Tối ưu hóa chiết xuất chất chống oxy hóa phenolic từ vỏ nho
(Vitis vinifera L.) với sự hỗ trợ của sóng siêu âm bằng cách sử
dụng phương pháp đáp ứng bề mặt
Rosa Anna Milella1 • Teodora Basile1 • Vittorio Alba1 • Marica Gasparro1 • Maria Angela Giannandrea 1 • Giambattista Debiase1 •
Rosalinda Genghi1 • Donato Antonacci1
Revised: 5 July 2019 / Accepted: 11 July 2019
Association of Food Scientists & Technologists (India) 2019
Tóm tắt
Hiện nay, việc phân tích các hợp chất có hoạt
tính sinh học được thực hiện dễ dàng bằng các
kỹ thuật sắc ký và phổ hiện đại, nhưng sự thành
công của quá trình này vẫn phụ thuộc vào hiệu
quả của các phương pháp chiết xuất. Nghiên
cứu này nhằm tìm ra các điều kiện tối ưu để
chiết xuất chất chống oxy hóa phenolic từ vỏ
nho có sự hỗ trợ của siêu âm (UAE) bằng cách
sử dụng thí nghiệm đơn yếu tố kết hợp với
phương pháp đáp ứng bề mặt. Các thông số
chiết xuất là nồng độ ethanol, thời gian và nhiệt
độ. Tổng hàm lượng phenolic (TPC và TPC-
280), hoạt động thu gom gốc 2,2-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH) và khả năng hấp thụ gốc
oxy (ORAC) là các biến phụ thuộc. Một mô
hình đa thức bậc hai đã mô tả chính xác dữ liệu
thực nghiệm. Các điều kiện của UAE để tối ưu
chiết xuất từ vỏ nho là: 59,5% etanol, 113,6
phút và 66,8oC để chiết xuất TPC; 61,1% etanol,
99,4 phút và 66,1oC để chiết TPC-280; 57,1%
etanol, 99,5 phút và 66,8oC cho hoạt động thu
dọn gốc DPPH; 60,2% etanol, 82,4 phút và
66,8oC cho giá trị ORAC. Nghiên cứu này cung
cấp thông tin chi tiết và hữu ích để tối ưu hóa
việc chiết xuất phenol vỏ nho, được sử dụng
rộng rãi như một chất bổ sung vào chế độ ăn
uống và dinh dưỡng.
Từ khóa Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm • Các hợp
chất hoạt tính sinh học • Hoạt tính chống oxy
hóa • Nho khô nguyên cành • Phương pháp đáp
ứng bề mặt
Giới thiệu
Nho là nguồn thu nhận chính của các hợp
chất phenolic (PC), hợp chất này thể hiện một
loạt các lợi ích sức khỏe chủ yếu là do hoạt tính
chống oxy hóa của chúng được chứng minh bởi
một số nghiên cứu in vitro (thí nghiệm trong
ống nghiệm), in vivo (thí nghiệm trên sinh vật
sống) và các nghiên cứu lâm sàng/dịch tễ học
Giovinazzo và Grieco 2015; Granato và cộng
sự. 2016; Sing và cộng sự. 2016; Rasines-Perea
và Teissedre 2017). Hàng năm, các sản phẩm
mới có nguồn gốc từ nho được tung ra thị
trường do người tiêu dùng nhận thức rõ hơn về
lợi ích của nho và các sản phẩm từ nho đối với
sức khỏe. Đặc biệt, các sản phẩm phụ từ nho đã
thu hút sự chú ý của các ngành công nghiệp
thực phẩm, dinh dưỡng, dược phẩm và hóa chất
vì hàm lượng cao các hợp chất phenolic
(Karnopp et al. 2017a). Có rất nhiều bằng chứng
khoa học cho thấy những lợi ích sức khỏe của
nho là kết quả của hiệu ứng đồng vận của hỗn
hợp các hợp cháp hóa học thực vật. Do đó, việc
thu được các chất chiết xuất từ nho giàu các hợp
chất đó là một mục tiêu quan trọng.
