pháp trên rồi nuôi ở điều kiện yếm khí.
1. Dùng pipet Pasteur

- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định
- Lấy một giọt của canh trường pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch (đã đun chảy trước và
làm nguội đến 45 – 500C lắc đều.
- Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín
đầu nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp
- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch
- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trường nuôi cấy
thích hợp.
Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng, ngoài ra, để nhận biết vùng có vi
sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin. Những vùng có vi
sinh vật phát triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng.
2. Dùng hộp petri lộn ngược

- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên
- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng paraphin
bôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đã vô trùng và đặt lộn ngược trước).
- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trường thích
hợp

B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Định nghĩa: Định lượng vi sinh vật là xác định số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên
cứu.
Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật
I. Định lượng trực tiếp

Định nghĩa: Định lượng trực tiếp là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có
trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng
Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm
tiêu bản.
Các phương pháp định lượng trực tiếp
1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu

+ Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như nấm men,
bào tử nấm mốc.
+ Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang
ngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và được chia thành hai khoang nhỏ nhờ
một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một số ô
vuông lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16) có cạnh dài 1/20 mm. diện tích
1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3. Mỗi buồng đếm có kèm theo một
lá kính.

Hình 3: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu
+ Cách tiến hành:
- Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường (với H2SO4 10% hoặc NaOH
10%), tùy canh trường mà mức độ pha loãng nhiều hay ít (10, 100...lần)
- dùng bông thấm nước, tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính
lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa
lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu).
Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành bọt
khí.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo
nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn
mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô.
Chú ý:
- Cần làm lặp lại 3-4 lần

- Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô
đang đếm.- Trước và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải được rửa kỹ bằng nước cất rồi
dùng bông lau sạch để khô.
- Khi số tế bào trong một ô quá 16 thì nên pha loãng canh trường thêm.
Tính toán:
Nếu dùng buồng đếm có bề sâu h = 0,1 mm và diện tích 1ô S = 1/25 mm2
thì số tế bào trong 1 ml canh trường là:
ax1000xf
hxS
trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô
f là hệ số pha loãng của canh trường
h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích một ô
1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm3.
2. Phương pháp Brit

+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng để định lượng vi sinh vật có trong sữa hay một số vật
phẩm lỏng.
- Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng khi quan sát.
- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lên
phiến kính sạch với diện tích nhất định (2 - 4 cm2).
- Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.
- Để khô và quan sát dưới kính hiển vi. Đếm số tế bào trong 5 - 10 kính trường, lấy trung bình rồi
suy ra số tế bào trên một đơn vị diện tích vết bôi và cuối cùng là số tế bào trong một đơn vị vật
phẩm nghiên cứu.

3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina

+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này thường dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật
phẩm đặc, rắn.
- Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồi
chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và để yên
trong 1 - 2 giây.
- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diện
tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2). để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tác
này phải làm nhanh, lượng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều quá và lúc chưa dàn kịp thì
phải giữ pipet ở vị trí nằm ngang.
- Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, loãng (0,1%). Lại để khô và cố định bằng cồn
tuyệt đối trong 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ. Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để
thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi.
- Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống như
phương pháp Brit.
2. Định lượng gián tiếp

Định nghĩa: Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo
cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36 -
48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.
Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn
Nhược điểm:
- Tốn thời gian, công sức
- Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc chênh
nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng một độ pha
loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm.
- Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đôi,
từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc.

Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm
nghiên cớu.
- Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.
Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp petri, nuôi ở
nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả.
Cách tiến hành:
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1/10 như phương pháp pha
loãng Pasteur.
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng lỏng bằng cách:
Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả vào bình tam giác dung tích 250 ml
đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng. Lắc đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha
loãng như trên.
+ Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuối
cùng lên hộp petri đã chứa sẵn môi trường vô trùng.
+ Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.
+ Đọc kết quả
- Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp
- Nếu số khuẩn lạc nhiều quá ta dùng kính đếm Lafa. đó là một tấm kính hình vuông có kích
thước 15 x 15 cm. Mặt kính được chia ra thành những ô có diện tích bằng nhau (1 cm2). Đếm số
khuẩn lạc trên 5 - 10 ô. Lấy trung bình cho 1 ô (ký hiệu là a tế bào). Đếm xong đo đường kính
trong của đáy hộp (ký hiệu là D). Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4.
Định lượng vi sinh vật trong không khí
Phương pháp lắng của Omelianxki
Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì
lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí.
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng.
Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ước tính.

Cách tiến hành: Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu.
Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm. Sau 24
– 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc.
Tính toán: Đo đường kính hộp petri (d cm) để tính điện tích (D2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật
tong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki.
Ngoài ra còn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2. Sau 1 giờ sẽ có một lượng
vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí.

17 Bài 3 : KÍNH HIỂN VI. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT
Bài 3 : KÍNH HIỂN VI. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT
VI SINH VẬT SỐNG. QUAN SÁT NẤM MEN
A. KÍNH HIỂN VI
Kính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát. Kính hiển
vi có nhiều loại tùy thuộc vào ánh sáng mà người ta sử dụng như: kính hiển vi quang học, kính
hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử...
I. Cấu tạo kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học

Hình 4: Cấu tạo kính hiển vi điện tử
1. Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính.
- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính. Nó gồm đế kính và
thân kính
- Khay kính: hình tròn hoặc hình vuông là nơi đặt tiêu bản. Hai bên có ốc để chuyển dịch theo
hai chiều khác nhau có hai kẹp bằng thép để giữ tiêu bản.

Hình 5: Các loại khay kính thường dùng ở kính hiển vi
- Ống kính: là một ống tròn (kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) . Nhờ ốc cố định
bên cạnh ta có thể xoay ống kính theo hướng thuận với người quan sát người quan sát. Đầu trên
của ống kính lắp thị kính, đầu dưới gắn với bàn xoay có lắp nhiều vật kính khác nhau và có thể
xoay quanh trục của giá kính. Ống kính có thể di chuyển lên, xuống nhờ các ốc điều chỉnh quay
tự do theo hai chiều ngược nhau. Ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) dùng để tìm ảnh của
vật còn ốc di chuyển chậm (ou ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh cho ảnh của vật rõ nét.
2. Bộ phận quang học

Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ
quang và gương phản chiếu.
- Vật kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại. Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh (8x,
20x, 40x, 90x, 100x...). Những vật kính có độ phóng đại vừa và nhỏ (8x, 20x, 40x...) khi dùng
không cho dầu nên gọi là vật kính khô. Những vật kính có độ phóng đại lớn (90x, 100x...) khi
dùng cần nhỏ trước một giọt dầu lên trên tiêu bản nên gọi là vật kính dầu. Dầu phải trong suốt,
trung tính và có chiết suất (độ chiết quang) tương đương với chiết suất thủy tinh ( = 1,52). Nhờ
đó giữa thủy tinh và dầu tạo thành một môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sáng đi qua
không bị khúc xạ mà rọi thẳng vào vật kính. Mỗi vật kính có một khoảng làm việc (khoảng cách
từ tiêu bản tới vật kính cho phép thấy rõ nhất ảnh của mẫu vật) nhất định, cụ thể là: đối với vật
kính 8x - 8,53 mm; 40x - 0,4 mm; 90x - 0,1mm.

