KHẢO SÁT ẢNH HƯ ỞNG CỦ A TỶ LỆ GIỐNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ

PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII

TRONG LÊN MEN MẺ

Tỷ lệ giống ban đầu có ảnh hưởng lớn đến việc tạo sinh khối tế bào nấm men
Saccharomyces boulardii. Tiến hành khảo sát 4 tỉ lệ giống 0.5%, 1%, 5%, 10%. Sinh
khối lớn nhất thu được ở giờ thứ 8 tại tỉ lệ giống 5%. Tại tỉ lệ giống 5%, nấm men sinh
trưởng không có pha lag, sinh khối nấm men lớn nhất, tốc độ sinh trưởng đặc trưng đạt
giá trị cao (0.0155h-1), thời gian thế hệ ngắn (2.50604 giờ).
Từ khoá: Saccharomyces boulardii, tỉ lệ giống, nuôi cấy mẻ.

1. Giới thiệu
S. boulardii đươ ̣c ứng du ̣ng rấ t nhiề u trong mảng dươ ̣c phẩ m, đươ ̣c sử du ̣ng làm
tác nhân probiotic để ngăn chặn hoặc điề u tri ̣ các rố i loa ̣n chức năng tiêu hóa của con
người, ví du ̣ như tiêu chảy liên quan đế n kháng sinh (Elmer et al., 2010) và bệnh nhiễm
trùng ruột do Clostridium difficile (Sullivan et al., 2002), ngăn ngừa tái phát lâm sàng
bệnh Crohn (viêm ruột từng vùng) (Guslandi et al., 2000; Hu et al., 2016). Vì vậy, việc
quan tâm nghiên cứu điề u kiện môi trường nuôi cấ y khác nhau ảnh hưởng đế n khả
năng sinh trưởng và phát triể n của S.boulardii nhằ m tìm ra môi trường thu đươ ̣c lươ ̣ng
sinh khố i với hiệu suấ t và sản lươ ̣ng thu hồ i cao là vấ n đề cầ n đươ ̣c quan tâm.
Tế bào nấ m men S.boulardii có hình elip, hình bầ u du ̣c hay đôi khi có hình cầ u
với vách té bào dày, khoảng 5-10 μm . S. boulardii là một loa ̣i men chiụ nhiệt, phát
triể n tố i ưu ở 370C. Một số nghiên cứu cho rằ ng S. boulardii có tác du ̣ng có lơ ̣i thông
qua nhiề u cơ chế , ví du ̣ ca ̣nh tranh với các chấ t gây bệnh về chấ t dinh dưỡng, ức chế sự
bám dính của vi khuẩ n gây bệnh và trung hòa các yế u tố độc ha ̣i của vi khuẩ n
(McFarland et al., 1994) (Karaolis et al., 2013). Men này vẫn tồ n ta ̣i trong đường tiêu
hóa và đã đươ ̣c chứng minh là ức chế sự phát triể n của số lươ ̣ng vi khuẩ n gây bệnh.
Saccharomyces boulardii là loa ̣i nấ m men yế m khí tùy tiện, nó có thể phát triể n trong
điề u kiện hiế m khí hoặc ki ̣ khí (Czrucka et al., 2007). S.boulardii là vi sinh vật di ̣
dưỡng, sử du ̣ng năng lươ ̣ng từ glucose qua các con đường glycolysis (Van Rij, 1984).
Ngoài ra S.boulardii còn chuyể n hóa đươ ̣c các monosaccharide, polysaccharide,
oligosaccharide, ethanol, acetate, glycerol, pyruvate và lactate.
Bên ca ̣nh sự ảnh hưởng của điề u kiện môi trường, pH, cơ chấ t, oxy, nhiệt độ,...
thì tỷ lệ giố ng vào môi trường cũng là một trong các yế u tố làm ảnh hưởng đế n tố c độ
sinh trưởng, ta ̣o sinh khố i của nấ m men, cu ̣ thể là cường độ sử du ̣ng cơ chấ t của chúng.
Ngoài ra, tỷ lệ giố ng đầ u vào còn ảnh hưởng đế n độ bề n pha lag, tố c độ sinh trưởng
cũng như năng suấ t ta ̣o sinh khố i và chấ t lươ ̣ng sản phẩ m cuố i. Mặc dù ảnh hưởng của
tỷ lệ giố ng lớn (tỷ lệ cao) làm suy giảm pha lag đã đươ ̣c biế t đế n tuy nhiên mố i tương
quan giữa năng suấ t ta ̣o sản phẩ m và tỷ lệ giố ng vẫn chưa đươ ̣c công bố rộng trãi.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ giố ng cấ y giố ng đế n
động ho ̣c sinh trưởng của S. boulardii trong quá trình nuôi cấ y mẻ ở các nồ ng độ là
0.5%, 1%, 5% và 10% nhằ m hướng đế n tố i ưu hóa quá trình lên men của chủng S.
boulardii với nguồ n cơ chấ t succrose trong môi trường Hansen cải biên.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Chủng giống vi sinh vật.