Thông thường, chiết xuất polyphenol từ trái
cây và rau quả được thực hiện bằng các kỹ thuật
thông thường (chiết xuất Soxhlet, hút ẩm và
chưng cất thủy phân) dựa trên hiệu quả chiết
xuất của các dung môi khác nhau và áp dụng
nhiệt và/hoặc trộn. Trong những năm gần đây,
các phương pháp phi truyền thống mới đang nổi
lên như những lựa chọn thân thiện với môi
trường thay thế cho các phương pháp cổ điển,
chẳng hạn như siêu âm, vi sóng và chiết xuất có
hỗ trợ áp suất, được áp dụng riêng lẻ hoặc cùng
với các dung môi khác nhau, để giảm yêu cầu
về năng lượng và dung môi (Corrales và công
sự 2008; Garcia-Salas và cộng sự 2010; Ignat và
cộng sự 2011; Azmir và cộng sự 2013). Trong
số này, chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
(UAE) đã thu hút được sự quan tâm lớn vì nó
mang lại một số lợi thế như cải thiện năng suất,
giảm thời gian và nhiệt độ chiết xuất, tiêu thụ
dung môi thấp, khả năng tái tạo cao, thao tác
đơn giản hóa và đầu vào năng lượng thấp hơn
(Chemat và Zill-e-Huma Khan 2011; Chemat và
cộng sự 2017; Vardanega và cộng sự 2014).
Một thiết kế thí nghiệm thích hợp là điều cần
thiết để xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu
để thu hồi các chất chống oxy hóa (Granato và
cộng sự 2014). Hai thiết kế thí nghiệm phổ biến
nhất được sử dụng cho các nghiên cứu tối ưu
hóa là thí nghiệm đơn nhân tố và phương pháp
đáp ứng bề mặt (RSM). RSM là một kỹ thuật
thống kê và toán học được sử dụng để thiết kế
các thí nghiệm, bằng cách xây dựng các mô
hình và đánh giá mức độ tương quan của một số
biến độc lập và xác định các điều kiện quá trình
tối ưu (Zhang và Zheng 2009; Karnopp et al.
2017b). Chúng tôi chỉ tìm thấy một số nghiên
cứu có chứa dữ liệu tối ưu hóa về quá trình chiết
xuất siêu âm PC từ nho (Ghafoor và cộng sự
2011; El Hajj và cộng sự 2012; Andjelkovic và
cộng sự 2014; Gonza´lez-Centeno và cộng sự
2014; Tomaz và cộng sự 2015).
Mục đích của nghiên cứu này là tối ưu hóa
quá trình chiết xuất UAE các chất chống oxy
hóa phenolic từ vỏ nho bằng cách sử dụng thiết
kế tổng hợp trung ương kết hợp với RSM. Các
thông số chiết xuất là nồng độ ethanol, thời gian
chiết và nhiệt độ. TPC (mg GAE/g), TPC-280
(mg GAE/g), giá trị thu hồi gốc DPPH (%
Inhib) và ORAC (µmol TE/g DW) là các biến
phụ thuộc (đáp ứng). Các thí nghiệm đơn nhân
tố được sử dụng để cung cấp dữ liệu liên quan
đến các yếu tố chiết xuất có ảnh hưởng đáng kể
đến chất chống oxy hóa phenolic từ vỏ nho.
Tiếp theo, các yếu tố này được RSM phân tích
bằng cách sử dụng thiết kế tổng hợp trung ương
(CCD) để xác định chính xác hơn điều kiện khai
thác tối ưu. CCD lý tưởng cho thử nghiệm tuần
tự và cho phép một lượng thông tin hợp lý để
thử nghiệm sự thiếu phù hợp với sự không liên
quan của một số lượng lớn các điểm thiết kế bất
thường (Somayajula et al. 2012).
Trong nghiên cứu này, nho đen khô nguyên
cành Michele Palieri đã được sử dụng. Nó là
một loại thực phẩm giàu chất chống oxy hóa,
chủ yếu là flavonoid có tiềm năng dinh dưỡng
cao (Milella et al. 2012, 2013).