(a) (b)
Hình 6: (a) Các loại vật kính, (b) Vị trí của vật kính trong kính hiển vi
- Thị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính. Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đại
khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x...)
Hình 7: Các loại thị kính khác nhau
Khi quan sát ta được một ảnh ảo, ngược với vật và có độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóng
đại của vật kính và thị kính được sử dụng.
- Kính tụ quang: lắp dưới khay kính, gồm một hệ thống thấu kính ghép lại, có tác dụng tập
trung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản. Kính tụ quang có thể di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều
chỉnh bên cạnh.
Dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hay
ít.
- Gương phản chiếu: lắp dưới kính tụ quang dùng để hướng chùm tia sáng vào tụ quang.
Gương phản chiếu có hai mặt: lõm và phẳng. Nó có thể quay tự do để hướng về nguồn sáng.
II.Cách sử dụng
1. Điều chỉnh ánh sáng

- Điều chỉnh gương: Quay gương phản chiếu về nguồn sáng và điều chỉnh để chùm tia sáng rọi
vào kính tụ quang. (Nếu ánh sáng tự nhiên thì dùng gương phẳng. Nếu ánh sáng nhân tạo thì
dùng gương lõm).
- Điều chỉnh kính tụ quang: Muốn chiếu sáng vừa hoặc ít thì hạ kính tụ quang, mở chắn sáng vừa
phải. Muốn chiếu sáng nhiều thì nâng tụ quang lên, mở rộng chắn sáng.
2. Quan sát tiêu bản

- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính.

- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa. Đặt tiêu bản lên khay kính và nhìn vào thị kính, điều
chỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát.
- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản. Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản.
Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính
- Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng,
khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét.
III. Cách bảo quản
1. Bảo quản sau khi sử dụng kính

- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ
- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu
vật kính cho thật sạch.
- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu
- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục. Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vật
kính chạm sát khăn.
- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon. Chuyển kính vào tủ lớ có hệ thống đèn bật
thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn.
2. Bảo quản thông thường và định kỳ

- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo
- Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính.
- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông.
- Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính.
- Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân
kính, một tay đỡ đế kính.
B. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG

Các loại tiêu bản quan sát vi sinh vật sống là loại tiêu bản tạm thời, có những đặc điểm sau:
- Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh.

- Quan sát được các trạng thái sống của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh sản, sự
hình thành bào tử...
- Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi.
Cách lấy giống vi sinh vật:
Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng đều phải thực hiện các thao tác lấy
giống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác này diễn ra theo trình tự sau:
- Đốt đèn cồn lên.
- Tay trái cầm ống nghiệm có canh trường vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệm
giữa ngón trỏ và ngón cái sao cho ống canh trường hơi nghiêng). Nhất thiết không để canh
trường chạm nút bông (nếu là canh trường lỏng).
- Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để dễ rút ra.
- Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, lướt thân que cấy qua đèn
cồn sao cho toàn bộ que cấy được thanh trùng hoàn toàn.
- Kẹp nút bông giữa ngón út và lòng bàn tay phải hay giữa ngón út và ngón đeo nhẫn của bàn tay
phải, rút nhẹ nút bông và giưỡ nguyên như vậy suốt quá trình lấy mẫu. tuyệt đối không để nút
bông lên bất kỳ một vật nào khác.
- Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn.
- Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trường và nhẹ nhàng đưa que
cấy ra.
+ Nếu ống giống là canh trường lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra.
+ Nếu ống giống là canh trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặt
thạch. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên.
- Đốt miệng ống nghiệm một lần nữa rồi nút bông lại. Đặt ống nghiệm lên giá.
- Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt lên phiến kính để làm vết
bôi.
- Sát trùng lại que cấy rồi đặt lên giá.

I. Tiêu bản giọt ép
1. Phạm vi sử dụng
Tiêu bản giọt ép cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật
2. Cách làm
- Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính sạch, trong suốt.
- Dùng que cấy hoặc pipet lấy canh trường vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính. Với canh trường
đặc, cho trước một giọt muối sinh lý (0,5 - 0,85% NaCl) lên phiến kính. Sau hòa canh trường vi
sinh vật vào.
Chú ý: Lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều hoặc ít quá. Nhiều quá, canh trường sẽ trào
ra ngoài. Nếu ít quá, tiêu bản mau khô và hay tạo thành bọt khí trong tiêu bản, rất khó quan sát.
- Ép lá kính lên giọt canh trường bằng cách để một cạnh lá kính tiếp xúc với phiến kính sát mép
giọt canh trường, nghiêng góc 60O, từ từ hạ lá kính nằm lên mặt phiến kính. Tránh đặt lá kính
nhanh, mạnh quá giọt canh trường bắn ra ngoài hoặc lớp không khí giữa lá kính và phiến kính
không kịp thoát sẽ tạo thành bọt khí.
Chú ý:
+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy lọc
thấm bớt nước đi.
+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô.
- Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.
II. Tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản
ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học.
2. Cách làm
- Dùng lá kính và phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính.

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lá kính lên phiến
kính sao cho giọt canh trường "treo" trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canh
trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của phiến kính.
Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh vật dễ
dàng hơn, tiêu bản giữ được lâu hơn và nhờ đó ta có thể quan sát phương thức chuyển động và
sinh sản của vi sinh vật.
III. Tiêu bản vết
Dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào trong khuẩn lạc vi sinh vật hoặc phổ biến
hơn là để nghiên cứu hình thái của chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn,
nấm mốc.
2. Cách làm
Dùng dao mổ cắt lấy một khối nhỏ môi trường thạch có cấy vi sinh vật đã mọc dày đặc hay mọc
thành các khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính sao cho phía có vi sinh vật nằm ở bên trên. Sau
đó lấy một lá kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vòng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ lá kính xuống rồi
rút que cấy hay kẹp sắt ra ngay và giữ đúng vị trí của lá kính. Đặt tiêu bản nhận được lên một
phiến kính đã có nhỏ sẵn một giọt nước hay một giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40,
cho phần vết nằm ở phía dưới, ta sẽ thu được tiêu bản "vết". Cũng có thể dùng ngay phiến kính
ép nhẹ lên bề mặt của khuẩn lạc hay bề mặt của đám vi sinh vật rồi lấy ra làm tiêu bản "vết"
IV. Nhuộm màu vi sinh vật sống

Đôi khi muốn thấy rõ hơn hình dạng tế bào vi sinh vật, người ta sử dụng thuốc nhuộm loãng như:
xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công gô 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001%
1. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không độc hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng
ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu.
2. Cách làm: Có hai cách nhuộm màu vi sinh vật sống
Cách 1
- Nhỏ một giọt thuốc nhuộm (không quá lớn) lên phiến kính

- Lấy một giọt canh trường vi sinh vật, hòa đều với thuốc nhuộm.
- Đậy lá kính lên và đem quan sát.
Cách 2
- Nhỏ một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính. Dùng que cấy dàn đều thành một vùng nhỏ rồi để
khô tự nhiên
- Nhỏ một giọt canh trường vi sinh vật lên vùng màu đã khô.
C. QUAN SÁT NẤM MEN
I. Đặc điểm hình thái, sinh lý và ứng dụng của nấm men trong công nghiệp
1. Đặc điểm hình thái
- Hình dạng: Nấm men có hình dạng khá phong phú và thay đổi tùy thuộc loài, tùy điều kiện môi
trường, tùy độ tuổi sinh lý. Nói chung nấm men có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục...
- Kích thước: Nấm men có kích thước tương đối lớn, chiều dài từ 6 -10 có khi 12 - 18 , chiều
ngang từ 4 - 8.
Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau:
- Ở nấm men trẻ: (qua 12 - 16 giờ nuôi cấy) màng mỏng, căng, nguyên sinh chất đồng nhất,
không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao.
- Ở nấm men trưởng thành (24 -48 giờ nuôi cấy) kích thước vuông, không bào lớn, số không bào
có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm 10 -15%.
- Ở nấm men đã già (nuôi cấy từ 72 giờ trở lên) màng dầy, nhăn, nguyên sinh chất không đồng
nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có
glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn.
Một số nấm men có tế bào hình dài nối tiếp nhau thành những đạng sợi gọi là khuẩn ty hoặc
khuẩn ty giả. Ở khuẩn ty giả, tế bào không nối liền với nhau chặt chẽ, trong những điều kiện nhất
định chúng tách rời nhau trở thành một tế bào độc lập. Khuẩn ty giả hay khuẩn ty thật thường
thấy ở các giống Endomyces, Endomycopsis, Trichosporon. Muốn kiểm tra khả năng này người
ta nuôi nấm men trong môi trường có nitơ hữu cơ cao, pepton, cao ngô, cao nấm men...