Chủng giống vi sinh vật lựa chọn là nấm men Saccharomyces boulardii ở dạng
đông khô trong dược phẩm Bioflora. Nấm men được chứa trong bao bì kín với khối
lượng tịnh 100mg, bảo quản nhiệt độ thường (300C).
2.2. Nhân giống.
Môi trường nhân giống được sử dụng là môi trường Md1. Môi trường Md1 được
chuẩn bị với tỷ lệ thành phần: 100g/L sucrose, 1g peptone, dịch chiết giá đủ 1000ml, điều
chỉnh pH bằng 5.0 và tiệt trùng bằng autoclave 1210C trong 30 phút.
1g nấm men Saccharomyces boulardii được nhân giống trong 100ml môi trường
Md1 ở 300C trong 24 giờ trên máy lắc vòng với tốc độ xoay 120rpm.

2.3. Khảo sát động học sinh trưởng nấm men.

Sau quá trình nhân giố ng, nấ m men (5, 10, 20 và 30 ml) đươ ̣c bổ sung vào môi
trường M1d (195, 190, 180 và 170 ml) đã đươ ̣c tiệt trùng bình nuôi cấ y (121oC, 15
phút). Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành ở nhiệt độ phòng (30 oC), lắc bằng máy
khuấy từ. Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ giờ thứ 0, mỗi 1 giờ xác định và
ghi nhận các chỉ tiêu mật độ tế bào/ml bằng buồng đếm hồng cầu với độ phóng đại 10,
xác định tỷ lệ tế bào sống bằng cách nhuộm màu xanh methylene, tỷ lệ tế bào nảy
chồi, độ Brix bằng khúc xạ kế. Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng và hàm lượng đường
tiêu thụ theo thời gian ứng với từng nồng độ đường khác nhau.

2.4. Xác định các thông số động học

Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ) được xác định bằng đồ thị log sinh khối theo thời
gian ứng với từng nồng độ cơ chất khác nhau trong suốt pha log trước khi nồng độ cơ
chất giảm đáng kể. Thời gian tế hệ (Td) trong pha log được xác định theo phương
 𝑇 ⁄𝑇 𝑑
trình: NT = N0. 2 . Trong đó, NT là số lượng tế bào trong khoảng thời gian T, N0 là
số lượng tế bào bắt đầu pha log, Td là thời gian thế hệ. Năng suất tạo sinh khối (YP/S)
được xác định trong quá trình lên men.

2.5. Phân tích thống kê.

Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm SPSS với chuẩn Ducan tại mức ý
nghĩa 5%.

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Đường cong sinh trưởng.

Đường cong sinh trưởng được thể hiện ở hình 1.

ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG

0.50% 1% 5% 10%

8.5
LOG N/ML

7.5

6.5

6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
THỜI GIAN (H)