Nguyên liệu và phương pháp
Hóa chất
Axit clohydric được mua từ J.T. Baker
(Deventer – Holland). Ethanol RPE, axit gallic,
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-axit
tetramethylchroman-2-cacboxylic), 2,2-
diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH), đệm phốt
phát, flfluorescein, 2,20-azobit (2-
methylpropionamidine) dihydrochloride
(AAPH) và thuốc thử Folin – Ciocalteu được
mua từ Sigma-Aldrich (Milan, Ý). Nước cấp
HPLC, axit formic, axetonitril cho HPLC đều
được mua từ VWR International S.r.l. (Milano,
Ý).
Chuẩn bị mẫu
Vỏ của giống nho đen Vitis vinifera L. (còn
gọi là ''Michele Palmieri'') được sử dụng được
trồng trong cánh đồng thử nghiệm của Trung
tâm Nghiên cứu Trồng trọt và Công nghệ học
của Hội đồng Nghiên cứu và Kinh tế Nông
nghiệp (Turi, miền Nam nước Ý). Các mẫu nho
được thu hoạch ở độ chín thương mại và quả
mọng được lấy ngẫu nhiên từ các chùm cây
khác nhau và được đông lạnh ở -20oC cho đến
khi phân tích. Vỏ của hàng trăm quả mọng được
tách thủ công khỏi cùi và hạt, được sấy nhiệt
trong bóng tối, nghiền thành bột bằng máy xay
và sàng bằng rây nylon 1,5 mm. Hàm lượng
chất khô của vỏ nho là 37,5% được xác định
bằng cách sấy vỏ ở nhiệt độ 105oC đến khối
lượng không đổi.
Chiết xuất bằng sóng siêu âm
Quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng
siêu âm được thực hiện trong một thiết bị siêu
âm được điều khiển kỹ thuật số (3300EP
SONICA, Ý) với tần số cố định là 40 kHz và
công suất siêu âm là 200W. Các biến chiết xuất
là nồng độ etanol, nhiệt độ và thời gian. 0,2 g
bột vỏ quả được chiết với 4 ml dung môi với
hàm lượng ethanol cần thiết (chứa 1% axit
clohydric), nhiệt độ và thời gian. Ba mẫu đã
được chuẩn bị cho mỗi lần chạy. Nhiệt độ được
kiểm soát bằng cách sử dụng bộ điều nhiệt được
nhúng vào bể siêu âm. Hỗn dịch chiết được ly
tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau
đó, phần nổi phía trên được lọc qua một bộ lọc
xenlulozơ 0,45µm và ngay lập tức được phân
tích.
Đo TPC và TPC-280
Tổng hàm lượng phenol được xác định bằng
hai phương pháp khác nhau: xét nghiệm Folin –
Ciocalteu (FC) và đọc trực tiếp độ hấp thu ở
bước sóng 280nm (tương ứng với TPC và TPC-
280) (Ribereau-Gayon et al. 2000). Trong cả hai
trường hợp, tổng số phenol được biểu thị bằng
đương lượng axit gallic trên một gam vỏ nho
tính theo trọng lượng khô (mgGAE/gDW) bằng
cách sử dụng đường chuẩn với axit gallic chuẩn.
Phân tích FC sử dụng một giao thức vi mô
(Waterhouse 2009). Một cách ngắn gọn, 1ml
nước, 0,02ml mẫu chiết, 0,2ml thuốc thử Folin
và 0,8ml dung dịch natri cacbonat 10% được
trộn và định mức đến 3ml. Độ hấp thu được đo
ở bước sóng 765nm sau 90 phút.
Để có chỉ số tổng phenol ở bước sóng 280
nm, mẫu được pha loãng bằng dung dịch
ethanol 60% chứa axit clohydric 1% và đo độ
hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
Phương pháp FC được chấp nhận rộng rãi để
nghiên cứu chất chống oxy hóa tự nhiên, nhưng
việc đo lường khả năng làm giảm thuốc thử
Folin của một hợp chất cũng đưa ra một ước
tính về các sức mạnh chống oxy hóa. Độ hấp
thụ đọc được ở 280 nm là do sự hấp thụ đặc
trưng của các vòng benzen của phenol ở 280 nm
và ít bị ảnh hưởng bởi trạng thái oxy hóa của
các phân tử được phân tích (Spigno và De
Faveri 2009).