- Cấu tạo: Hầu hết nấm men là đơn bào. Về cấu tạo nó cũng gồm: màng, nguyên sinh chất, hạch.
Trong nguyên sinh chất có không bào và các chất dự trữ khác như glycogen, granuloza, chất béo,
volutin...
2. Đặc điểm sinh lý

- Dinh dưỡng: Nấm men dị dưỡng cacbon. Chúng sống hoại sinh hoặc ký sinh.
- Hô hấp: Nấm men hô hấp tuỳ tiện. Trong điều kiện yếm khí, không có oxy, chúng thực hiện
quá trình lên men chuyển hóa đường thành rượu. Troing điều kiện hiếu khí, có oxy, chúng thực
hiện quá trình oxy hóa cho sản phẩm là sinh khối.
- Sinh sản: Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vô tính và sinh sản hữu tính
nhờ kết hợp bào tử trái dấu. Cách nảy chồi, khả năng tạo bào tử, hình dạng, số lượng nang bào tử
cũng là đặc điểm quan trọng trong phân loại.
- Khả năng tạo bào tử: Khả năng tạo thành nang bào tử và đặc tính của nang là một trong những
đặc điểm quan trọng để phân loại nấm men. Không phải loài nấm men nào cũng có khả năng tạo
thành bào tử, mà chỉ là một số nấm men và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Nang bào
tử hình thành trong các canh trường nghèo chất dinh dưỡng, nhất là nguồn cacbon. Nang bào tử
thường chứa 1- 2 hoặc 4 bào tử. Một số ít loại có tới 8 bào tử. Thường nang bào tử được tạo
thành sau 5 - 10 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch mạch nha. Khi gặp điều kiện thuận lợi,
nang bao tử vỡ ra, bào tử nảy mầm và trở thành tế bào dinh dưỡng mới.
- Khả năng chuyển động: Nấm men không chuyển động
3. Ứng dụng trong công nghiệp

- Nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên, vô cơ hóa
các chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái.
- Sản xuất các dung môi hữu cơ: Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu, vì vậy từ lâu
con người đã biết sử dụng nấm men để nấu rượu, nấu bia, sản xuất cồn, glyxerin.
- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein, vitamin, axit amin: Nấm men
sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng giầu protein và vitamin nên chúng được sử dụng rộng
rãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người và gia súc. Nấm men cũng được
làm nở bột mỳ, gây hương nước chấm, sản xuất một số dược phẩm... và gần đây còn được
nghiên cứu sử dụng để sản xuất cả lipit.

II. Các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng canh trường nấm men và phương pháp xác
định
1. Độ thuần khiết: Canh trường sạch là chỉ tiêu đầu tiên để đánh giá chất lượng một canh
trường nấm men. Để kiểm tra điều này, cách đơn giản, dễ làm nhất trong phòng thí nghiệm là
làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi, nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có cùng đặc
tính hình thái thì có thể sơ bộ kết luận độ sạch của canh trường; nếu không, đếm số tế bào lạ
trong năm đến bảy kính trường, lấy trung bình rồi suy ra độ thuần khiết của canh trường theo
công thức sau:
Độ thuần khiết = 100% -
2. Tỷ lệ tế bào sống trên tổng số tế bào

Nguyên tắc: Việc quan sát tế bào nấm men sống và chết dựa trên nguyên tắc
- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng tế bào sống
- Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu
Vì vậy ta có thể dùng xanh metylen để nhuộm phân biệt tế bào sống và chết.
Cách tiến hành:
Cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc nhuộm (đã pha loãng 10 lần) lên phiến
kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát. Tế bào chết
bắt màu xanh còn tế bào sống không màu.
Tính toán:
Muốn tính tỷ lệ tế bào sống ta đếm số tế bào chết và tổng số tế bào chung (sống và chết) trên 5
kính trường rồi suy ra phần trăm tế bào sống theo công thức sau:
Nếu nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng lượng tế bào chết không quá 2 - 4%.
3. Tỷ lệ tế bào nảy chồi trên tổng số tế bào

Đây là một vịec làm quan trọng khi đánh giá chất lượng canh trường nấm men giống để tiếp vào
thùng lên men. Trong canh trường nấm men giống đem lên men, lượng tế bào đang nảy chồi ít
nhất phải chiếm từ 10 đến 15%. Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, số tế bào
nảy chồi có thể đạt tới 70 - 80%.
Cách tiến hành:

Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kính trộn
đều. Đậy lá kính lại, đặt lên khay kính và quan sát. Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy
chồi rồi suy ra phần trăm.
Tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng 1/2 tế bào
mẹ.
4. Số lượng tế bào trong 1 ml canh trường

Khi đánh giá chất lượng canh trường nấm men dùng trong sản xuất, ngoài việc tính tỷ lệ tế bào
nảy chồi cần đếm số tế bào trong 1ml. Trong 1ml canh trường nấm men phát triển bình thường,
phải có 12 - 14 triệu tế bào. Người ta thường đếm trực tiếp bằng các buồng đếm Thoma,
Goriaep. Nguyên tắc cấu tạo của các buồng đếm này giống nhau.
+ Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang
ngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và được chia thành hai khoang nhỏ nhờ
một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một số ô
vuông lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16) có cạnh dài 1/20 mm. diện tích
1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3. Mỗi buồng đếm có kèm theo một
lá kính.
- Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường (với H2SO4 10% hoặc NaOH
10%), tùy canh trường mà mức độ pha loãng nhiều hay ít (10, 100...lần)
- dùng bông thấm nước, tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính
lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa
lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu).
Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành bọt
khí.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo
nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọ
mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô.
Chú ý:
- Cần làm lặp lại 3-4 lần

- Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô
đang đếm.- Trước và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải được rửa kỹ bằng nước cất rồi
dùng bông lau sạch để khô.
- Khi số tế bào trong một ô quá 16 thì nên pha loãng canh trường thêm.
Tính toán:
Nếu dùng buồng đếm có bề sâu h = 0,1 mm và diện tích 1ô S = 1/25 mm2
thì số tế bào trong 1 ml canh trường là:
ax1000xf
hxS
trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô
f là hệ số pha loãng của canh trường
h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích một ô
1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm3.
5. Chỉ tiêu công nghệ
Chỉ tiêu này thường được đánh giá thông qua khả năng của nấm men chuyển hóa nguyên liệu
đầu vào hay tạo thành sản phẩm sau một thời gian nhất định. Việc xác định lượng sản phẩm tạo
thành giúp đánh giá chính xác và dễ thực hiện hơn.
C. ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO

Đo kích thước tế bào nấm men (hoặc vi sinh vật nói chung) phải dùng những dụng cụ riêng biệt
và đơn vị đo tính bằng micromet (1 = 0,001mm).
I. Dụng cụ đo:
Thước đo vật kính: Thước đo vật kính dùng để xác định hệ số đo. Đó là một phiến kính trong
suốt. Ở giữa có một vòng tròn. Trong vòng tròn có một vạch khắc dài 1mm, được chia thành 100
khoảng bằng nhau, mỗi khoảng bằng 10.