Hình 1. Đường cong sinh trưởng ứng với tỉ lệ giống ban đầu khác nhau.
 Ở các tỷ lệ giố ng khảo sát đươ ̣c thì số lươ ̣ng tế bào tố i đa trong môi trường nuôi
cấ y ở tỷ lệ giố ng 5% là cao nhấ t và cao hơn 10% không đáng kể. Số lươ ̣ng tế bào tố i
đa trong môi trường nuôi cấ y với tỷ lệ 0.5% lớn hơn không đáng kể so với 1%. Kế t quả
này cho thấ y, khi tăng tỷ lệ giố ng nuôi cấ y làm tăng số lươ ̣ng tế bào tố i đa trong quá
trình lên men (Vo Dang Minh Nguyet, 2010).
Đin̉ h sinh trưởng của nấ m men là khác nhau ta ̣i các tỷ lệ giố ng khác nhau, tỷ lệ
giố ng đầ u vào không tỷ lệ thuận với sự phát triể n đế n cực đa ̣i của nấ m men. Tỷ lệ tiế p
giố ng 5% là thích hơ ̣p nhấ t cho việc sử du ̣ng cơ chấ t cũng như ta ̣o sinh khố i của nấ m
men, tuy nhiên với các tỷ lệ còn lại thì quá trình ta ̣o sinh khố i của nấ m men cũng diễn
ra khá ma ̣nh me.̃
Không có pha lag ở tỉ lệ giống 5% và 10%. Pha lag kéo dài 2 giờ ở tỉ lệ giống
0.5% và 3 giờ ở tỉ lệ giống 1%. Theo Jackson (2000) nấ m men khô đươ ̣c sử du ̣ng để
nuôi cấ y có sự xuấ t hiện của pha lag và pha lag diễn ra trong thời gian ngắ n là kế t quả
từ sự thích nghi ban đầ u khi tiế p xúc với môi trường lên men. Tuy nhiên, trong trường
hơ ̣p này thì nấ m men đã đươ ̣c nuôi cấ y trước 24h nên pha lag có thể đã diễn ra trước
thời điể m bắ t đầ u lấ y mẫu.
Sinh khối tối đa là ở tỉ lệ giống 5% (ở giờ thứ 8) và ở tỉ lệ giống 10% (ở giờ thứ
11) có sự khác biệt nhưng không lớn. Sinh khối thu được ở tỉ lệ giống 0.5% và 1%
thấp hơn nhưng không đáng kể. Nguyên nhân có thể lý giải cho sự khác biệt không
đáng kể này là do giới hạn chịu đựng và sự tương tác ngược trở lại của cùng một giống
vi sinh vật trên cùng một loại môi trường với các nhân tố sinh trưởng xác định.

Kết thúc pha log ở giờ thứ 8 đối với tỉ lệ giống 5% và giờ thứ 11 ở các tỉ lệ
giống còn lại, hàm lượng sucrose được nấm men sử dụng có sự khác biệt rõ rệt giữa
các tỉ lệ giống được ghi nhận ở hình 2.

ĐỘ BRIX
12

11.5

11

10.5
Độ Brix

10

9.5

8.5

8
0 2 4 6 8 10 12 14
Thời gian (h)

0.50% 1% 5% 10%

Hình 2. Tốc độ tiêu thụ đường của nấm men

 Hình 3. Tỷ lệ chồi (%Bud) và tỷ lệ tế bào chết (%Death).

Hình 3 cho thấy, ở tỉ lệ giống 5% tại giờ số 9 số lượng chồi giảm mạnh tương ứng
với sự kết thúc pha log. Ở các tỉ lệ giống khác cũng tương tự, sau khi kết thúc pha log,
tỉ lệ chồi giảm, tỉ lệ tế bào chết tang dần. Ở tỉ lệ giống 1%, phần trăm chồi giảm mạnh
ở giờ thứ 8 đến giờ thứ 11 và tăng nhẹ ở giờ thứ 12 nguyên nhân có thể do sự tự phân
giải tế bào giải phóng các cơ chất nội bào thúc đẩy quá trình sinh trưởng. Ở các tỉ lệ
giống, có thể nhận thấy số lượng tế bào chết tăng và tiến gần đến số lượng chồi. Điều
này phù hợp với pha ổn định trong đường cong sinh trưởng.

3.2. Pha log.

Pha log tại các nồng độ đường khác nhau được thể hiện ở hình 4.
 ĐỒ THỊ ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG
0.50% 1% 5% 10%
y= 5.6579e0.027x y = 6.8983e0.0155x y = 7.1905e0.0092x
y = 5.9017e0.0207x
R² = 0.9695 R² = 0.9514 R² = 0.8982
R² = 0.9016

8.5

8
LOG N/ML

7.5

6.5

6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Hình 4. Log phase ở các tỉ lệ giống khác nhau.