Đo lường khả năng trung hòa gốc tự do cơ
bản DPPH
Khả năng loại bỏ gốc tự do của chất chiết
xuất từ vỏ nho được xác định bởi một DPPH ổn
định (Von Gadow và các cộng sự 1997). Dung
dịch nghiên cứu gốc tự do được chuẩn bị bằng
cách hòa tan dung dịch gốc của DPPH (4 mg
DPPH trong 100 ml ethanol). Một phần 100 µl
mẫu được pha loãng bằng etanol, được trộn với
3 ml dung dịch nghiên cứu DPPH (A sample).
Dung dịch không có chiết xuất nho được sử
dụng làm mẫu trắng (Ablank ). Sau 60 phút ở
nhiệt độ phòng trong bóng tối, độ hấp thụ được
đo ở bước sóng 517 nm. Khả năng loại bỏ các
gốc DPPH (% Inhib) được tính theo công thức
sau:
% Inhib={( Ablank - Asample) / Ablank} × 100
trong đó A blank là độ hấp thụ của mẫu đối chứng
tại thời điểm ban đầu (t = 0 min) và Asample là độ
hấp thụ của mẫu sau 60 min.
Thử nghiệm ORAC
Quá trình đo huỳnh quang này dựa trên một
phương pháp đã được báo cáo trước đây
(Gillespie và các cộng sự 2007). Tất cả các
thuốc thử được chuẩn bị trong dung dịch đệm
photphat (75 mM, pH 7,0). Trolox (6,25–150
µM) được sử dụng làm chuẩn. Một cách ngắn
gọn, 150 µl fluorescein (0,08 µM) và 25 µl mẫu
đã pha loãng được đặt trong một tấm “đĩa 96
giếng”, ủ trong 15 phút ở 37°C trước khi tiêm
25 µl dung dịch AAPH (150 mM). Sau khi thêm
AAPH, đĩa được lắc và độ phát quang được đo
cứ 2 phút một lần trong 120 phút ở 37°C với
bước sóng phát xạ và kích thích lần lượt là 530
và 485 nm, sử dụng đầu đọc tấm FLUOstar
OPTIMA BMG LABTECH (Offenburg, Đức).
Tất cả các mẫu được phân tích ba lần. Các giá
trị ORAC cuối cùng được tính toán bằng cách
sử dụng sự khác biệt của diện tích dưới đường
cong phân rã huỳnh quang (AUC) giữa mẫu
trắng và mẫu thực được biểu thị bằng
micromole của Trolox tương đương trên gam
trọng lượng khô của dịch chiết da (µmol TE/g
DW).
Phân tích HPLC-DAD
Phân tích các hợp chất phenolic riêng lẻ của
dịch nho chiết được chuẩn bị ở các điều kiện
chiết xuất tối ưu được thực hiện bằng HPLC
1100 (Công nghệ Agilent, Palo Alto, CA) được
trang bị một máy dò mảng diode. Pha tĩnh
ngược được sử dụng là Zorbax SB C18 5 µm
(250 x 4,6 mm i.d., Agilent) với cột bảo vệ
Zorbax C18 5 µm (35 x 0,5 i.d. mm, Agilent).
Hệ thống gradient sau đây sử dụng acetonitril
(dung môi A) và nước/axit formic (90:10, v/v)
(dung môi B): 0–2 phút, 5% A-95% B; 10 phút,
13% A-87% B; 20 phút, 15% A-85% B; 30
phút, 22% A-78% B; 50 phút 22% A-78% B; 55
phút 95% A-5% B; 60 phút 5% A-95% B, thời
gian dừng là 65 phút. Dòng được duy trì ở 0,7
mL/phút và cột nhiệt độ ở 25°C; mẫu bơm vào
là 3µL. Dãy diode phát hiện trong khoảng 250
đến 650 nm, và độ hấp thụ được ghi lại ở 520,
360 và 320 nm. Định lượng được thực hiện
bằng cách sử dụng malvidin-3-O-glcucoside cho
anthocyanins, quercetin cho flavonols và
resveratrol, axit caffeic cho dẫn xuất axit
hydroxycinnamic tạo ra axit phenolic. Kết quả
được biểu thị bằng microgam trên gam trọng
lượng khô của da (µg/g DW). Kết quả được thể
hiện dưới dạng giá trị trung bình của ba lần
phân tích với độ lệch chuẩn (n = 3).