Hình 8: Hình ảnh thước đo vật kính
Thước đo thị kính: Dùng để đo kích thước vi sinh vật. Thước đo thị kính gồm một ống kính,
trong đó có các vạch chia đánh số từ 1 đến 50. Một vạch chữ thập có thể di động được từ phải
sang trái (hoặc ngược lại) nhờ một ốc vặn bên ngoài. Xung quanh ốc vặn chia thành 100 vạch
bằng nhau. Khi ốc này chuyển đi một vạch thì giao điểm của chữ thập trong ống kính chuyển đi
một khoảng bằng 0,01 vạch trên thước đo thị kính.
Hình 9: Hình ảnh thước đo thị kính
II. Cách tiến hành:

Xác định hệ số đo:
+ Đặt thước đo vật kính lên khay kính, quan sát

và điều chỉnh sao cho trong kính trường nhìn thấy
rõ các vạch chia của thước đo vật kính.
+ Lấy thị kính ra, lắp thước đo thị kính lên ống
kính. điều chỉnh cho thang chia của thước đo thị

kính trùng với các vạch chia của thước đo vật kính. Tìm 4 vạch của hai thang chia trùng nhau.
Xác định xem bao nhiêu vạch trên thước đo thị kính ứng với bao nhiêu vạch của thước đo vật
kính.
Ví dụ: 2 vạch chia của thước đo thị kính trùng với 21 vạch của thước đo vật kính. Nghĩa là cứ
một vạch của thước đo thị kính ứng với 10,5 vạch của thước đo vật kính. Vậy, một vạch của
thước đo thị kính có độ dài bằng 105 . Hệ số đo bằng 105.
Hình 10: Cách xác định hệ số đo
Cách đo
- Làm tiêu bản nhuộm đơn loài vi sinh vật định đo
- Tháo vật kính ra, đặt tiêu bản lên khay kính. Tìm một tế bào điển hình. điều chỉnh cho giao
điểm của hai đường chéo trùng với một đầu của tế bào, gọi đó là điểm a và ghi số khoảng và số
vạch trên ốc chuyển. Ví dụ: không khoảng và số trên ốc chuyển là 23. Lại chuyển giao điểm sang
đầu kia của tế bào, trên ốc chuyển thấy vạch 25 (b).
Cách tính
Kích thước tế bào vi sinhvật được tính theo công thức:
X = (b - a).h
trong đó: a - số đo ở điểm đầu
b - số đo ở điểm cuối
h - hệ số đo
Cần lưu ý rằng hệ số đo của mỗi hệ thống vật kính khác nhau không giống nhau. Vì thế, khi xác
định hệ số đo ở hệ thống nào thì phải đo ở hệ thống đó.
Chú ý: Để tìm thấy vạch chia trên thước đo vật kính một cách nhanh chóng, trước hết nên dùng
vật kính phóng đại nhỏ (10x) để tìm. Điều chỉnh cho vạch chia vào giữa kính trường, sau đó mới
thay vật kính định sử dụng.


33 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH
Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH

QUAN SÁT VI KHUẨN
A. LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH
I. Các đặc điểm của tiêu bản vi sinh vật cố định

Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó có
ưu điểm sau:
- Đơn giản, dễ làm
- Cho phép ta quan sát rõ hình thái và một số cấu tạo của tế bào vi sinh vật hay định lượng vi
sinh vật.
- Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh.
II. Cách làm tiêu bản
1. Làm vết bôi

- Chuẩn bị một phiến kính sạch và khô
- Lấy canh trường vi sinh vật: thao tác tương tự như cách lấy giống vi sinh vật.
- Nghiêng que cấy 10 - 15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh. Làm
xong, sát trùng que cấy để lên giá.
Chú ý:
- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
- Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng.
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều.
2. Làm khô vết bôi

Để vết bôi khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên phần không khí nóng của đèn cồn cho nhanh. Tránh đốt
nóng trực tiếp vì như vậy tế bào bị quắt lại, cấu tạo của nó bị thay đổi. Phải để vết bôi thật khô
mới làm tiếp tục.

3. Cố định vết bôi

a. Mục đích: Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
- Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là loại vi sinh vật gây
bệnh).
- Gắn chặt vi sinh vật và phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng không bị trôi.
b. Các phương pháp:

+ Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất.
Kẹp phiến kính giữa hai ngón tay các và trỏ, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn đèn
cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá.
+ Phương pháp dùng hóa chất: Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào thì cố định bằng cách hơ nóng
không lợi mà phải cố định bằng hóa chất vì cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế
bào và không làm đứt các tiên mao. Người ta thường dùng hóa chất là các loại rượu hay axeton
và thực hiện một trong những cách sau:.
- Rượu etylic: Nhỏ rượu lên vết bôi hoặc nhúng vết bôi vào rượu. Rượu tuyệt đối tác dụng tức
thời, rượu 95O ngâm trong 5 - 15 phút, rượu càng loãng thời gian càng lâu.
- Rượu metylic trong 2-5 phút.
- Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút.
- Dùng rượu etylic và đốt cháy: nhỏ vài giọt rượu 90 - 95O lên vết bôi rồi đốt cháy và dập tắt
ngay. Làm thế vài lần rồi để khô.
4. Nhuộm màu
Nguyên tắc:
- Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp phụ nên cần sử dụng thuốc nhuộm có
khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành
những hợp chất màu đặc trưng, bền vững. Thuốc nhuộm thường dùng là các chất màu anilin, chủ
yếu là loại kiềm và trung tinh.
- Vì thành phần hóa học của tế bào các loài vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế bào rất
khác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu không giống nhau. Tùy theo mục đích nghiên cứu
mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.
Các phương pháp Có hai phương pháp nhuộm chính: nhuộm đơn giản và nhuộm phức tạp

a. Nhuộm đơn giản

+ Định nghĩa: Trên tiêu bản chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm.
+ Các bước tiến hành: Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm.
- Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh (gác nằm ngang trên miệng bocan)
- Nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi. chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều quá và trong suốt thời
gian nhuộm, trên vết bôi luôn có một lớp thuốc nhuộm phủ đều.
- Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và loại thuốc nhuộm đem dùng. Trong điều kiện nhiệt
độ phòng, đối với thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl cần để yên 1 - 2 phút còn xanh metylen là 3 - 5
phút. Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm và rút ngắn thời gian nhuộm có thể hơ nhẹ phía
dưới phía kính trên đèn cồn .
- Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rưea sạch bằng các nghiêng phiến kính và cho một
dòng nước chảy nhẹ qua. Nước sẽ kéo thuốc nhuộm đi. Chú ý không xối nước trực tiếp lên vết
bôi để tránh bị trôi vi sinh vật.
- Vẩy nước, dùng giấy thấm khô hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn.
- Quan sát tiêu bản ử vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) soi dầu.
b. Nhuộm phức tạp

+ Khái niệm: Trên tiêu bản sử dụng đồng thời hai hay nhiều loại thuốc nhuộm.
+ Ý nghĩa của phương pháp nhuộm phức tạp:
- Nhằm nghiên cứu hình thái, cấu trúc đặc biệt của tế bào làm cơ sở cho việc phân loại vi sinh
vật
- Nhằm phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các tổ chức, cơ quan, của cơ thể động thực vật
hay trong các vật phẩm nghiên cứu.
- Là biện pháp bảo quản các tiêu bản vi sinh vật lâu dài hơn, phục vụ cho công tác nghiên cứu.
+ Nguyên tắc của nhuộm phức tạp
Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phàn khác nhau của một cấu trúc thường có tính chất lý
học, hóa học cũng như khả năng bắt màu khác nhau.
Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta nghiên cứu cấu
tạo và đặc tính của tế bào cũng như sự khác nhau giữa các loài vi sinh vật.