Đồ thị hồi quy pha log ứng với các tỉ lệ giống khác nhau được ghi nhận như
trên hình. Tỉ lệ giống 5% và 10% có pha log bắt đầu ở giờ thứ 0, nguyên nhân là do môi
trường nhân giống ban đầu giống với môi trường lên men, vì vậy nấm men không cần
thời gian để thích nghi với môi trường mới và cho sinh khối đạt cực đại ở cuối pha log.
Đối với tỉ lệ giống 0.5% và 1%, có xuất hiện pha lag với độ dài 3 giờ và 2 giờ tương
ứng, có thể là do tỉ lệ giống quá thấp, hiệu ứng ức chế gây ra bởi nồ ng độ cơ chấ t cao,
nguồ n năng lươṇ g và carbon thêm vào đươ ̣c tiêu thu ̣ bởi nấ m men không phu ̣c vu ̣ cho
sự tăng trưởng mà chỉ để tồ n ta ̣i trong môi trường quá ưu trương. Tiế p xúc lâu dài với
môi trường ưu trương có thể dañ tới sự su ̣t giảm nghiệm trong tro ̣ng lưu động màng tế
bào, gây ra khó khăn cho các cơ chấ t khi đi vào và sản phẩ m khi đi ra Log(tế bào) khỏi
tế bào. Do đó, nguồ n carbon bổ sung vào đươ ̣c tiêu thu ̣ bởi nấ m men dùng để duy trì
hoa ̣t động của hệ thố ng vận chuyể n (Qi Zhang et al. 2015) thay vì lên men ta ̣o sinh
khố i.
Từ đồ thị trên, tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ) ứng với tỉ lệ giống 0.5%, 1%,
5% và 10% tương ứng là 0.027, 0.0207, 0.0155 và 0.0092 (h-1) nhận thấy có sự khác
biệt.
Mẫu 0.5% 1% 5% 10%
µ 0.027a 0.0207b 0.0155c 0.0092d
 Thời gian thế hệ được tính toán và ghi nhận ở bảng sau:

Nồng độ 0.5% 1% 5% 10%

Td 1.68315a 2.10156b 2.50604c 4.07037d

Thời gian thế hệ ở tỉ lệ giống 0.5% là nhỏ nhất và thời gian thế hệ lớn nhất ở tỉ lệ
giống 10%.

3.3. Năng suất sinh khối trên cơ chất YP/S

Năng suất sinh khối trên cơ chất được thể hiện ở bảng sau:

Tỉ lệ giống 0.5% 1% 5% 10%

Nồng độ đường (g/l) 100 100 100 100
P (log(tế bào)) 7.8466463 7.7222225 7.9890046 7.951823
YP/S 0.078466 0.077222 0.07989 0.07952

Thời gian thế hệ càng ngắ n thì tố c độ sinh trưởng của vi sinh vật càng nhanh (Lương Đức
Phẩ m, 2010) và hiệu suấ t ta ̣o thành tế bào cao. Khi số lươ ̣ng hoặc tỷ lệ giố ng ban đầ u càng lớn thì
tố c độ phát triể n trong pha này càng nhanh và thời gian để tang đế n số lươ ̣ng cực đa ̣i càng ngắ n
(Lương Đức Phẩ m, 2010).

Năng suất sinh khối trên cơ chất cao nhất thu được ở tỉ lệ giống 5% và năng suất
sinh khối trên cơ chất là tương tự nhau với nồng độ cơ chất ban đầu không đổi, cho
thấy tỉ lệ giống ban đầu không làm thay đổi hiệu suất thu nhận sinh khối trong cùng
điều kiện môi trường.

4. Kết luận
Tỉ lệ giống có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men, tuy
nhiên không làm thay đổi nhiều hiệu suất thu sinh khối của nấm men. Ở tỉ lệ giống cao
(5% và 10%) không cho thấy pha lag, sinh khối tạo ra tương đối cao hơn so với 2 tỉ lệ
giống 0.5% và 1%. Trong quá trình lên men, cần lựa chọn các điều kiện cơ chất, tỉ lệ
giống, pH, … thích hợp và kiểm soát các sản phẩm tạo ra để tạo sinh khối lớn nhất
trong quá trình lên men mẻ.
5. Tài liệu tham khảo.