Thiết kế thử nghiệm RSM
RSM được sử dụng để xác định sự kết hợp
tối ưu của các biến số để chiết xuất chất chống
oxy hóa PC từ vỏ nho. Một CCD ba nhân tố (X1,
X2, X3) và ba cấp độ (- 1, 0, +1) CCD của hai
mươi lần chạy thử nghiệm được sử dụng bao
gồm: tám điểm giai thừa, sáu điểm trục (hai
điểm trục trên trục của mỗi biến thiết kế ở
khoảng cách xa 1,68 từ trung tâm thiết kế), và
sáu điểm trung tâm. Các biến độc lập là nồng độ
etanol (X1), thời gian chiết (X2) và nhiệt độ chiết
(X3). Điểm trung tâm và phạm vi cho một trong
số ba biến độc lập đã được kiểm tra bằng cách
sử dụng các thí nghiệm đơn nhân tố sơ bộ. Bảng
1 liệt kê các cấp độ thực và mã hóa của các biến
độc lập được sử dụng. Các giá trị trong mỗi thử
nghiệm được xác định từ ba lần lặp lại. Các biến
phụ thuộc (đáp ứng) TPC (mg GAE/g DW),
TPC-280 (mg GAE/g DW), giá trị quét gốc
DPPH (% Inhib) và ORAC (µmol Trolox/g
DW) lần lượt là Y1 , Y2, Y3 và Y4. Các đáp ứng
được đánh giá bằng một hồi quy tuyến tính
nhiều biến để phù hợp với mô hình đa thức bậc
hai sau:
k k k
2
Y = β0 + ∑ β j X j + ∑ β jj X + ∑ ∑ β jj X i X j
j=1 j=1
j
i< j j=2
trong đó Y đại diện cho hàm đáp ứng; β 0 là hệ
số chặn và β j, β jj và β ij tương ứng là hệ số hồi
quy của các số hạng tuyến tính, bậc hai và điều
kiện tương tác; theo đó, Xj, X 2j , và XiXj lần lượt
đại diện cho các biến phụ thuộc đã được mã
hóa; k là số biến.
Bảng 1 Dữ liệu thực nghiệm và dữ liệu thí nghiệm tổng hợp trung tâm năm cấp, ba biến độc lập cho các biến đáp ứng để tối ưu hóa chiết xuất từ vỏ nho
Run Các biến xử lý-giá trị thực và (được mã hóa) Responsesa
X1EtOH (%) X2 time (min) X3 temperature (°C) TPC (mg GAE/g) TPC-280 (mg GAE/g) DPPH (%) ORAC
(lmolTrolox/g)
1 40 (- 1) 60 (- 1) 60 (1) 57.74efg ± 0.31 51.23de ± 1.14 56.24ef ± 0.67 563.43defghi ± 6.50
2 40 (- 1) 60 (- 1) 40 (- 1) 53.74g ± 1.08 49.18e ± 0.34 52.37h ± 0.30 493.47ijk ± 34.50
3 40 (- 1) 100 (1) 60 (1) 62.51bcd ± 0.46 53.13bcd ± 0.56 59.23cd ± 0.23 610.53bcde ± 39.50
4 40 (- 1) 100 (1) 40 (- 1) 56.84efg ± 0.69 51.12de ± 1.69 55.13fg ± 0.67 519.03ghijk ± 33.00
5 80 (1) 60 (- 1) 40 (- 1) 42.50h ± 1.16 41.90fg ± 0.64 49.46i ± 1.32 457.97jkl ± 23.00
6 80 (1) 60 (- 1) 60 (1) 54.37g ± 0.72 49.56e ± 0.43 54.20g ± 0.42 580.37cdefgh ± 33.50
7 80 (1) 100 (1) 60 (1) 58.47def ± 0.44 51.96cde ± 0.33 57.95de ± 0.05 557.93defghi ± 32.66
8 80 (1) 100 (1) 40 (- 1) 44.35h ± 1.91 44.62f ± 0.42 52.31h ± 0.09 510.50hijk ± 11.50
9 93 (1.68) 80 (0) 50 (0) 34.18i ± 0.61 35.87h ± 0.38 45.22j ± 0.23 448.07kl ± 3.00
10 26 (- 1.68) 80 (0) 50 (0) 43.55h ± 1.88 39.50g ± 1.56 53.70gh ± 0.30 418.53l ± 9.50
11 60 (0) 113(1.68) 50 (0) 64.78b ± 0.82 56.31ab ± 0.78 60.66bc ± 0.35 579.63cdefgh ± 6.50
12 60 (0) 46 (- 1.68) 50 (0) 59.51cde ± 0.87 52.30cde ± 1.23 54.35g ± 0.66 529.63fghij ± 36.50
13 60 (0) 80 (0) 66 (1.68) 71.12a ± 1.76 57.70a ± 1.17 63.74a ± 0.75 687.17a ± 5.01