+ Các phương pháp nhuộm phức tạp thường là: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, tiên mao, thể ẩn
nhập, chất nhân, vỏ nhày v.v.
Phương pháp nhuộm Gram
Phương pháp này do Christin Gram đưa ra vào năm 1884. Đây là một phương pháp nhuộm quan
trọng dùng để định loại vi sinh vật dựa trên thành phần cấu tạo của chúng.
* Nguyên tắc
Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chất
protein đặc biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie, khi nhuộm phức chất này kết
hợp với loại thuốc nhuộm triphenylmêtan (như gential violet, cristal violet, metyl violet...) và iôt
sẽ cho màu tím rất bèn vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi
là vi sinh vật Gram dương (+) nếưu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-).
Dựa vào khả năng bắt màu gram người ta chia

vi sinh vật thành hai nhóm:
- Gram dương (+): gồm hầu hết các loại cầu

khuẩn, các trực khuẩn hiếu khí có bào tử
(Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,
Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn...
- Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột

như Bacterium coli, Bacterium typhi,
Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vi
khuẩn axetic...
Hình 11: Cấu tạo lớp màng của VSV Gram (-) và Gram (+)
* Các bước tiến hành
Sau khi cố định vết bôi thì tiến hành nhuộm:
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút.
- Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong một phút.
- Rửa nước
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cho đến khi tan hết màu

- Rửa nước
- Nhuộm bổ sung Fuchsin trong một phút
- Rửa nước
- Làm khô tiêu bản và soi dưới vật kính dầu.
- Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) có màu tím, gram (-) màu hồng.
Phương pháp nhuộm Gram không phải bao giờ cũng cho kết quả ổn định, nó còn phụ thuộc trạng
thái nuôi cấy, lứa tuổi sinh lý và đặc tính một số loài (nên nhuộm lúc vi sinh vật còn non). Ngoài
ra lúc tẩy màu nếu làm thiếu cẩn thận thì kết quả cũng không chính xác. Để đảm bảo kết quả nên
dùng cồn có iôt thay cồn (100ml cồn + 2 - 4ml nước iôt 10%). Trong cồn có iôt, vi khuẩn gram (-
) bị mất màu sau 5 phút còn vi khuẩn gram (+) vẫn giữ màu sau 1 giờ.
B. QUAN SÁT VI KHUẨN
I. Đặc điểm hình thái, sinh lý và ứng dụng của vi khuẩn trong công nghiệp

Hình dạng: Căn cứ vào hình dạng bên ngoài của vi khuẩn, người ta chia chúng thành 3 nhóm
chính là cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn.
+ Cầu khuẩn (coccus) là những vi khuẩn mà tế bào có dạng hình cầu, rất phổ biến trong tự nhiên.
Tùy theo kiểu phân chia tế bào mà người ta chia cầu khuẩn thành một số nhóm như:
- Đơn cầu khuẩn (Monococcus) hay vi cầu khuẩn (Micrococcus) có kích thước rất nhỏ, có khả
năng phân chia tế bào theo một mặt phẳng duy nhất và sau khi phân chia xong thì hai tế bào con
tách rời nhau. Chúng chủ yếu là những loại sống hoại sinh, có nhiều trong đất nước, không khí.
- Song cầu (Diplococcus) cũng phân chia tế bào theo một mặt duy nhất nhưng sau khi phân chia
hai tế bào vẫn dính nhau. Chúng chủ yếu là những vi khuẩn gây bệnh.
- Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus) có khả năng phân chia tế bào theo hai mặt phẳng vuông góc với
nhau, từ một tế bào thành bốn tế bào dính liền nhau. Loại này có ít trong tự nhiên.
- Bát cầu khuẩn (Sarsina) là những cầu khuẩn có khả năng phân chia tế bào theo ba mặt phẳng
vuông góc, từ một tế bào thành tám tế bào. Loại này thường sống hoại sinh trong đất, có nhiều ý
nghĩa đối với nông nghiệp. Ví dụ Sarsina urea có khả năng tổng hợp enzim ureaza. Ngoài ra còn
một số loại bát cầu khuẩn sống ký sinh trong thực vật gây nên hư hỏng rau quả.

- Liên cầu khuẩn(Streptococcus) được tạo thành do sự phân cắt tế bào theo một hướng và sau khi
phân chia xong thì các tế bào dính liền nhau thành chuỗi. Loại này có nhiều trong tự nhiên, đặc
biệt trong rau quả, thực phẩm. Chúng có nhiều ý nghĩa trong công nghiệp, nhất là công nghiệp
thực phẩm như sản xuất axit lactic, chế biến sữa chua, fomat, chế biến rau quả. Ngoài ra còn có
nhiều loại gây bệnh (liên cầu trùng) làm viêm đường hô hấp, viêm khớp.
- Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) là những loại cầu khuẩn mà sự phân chia tế bào không xảy ra
theo một hướng nhất định, sau khi phân chia các tế bào sắp xếp hỗn độn (dạng chùm nho). Trong
tự nhiên, đây chủ yếu là loại vi trùng gây bệnh mụn nhọt, ví dụ như Staphylococcus aureus.
+ Trực khuẩn: là những vi khuẩn hình que, chiều dài lớn hơn chiều rộng rất nhiều. Đa số trực
khuẩn có tiên mao và di chuyển nhờ tiên mao. Nhiều loại trực khuẩn có khả năng tạo bào tử. Dựa
vào khả năng tạo bào tử người ta chia trực khuẩn thành hai nhóm:
- Trực khuẩn có bào tử (Bacillaceae)
- Trực khuẩn không có bào tử (Bacterium)
Tùy theo sự bố trí và kích thước của bào tử, trực khuẩn có bào tử lại chia thành hai nhóm:
- Bacillus: bào tử nằm lọt trong tế bào, không làm biến dạng tế bào.
- Clostridium: bào tử lớn hơn bề ngang tế bào, làm tế bào bị phình ra hoặc có dạng dùi trống.
Trực khuẩn sinh bào tử thường có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, y học. Ví dụ Bacillus
subtilis được sử dụng để tổng hợp -amilaza; Bacillus anthracis là vi khuẩn gây bệnh mụi than ở
động vật có sừng. Clostridium tetani gây bệnh uốn ván.
Đa số trực khuẩn đứng riêng rẽ, nhưng có một số loại liên kết với nhau gọi là diplococcus hay
diplobacterium hoặc xếp thành chuỗi gọi là Streptobacterium hay Streptobacillus.
+ Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn mà tế bào có hình dạng lò xo hay một nửa vòng xoắn. Chúng
chia làm hai loại chính:
- Phẩy khuẩn (Vibrio) là loại tế bào có nửa vòng xoắn.
- Spirillium là loại tế bào có một vài vòng xoắn.
Xoắn khuẩn có khả năng di động bằng tiên mao hoặc bằng cách uốn vặn vòng xoắn. Đa số trong
chúng sống hoại sinh, một số sống ký sinh gây bệnh. Ví dụ: Vibrio chorela gây bệnh lao,
Spirillium rubrum gây bệnh dịch hạch.
Kích thước:Kích thước của vi khuẩn biến thiên theo cấu tạo.

- Cầu khuẩn có kích thước xấp xỉ 1 - 2.
- Trực khuẩn dài 1 - 5; đường kính khoảng 0,5 - 1.
- Xoắn khuẩn: Vibrio thường dài 1 -3, còn Spirillium 5 - 30.
Hình dạng và kích thước của tế bào là đặc điểm khá ổn định của từng loài và thường được sử
dụng như một chỉ tiêu để phân loại. Tuy nhiên, trong thực tế có những biến thiên nhất định. Tùy
thuộc điều kiện môi trường và thời gian nuôi cấy mà hình dạng có thể chuyển từ hình cầu sang
hình que qua những dạng trung gian.
Cấu tạo: Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản, có nhiều tính chất và dấu
hiệu của một cơ thể thực vật.Về cơ bản cấu tạo tế bào vi khuẩn không khác so với tế bào sinh vật
bậc cao.
a. Màng của vi khuẩn

Bên ngoài cùng có một lớp màng dày gọi là màng tế bào. Bên trong có một lớp màng mỏng gọi
là màng nguyên sinh chất. Trong đó có chất nguyên sinh và có nhiều bào quan khác nhau. Một
số vi khuẩn bên ngoài có một lớp giáp mạc (capsul).
+ Giáp mạc (capsul) là một bộ phận phụ của tế bào vi khuẩn, có thể tách ra mà không gây ảnh
hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn. Đó là lớp chất nhày, lỏng lẻo bám xung quanh tế bào
nên còn gọi là màng nhày. Màng nhầy này được hình thành do sự nhày hóa màng tế bào, tạo nên
một lớp vỏ bao bọc bên ngoài tế bào. Ở một số loại vi khuẩn, vỏ này chỉ bao bọc một tế bào như
Bacillus anthraxit. Ở một số loài khác vỏ này bao bọc hàng chục tế bào, do vậy còn gọi là khuẩn
bao đàm như Azotobacter chrococcum.
*Thành phần chủ yếu của giáp mạc là polysacarit hoặc polypeptit tùy loại vi khuẩn. Ví dụ giáp
mạc của Acetobacter xylynum chủ yếu là polypeptit.
Điều kiện hình thành giáp mạc biến thiên theo tính chất từng loài vi khuẩn nhưng cơ bản là trong
điều kiện môi trường giàu đường, ít đạm.
*Chức năng: Tạo giáp mạc là hình thức tự vệ của vi khuẩn. Vi khuẩn tạo giáp mạc để chống lại
chất kháng sinh diệt khuẩn. Tuy nhiên, 98% trọng lượng giáp mạc là nước, bởi vậy giáp mạc còn
có chức năng chống lại sự khô cạn, kéo dài thời gian sống của vi khuẩn. Ngoài ra, giáp mạc còn
là nơi dự trữ thức ăn và thải các chất không cần thiết của quá trình trao đổi chất. Một số vi khuẩn
như vi khuẩn lưu huỳnh dùng giáp mạc bám vào các vật thể trong môi trường để di động

+ Màng (membrane) là bộ phận chính, nằm ngoài cùng, sát giáp mạc, mỏng, bề dày cỡ 10 - 20
nm, chiếm 20% trọng lượng khô của tế bào, có tính đàn hồi, tính bán thấm và độ bền cơ học cao,
nhờ đó chống được sự va đập, giúp cho vi khuẩn trao đổi chất dễ dàng với môi trường.
Màng tế bào không có màu, trong suốt, khả năng khúc xạ ánh sáng kém, rất khó bắt mầu các
thuốc nhuộm thông thường do vậy khi nghiên cứu phải sử dụng biện pháp đặc biệt như gây hiện
tượng co nguyên sinh (plasmolyse) bằng cách ngâm vào dung dịch muối ưu trương 0,2M KNO3
hay 0,2M NaCl thì tế bào chất bị co lại (vì nước thoát ra ngoài), màng sẽ tách ra. Cũng có thể
dùng siêu âm phá vỡ tế bào hoặc dùng kính hiển vi điện tử để bóc màng.
Thành phần hóa học của màng chủ yếu là polysacarit, lipit, lipoit, protein với các loại đường
glucoza, araphinoza, lactoza. Khác với màng tế bào thực vật, màng tế bào vi khuẩn không có hợp
chất xenluloza.
Chức năng của màng là bảo vệ tế bào chất và thực hiện quá trình trao đổi chất.
+ Màng nguyên sinh chất (citoplasmid membrane). Đó là phần chất nguyên sinh nằm sát màng tế
bào, dày khoảng 50 - 100AO, chiếm gần 10 - 15% trọng lượng khô của tế bào, được cấu tạo từ
một phức chất cơ bản là lipoprotein. Dưới các tiêu bản siêu cắt, người ta thấy màng nguyên sinh
chất gồm ba lớp: lớp trong cùng và ngoài cùng là protein, lớp giữa là photpholipit. Sự sắp xếp
này làm tăng khả năng bán thấm của màng tế bào.
Chức năng của màng nguyên sinh chất:
- Là nơi thực hiện quá trình tổng hợp một số thành phần của tế bào như màng tế bào, giáp mạc,
tiên mao, vì 90% enzim oxy hóa khử (dehdrogenaza và xitocrom) nằm ở vùng này.
- Nó chủ động tích lũy thức ăn cho tế bào vì enzim permeaza có vai trò quan trọng giống như là
một enzim vận chuyển cũng định cư ở màng tế bào chất.
- Duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào.
b. Nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn.

Nguyên sinh chất là bộ phận chính, chủ yếu của tế bào, nằm phía trong màng nguyên sinh chất,
là nơi thực hiện mọi quá trình tổng hợp và phân giải các chất của tế bào trên cơ sở đó tế bào phát
triển và đổi mới.
Thành phần hóa học của nguyên sinh chất gồm 90% nước còn lại là protein.
ở tế bào trẻ, nguyên sinh chất là đồng nhất quang học. ở tế bào già nó mất tính đồng nhất do việc
hình thành một số bào quan như không bào và một số thể vùi dự trữ.

+ Riboxom là trung tâm tổng hợp protein cho tế bào. Riboxom có hai nửa cấu tạo. Khi tổng hợp
protein, các riboxom tập hợp thành một vùng gọi là polyxom. Thành phần hóa học chính của
riboxom là protein và axit nucleic.
+ Mezoxom là những tiểu thể hình cầu, nằm ở gần vách ngăn ngang của tế bào, vai trò chính là
giúp tế bào trong quá trình phân chia.
+ Không bào (vacuola) có cấu trúc hình cầu hoặc hình bầu dục, chỉ xuất hiện ở những tế bào già.
Trong không bào chứa nhiều nước và một số chất vô cơ hòa tan. Vai trò của nó là điều chỉnh áp
suất thẩm thấu của tế bào.
+ Sắc thể là những cấu trúc hình hạt có chứa khuẩn lục tố. Vai trò của sắc thể là chuyển quang
năng thành hóa năng giống như lục lạp ở thực vật.
+ Các loại thể vùi dự trữ: là nơi chứa các chất dự trữ cho tế bào, được hình thành khi tế bào tổng
hợp thừa một số chất hoặc trong môi trường rất giàu thức ăn. Nó được đưa ra sử dụng khi môi
trường cạn thức ăn. Thể vùi có các dạng:
- Hạt volutin (hay còn gọi metacromatin - dị nhiễm sắc) bắt màu không đồng đều với màu của tế
bào chất. Vì trong thành phần của nó chủ yếu là ARN và photpho nên khi nhuộm xanh metylen
cho màu tím. Hạt này hình thành khi tế bào rơi vào môi trường giàu nitơ, photpho. Chúng có
nhiều trong vi khuẩn Spirillium volutans.
+ Hạt glycogen và granuloza là dạng dự trữ gluxit, thường được hình thành trong môi trường có
nhiều đường.Khi nhuộm iôt glycogen cho màu nâu sẫm còn granuloza cho màu xanh thẫm.
Những hạt này là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng cho cơ thể.
+ Hạt lipit là nơi dự trữ chất béo. Chúng tồn tại trong tế bào chất dưới dạng những giọt mỡ trung
tính.
+ Thể vùi vô cơ bao gồm:
- Hạt lưu huỳnh S là sản phẩm của quá trình oxy hóa sunfua hidro:
H2S + O2 = S + H2O + E
và được sử dụng như một dạng dự trữ lưu huỳnh.
- Ngoài ra còn có những tinh thể muối canxicacbonat và canxioxalat.
+ Nhân của tế bào: Tế bào vi khuẩn có nhân nhưng tồn tại ở dạng nguyên thủy nhất. Đó là một
sợi ADN mạch vòng và nằm phân tán đều trong tế bào chất, chưa hình thành một loại hạt cụ thể
nào. Đa số vi khuẩn có nhân theo kiểu này, nhưng ở một số ít vi khuẩn, người ta thấy phân tử

ADN này nằm tập trung tại một vùng nhất định trong tế bào chất, tạo nên vùng nhân - như vậy
bắt đầu có dấu hiệu nhân phân hóa khá rõ rệt. Loại này chỉ ở niêm vi khuẩn (vi khuẩn nhầy) mới
có.
Vai trò của nhân là truyền tín hiệu di truyền và kiểm soát quá trình tổng hợp protein.