14 60 (0) 80 (0) 33 (- 1.68) 54.69fg ± 1.07 50.10de ± 2.04 56.54ef ± 0.54 549.50efghi ± 32.50
15 60 (0) 80 (0) 50 (0) 65.50b ± 2.94 56.41ab ± 1.94 60.00bc ± 0.51 568.97cdefgh ± 45.22
16 60 (0) 80 (0) 50 (0) 64.03b ± 1.70 57.62a ± 1.77 59.35cd ± 0.35 630.00abcd ± 9.05
17 60 (0) 80 (0) 50 (0) 64.66b ± 1.61 57.28a ± 0.05 61.10b ± 0.90 660.90ab ± 0.17
18 60 (0) 80 (0) 50 (0) 61.95bcd ± 0.41 55.65ab ± 0.41 58.95cd ± 0.05 642.17abc ± 0.29
19 60 (0) 80 (0) 50 (0) 64.54b ± 1.21 55.19abc ± 0.41 59.66bcd ± 0.66 600.90bcdef ± 18.00
20 60 (0) 80 (0) 50 (0) 62.64bc 1.32 56.61a ± 0.33 60.42bc ± 0.42
p value (ANOVA) < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001
a
Các phản hồi là giá trị trung bình ± SD (n = 3). Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện các kết quả khác nhau về mặt thống kê ở p 0.151
p value (homoscedasticity) 0.636 0.196 0.191 = 0,05 bằng cách sử
dụng phép thử Tukey. Tính đồng nhất đã được kiểm tra bằng phép thử của Levene
Phân Tích Thống Kê
Dữ liệu được phân tích bởi phần mềm Centurion STATGRAPHICS (Stat-Ease, Minneanopolis, MN, Hoa Kỳ). Kết quả được biểu thị bằng
giá trị ± SD (n = 3 đối với dữ liệu công cụ). Theo những gì được đề xuất bởi Granato và cộng sự (2014), tính tương đồng của dữ liệu đã
được xác minh bằng thử nghiệm của Levene và sự khác biệt đáng kể giữa ba lần thử nghiệm được đánh giá bằng kiểm định ANOVA một
chiều. Bài phân tích hoc của Tukey được sử dụng để so sánh các mức ý nghĩa (p < 0,05). CCD, RSM và đồ thị tương đối được thực hiện bởi
XLSTAT.

Thảo luận và kết quả

Thử nghiệm đơn yếu tố

Đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng các thử nghiệm đơn yếu tố để xác định phạm vi thử nghiệm thích hợp của ba biến (nồng độ etanol, thời gian
chiết xuất và nhiệt độ) cho thiết kế RSM tiếp theo.
Về ảnh hưởng của nồng độ etanol, kết quả được thể hiện trong Hình 1a. Một hỗn hợp với các tỷ lệ phần trăm khác nhau nồng độ etanol,
nằm trong khoảng từ 0 đến 100%, được thử nghiệm với thời gian chiết 20 phút và nhiệt độ chiết 40 oC. Mặc dù trong các nghiên cứu trước
đây metanol hoặc axeton được cho là hiệu quả hơn trong chiết xuất phenol từ nguyên liệu thực vật (Tabaraki và Nateghi 2011), việc con
người sử dụng ngày càng nhiều những hợp chất này khiến việc chiết xuất bắt buộc phải dựa trên dung môi không độc hại. Một giải pháp
thường được sử dụng để chiết xuất PC từ vỏ nho là etanol/nước/axit clohydric. Hơn nữa, độ pH có tính axit làm tăng sản lượng tổng
polyphenol được chiết xuất (Bordiga 2016; Galanakis 2017). Bằng cách thay đổi tỷ lệ nước/etanol, dung môi phân cực, từ đó, khả năng hòa
tan của các PC khác nhau có thể khác nhau (d’Alessandro và cộng sự 2012; Sun và cộng sự 2015). Thử nghiệm đơn yếu tố này cho thấy
rằng 60% etanol là tối ưu để trích xuất PC mà không làm suy giảm lượng chất chống oxy hóa của chúng, do đó nó được chọn là mức mã hóa
0 của tỷ lệ phần trăm etanol cho RSM.