Dinh dưỡng: Đa số sống hoại sinh hoặc ký sinh, một số có khả năng tự dưỡng ni tơ như vi khuẩn
nốt sần sống cộng sinh ở rễ cây bộ đậu.
Hô hấp: Các vi khuẩn hô hấp hiếu khí hay kỵ khí hoặc tùy tiện phụ thuộc vào đặc tính loài.
Sinh sản:
a. Hình thức sinh sản của vi khuẩn phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách phân cắt ngang tế
bào với sự tạo thành vách ngăn.
b. Các giai đoạn:
Giai đoạn 1: - là giai đoạn chuẩn bị. Tế bào phát triển nhanh về chất, kích thước lớn lên rõ rệt,
hoàn chỉnh các bộ phận bên trong, tập trung các chất dự trữ cần thiết cho việc hình thành bộ máy
hạt nhân và các cấu trúc cho tế bào con ra đời.
Giai đoạn 2: - là giai đoạn hình thành màng ngăn. Ở giữa tế bào, sát màng tế bào mọc lên hai
mấu, đánh dấu vị trí mà tế bào sẽ phân đôi, từ hai mấu này phát triển, tiến dần vào nguyên sinh
chất tạo màng ngăn. Hai màng ngăn cứ tiến dần vào nhau, cùng lúc đó các cơ sở vật chất được
tách đôi. Quá trình này kết thúc khi hai màng ngăn tiến sát vào nhau tạo hai tế bào con đứng độc
lập (hai màng vẫn dính vào nhau).
Giai đoạn 3: Từ tế bào mẹ hình thành hai tế bào con độc lập. Sự phân chia này xảy ra ở giữa tế
bào.
- Phân chia đẳng hình cho hai tế bào con giống hệt nhau
- Phân chia dị hình (sự phân chia lệch về một phía) cho hai tế bào con không bằng nhau.
Các nhóm vi khuẩn khác nhau thì khả năng phân tách tế bào có thể xảy ra theo nhiều hướng khác
nhau.
- Cầu khuẩn phân tách theo 1, 2 hoặc 3 mặt phẳng trực giao cho 2, 4 hoặc 8 tế bào con.
- Trực khuẩn, xoắn chỉ có hình thức cắt ngang tế bào.

Hình thức sinh sản hữu tính nguyên thủy của tế bào có thể xảy ra nhưng rất hiếm hoi. Hai tế bào
kết hợp với nhau tạo thành kết hợp tử và tạo ra hai tế bào con theo cách phân đôi. Hình thức này
đôi khi xảy ra với hai bộ phận trong một tế bào làm cho tế bào có sức sống mạnh hơn, nhưng
không phổ biến.
c. Tốc độ sinh sản trung bình của tế bào là sau 20 30 phút tế bào phân cắt một lần. Với những vi
khuẩn chịu nhiệt, thời gian ngắn hơn 5 10 phút một lần còn vi khuẩn chịu lạnh (như vi khuẩn
lao) thì 10 18 giờ.
d. Ý nghĩa của quá trình sinh sản:
- Duy trì nòi giống giúp vi khuẩn thoát khỏi diệt vong.
- Giải thích tại sao quá trình vi sinh xảy ra nhanh chóng.
Khả năng tạo bào tử: Một số loài vi khuẩn trong điều kiện sống bất lợi
có khả năng tạo bào tử. Khi bào tử đã già rất khó bắt màu thuốc nhuộm.
+ Bào tử là những dạng hình cầu hoặc hình bầu dục được hình thành bên trong tế bào ở những
điều kiện đặc biệt, có hình thái, cấu trúc khác hẳn tế bào bình thường. Trong ngành vi khuẩn chỉ
khoảng 1/3 số vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng tạo bào tử khi gặp điều kiện khó khăn. ; đa số
nằm trong nhóm trực khuẩn thuộc họ Bacillaceae, hai giống chính là Bacillus và Clostridium.
Trong cầu khuẩn chỉ Sarsina urea có bào tử. Trong xoắn khuẩn chỉ Spirillium và volutans
desunfovibrio (loại phẩy khuẩn phản sunfat hóa) có bào tử.
+ Quá trình hình thành bào tử bắt đầu từ sự tập trung, cô đặc tế bào chất và chất nhân ở một vùng
nhất định trong tế bào gọi là vùng bào tử. Lượng nước tự do giảm dần, hàm lượng nước liên kết
tăng lên. Bên ngoài vùng bào tử hình thành một lớp vỏ rất dày bằng lipit rất khó thấm nước và
chất hòa tan từ ngoài vào, làm cho các quá trình sinh hóa giảm xuống mức tối thiểu và tế bào đó
biến thành bào tử. Như vậy, bào tử là một tế bào đặc biệt mà ở đó cường độ trao đổi chất là cực
tiểu (minimum). Quá trình này chỉ xảy ra trong những điều kiện môi trường khó khăn: thường là
nhiệt độ cao. Thời gian có thể từ 4 đến 5 giờ hoặc kéo dài vài chục giờ.
+ Cấu trúc của bào tử:
- Ở bên ngoài là ngoại mạc cấu tạo từ lipit không thấm nước và các chất hòa tan.
- Vỏ trong - nội mạc chủ yếu là protein, có vai trò khi bào tử trở thành tế bào.
+ Thành phần hóa học:

- Hàm lượng nước: Trong bào tử không có nước tự do mà chỉ có nước liên kết nên nó có khả
năng chịu nhiệt cao hơn tế bào bình thường vì nước liên kết không làm biến tính protein dưới tác
dụng của nhiệt độ cao.
- Muối canxidipicolinat có tác dụng giữ cho bào tử có tính ổn định nhiệt cao.
+ Đặc tính của bào tử:
- Bào tử vi khuẩn có thể chịu nhiệt rất cao. Khả năng này của từng loài cũng rất khác nhau. Ví
dụ: bào tử của Bacillus cereus chịu được 100OC từ 2 đến 5 phút, bào tử của Bacillus subtillis
chịu được 100OC trpng 180 phút, còn bào tử của Bacillus megaterium ở 100OC chịu được 360
phút. Bào tử của tất cả vi khuẩn thuộc họ Clostridium chịu được 180OC trong 110 phút. Do vậy
phải vô trùng bằng sức nóng khô ở nhiệt độ 160 - 150OC trong 1 - 1, 5 giờ.
- Bào tử rất bền đối với chất phóng xạ và độc tố do có ngoại mạc bảo vệ.
- Khả năng chịu khô cạn của bào tử cũng rất cao
+ Ý nghĩa của việc hình thành bào tử:
- Đây chính là hình thức tự vệ giúp vi khuẩn chống chọi lại những điều kiện khắc nghiệt.
- Việc hình thành bào tử có thể coi là quá trình tiếp xúc, kết hợp giữa các bộ phận khác nhau của
tế bào tạo nên một tế bào mới có sức sống mãnh liệt hơn tế bào cũ.
Khả năng chuyển động: Đa số vi khuẩn có khả năng di động và di động một cách chủ động bằng
cơ quan di động riêng biệt gọi là tiên mao. Một số khác di động bằng cách uốn vặn vòng vòng
xoắn hoặc co bóp, phồng dẹt tế bào. Một số ít di động một cách bị động nhờ những tác động hỗn
loạn trong tự nhiên.
Người ta chia nhóm di động chủ động bằng tiên mao ra các nhóm:
+ Nhóm đơn mao khuẩn (monotricha) là những vi khuẩn chỉ có một tiên mao ở đầu tế bào. Ví dụ
Anphitricha có hai tiên mao ở hai đầu tế bào
+Nhóm chùm mao khuẩn (lophotricha) có một chùm tiên mao ở đầu tế bào. Ví dụ Spirillium
volutans có hai chùm tiên mao ở hai đầu
+ Nhóm chu mao khuẩn (peritricha) gồm những vi khuẩn có các tiên mao bố trí xung quanh toàn
bộ tế bào. Ví dụ vi khuẩn đường ruột Bacterium coli hay Clostridium.

Cấu tạo của tiên mao: Về bản chất, tiên mao là những sợi nguyên sinh chất kéo dài ra, kích thước
mỏng 0,01 0,05 ; dài 6 10 , có trường hợp dài gấp 20 lần kích thước tế bào. Sự bố trí tiên mao
trên tế bào vi khuẩn ảnh hưởng lớn đến đến tốc độ và hướng di động của vi khuẩn.
- Loại một tiên mao di động nhanh, hướng thẳng với vận tốc 20/s, thậm chí có loài tới 200/s.
- Loại chùm mao khuẩn di động chậm hơn và loại chu mao khuẩn còn chậm hơn nữa và không
có hướng rõ rệt.
Chức năng của tiên mao:
Đây là cơ quan giúp cho vi khuẩn tìm kiếm môi trường mới thích hợp - đó là nhu cầu sinh lý phổ
biến. Một số vi khuẩn có tiên mao nhưng trong môi trường cũ hoặc về già tiên mao rụng đi như
Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, nhờ thế làm phát triển bộ máy tiếp xúc của tế bào vi
khuẩn với môi trường bên ngoài và do đó tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất (bộ máy càng
lớn việc hấp thụ chất dinh dưỡng và thải các chất càng dễ dàng).
3. Vai trò và ứng dụng của vi khuẩn
- Tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất trong tự nhiên, vô cơ hóa các chất cặn bã, xử lý ô
nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái.
- Sản xuất các axit hữu cơ và dung môi hữu cơ.
- Sản xuất năng lượng sinh học (khí thắp, nhiên liệu sinh học - "xăng xanh").
- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao
B. QUAN SÁT NẤM MỐC
I. Đặc điểm hình thái, sinh lý và ứng dụng của nấm mốc trong công nghiệp

- Cấu tạo: Nấm mốc là loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi. Có hai loại sợi nấm: sợi có vách ngăn (đa
bào) và sợi không vách ngăn (đơn bào)
- Hình dạng: Đa số nấm mốc có hình sợi phân nhánh. Khi phát triển các sợi chằng chịt với nhau
làm thành hệ sợi nấm - gọi là khuẩn ty thể (micelium). Một số sợi sinh trưởng bằng cách đâm sâu
vào môi trường gọi là khuẩn ty cơ chất. Phần khác phát triển trên bề mặt của cơ chất gọi là khuẩn

ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút muối khoáng và chất dinh dưỡng để nuôi toàn bộ
hệ sợi. Khuẩn ty khí sinh có chức năng hô hấp và mang cơ quan sinh sản là bào tử.
- Kích thước: Sợi nấm có đường kính từ 5 - 20 m, dài cỡ cm hay hơn nữa.

- Dinh dưỡng: Nấm mốc thuộc loại thực vật hạ đẳng không có diệp lục. Chúng có thể sống ký
sinh hoặc hoại sinh.
- Hô hấp: Đa phần nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí.
- Sinh sản: Nấm mốc có thể sinh sản bằng nhiều phương thức:
+ sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp tử
+ Sinh sản sinh dưỡng bằng một đoạn sợi nấm
+ Sinh sản vô tính bằng hạch và chủ yếu nhất bằng bào tử.
- Khả năng tạo bào tử: Bào tử chính là cơ quan sinh sản của nấm mốc. Có hai loại bào tử:
+ Bào tử nội sinh (bào tử nang - endospore).
+ Bào tử ngoại sinh (bào tử đính - exospore)
Sợi nấm mang bào tử gọi là cuống bào tử. Bào tử của nấm mốc có màu sắc đặc trưng cho từng
loài. Bào tử nang của Mucor, Rhizopus có màu đen.Bào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng
hoa cau, Aspergillus niger - màu đen, Aspergillus usami - màu nâu, Aspergillus awamori - màu
nâu đen, Penicillium - màu xanh lam.
Sự hình thành bào tử của nấm mốc rất khác nhau và có tính chất đặc trưng cho từng loài.
- Khả năng chuyển động: Nấm mốc không có khả năng di động nhưng chúng phân bố rất rộng
rãi trong tự nhiên chính là vì bào tử phát tán trong không khí nhờ gió.
3. Ứng dụng trong công nghiệp

- Nấm mốc đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên, vô cơ hóa
các chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái.
- Sản xuất các axit hữu cơ
- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein, vitamin, axit amin, kháng sinh

II. Quan sát và phân biệt bốn loài nấm mốc điển hình : Mucor, Rhizopus,
Aspergilus và Penicillium.
1. Nhóm Mucor và Rhizopus

Sợi nấm đơn bào, chúng có khả năng tạo thành bào tử nang (bào tử nội sinh). Sợi màu trắng, bào
tử nang hơi vàng.
Ở Mucor cuống của bào tử nang phân nhánh và mọc lên ở bất kỳ vị trí nào của sợi nấm.
Ở Rhizopus cuống bào tử nang không phân nhánh, chỉ mọc lên ở những chỗ sợi nấm ăn sâu vào
môi trường, cuống bào tử mọc thành cụm ba bốn cái ở chân của cụm này có mọc ra nhiều sợi
nhỏ ăn sâu vào môi trường trông giống rễ bụi lúa gọi là rễ giả.
2. Nhóm Aspergilus và Penicillium

Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm mang bào tử phình to ra , tạo thành các tế bào hình chai (hay thể
bình) rồi hình thành chuỗi đính bào tử (bào tử ngoại sinh).
Ở Aspergillus cuống của đính bào tử đơn bào. các tế bào hình chai và đính bào tử tỏa đều trên
đầu sợi nấm sinh sản như những tia nước đi ra đầu vòi tưới.
Ở Penicillium cuống đính bào tử đa bào, đầu cuống phân nhánh nhiều lần thành những đốt song
song rồi mới hình thành đính bào tử. Các tế bào hình chai đính bào tử hướng lên cùng một phía
giống như cây chổi.

Hình 12: Đặc điểm hình thái của các loại nấm

Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

1 Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP

I. Khái niệm chung

1. Mục đích, ý nghĩa:

2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:

3. Cách gọi tên

II. Phân loại môi trường

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

2. Phân loại theo mục đích sử dụng

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

3. Phân loại theo tính chất lý học

III. Cách làm môi trường

- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc

- Lọc bằng lòng trắng trứng

- Dùng phễu lọc nóng

3. Phân phối môi trường

Thạch nghiêng khoảng 5ml

Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm

Hộp petri tráng đều dầy 3mm.

4. Khử trùng môi trường

a. Phương pháp Pasteur

b. Phương pháp Tinđan

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực.

5. Bảo quản và kiểm tra môi trường

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

B. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối

2. Một số phương pháp gieo cấy

a. Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác

b. Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng

- Theo hình vòng xoắn

- Theo những đường song song

- Theo một đường thẳng

- Theo từng chem.

c. Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng

d. Cấy trên thạch hộp

- Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp

- Theo các đường song song

e. Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

I. Canh trường tập trung

2. Phương pháp phân lập canh trường tập trung

II. Canh trường thuần khiết

2. Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết.

a. Phương pháp pha loãng môi trường lỏng

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn

b. Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc

Hình 1: Sơ đồ quy trình pha loãng Pasteur

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

c. Phương pháp tách từng tế bào

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur)

III. Phân lập vi sinh vật yếm khí

1. Dùng pipet Pasteur

2. Dùng hộp petri lộn ngược

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật

I. Định lượng trực tiếp

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng

Các phương pháp định lượng trực tiếp