Về ảnh hưởng của thời gian trích xuất, nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi từ 20 đến 120 phút, với 60% etanol và nhiệt độ chiết
xuất 40oC. Như thể hiện trong Hình 1b, thời gian chiết xuất có ảnh hưởng mạnh mẽ đến cả TPC và TPC-280, trong khi ảnh hưởng đến chất
chống oxy hóa ở mức độ thấp hơn. Tất cả các đáp ứng đã được cải thiện với thời gian dài hơn thời gian chiết xuất, đạt tối đa ở 100 phút và
sau đó giảm dần. UAE cần thời gian để phá vỡ thành tế bào và sự hòa tan và khuếch tán vào dung môi của các hợp chất chiết được. Có thể,
sau khi đạt đến thời gian trích xuất tối ưu cho PC, các phản ứng khử và phân huỷ diễn ra do đó làm giảm số lượng các hợp chất có trong
dung dịch và khả năng chống oxy hóa của chúng (Zhou và cộng sự 2013). Kéo dài thời gian trích xuất có thể khiến cho hầu hết PC đã được
trích xuất bị phân hủy. Từ thử nghiệm đơn nhân tố này, thời gian chiết xuất là 80 phút được chọn làm mức mã hóa bằng 0 của thời gian trích
xuất cho RSM, thậm chí tính cả thời gian trích xuất hiệu quả và chi phí năng lượng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất được cho thấy trong Hình 1c. Nhiệt độ chiết từ 30 đến 80oC, với 40% etanol, thời gian chiết 80 phút đã
được nghiên cứu. Như được hiển thị trong Hình 1c, nhiệt độ tăng lên 50 oC tương ứng với thời gian chiết xuất PC tăng (TP và TP-280) và
mức độ chiết xuất chất chống oxy hóa tăng tối đa (DPPH và ORAC) và sau đó là giảm cho nhiệt độ cao hơn. Người ta biết rằng sự gia tăng
của nhiệt độ thuận lợi cho các quá trình chiết xuất vì một số lý do: Nhiệt độ cao hơn làm tăng khả năng hòa tan và hệ số khuếch tán của chất
tan, giảm độ nhớt và mật độ của dung môi, cho phép dung môi thâm nhập dễ dàng hơn vào bên trong các phần của chất rắn do đó cải thiện
tốc độ chiết xuất, tăng tính thấm của màng tế bào, v.v., dẫn đến trong quá trình truyền PC nhanh hơn và hiệu quả hơn. Dù sao, đối với một
nhiệt độ trên 50–60oC PC được trích xuất sẽ bị tổn thất không ổn định nhiệt, bị suy thoái (Galanakis 2017). Thời gian chiết ở 50 oC được
chọn là mức nhiệt độ chiết xuất được mã hóa bằng 0 cho RSM.

Tối Ưu Hóa Bằng RSM

CCD được sử dụng để đạt được thông tin tối đa về xử lý từ một số tối thiểu thử nghiệm có thể có. Dữ liệu thử nghiệm của TPC, TPC-280 và
chất chống oxy hóa hoạt động thu được từ thử nghiệm 20 lần chạy được hiển thị trong Bảng 1. Độ thu hồi tối đa của TPC (71,12 ± 1,76 mg
GAE/g), TPC-280 (57,70 ± 1,17 mg GAE/g),% Ức chế DDPH (63,74 ± 0,75) và ORAC (687,17 ± 5,01 µmol Trolox/g) đã được ghi lại trong
Run 13. Dự đoán giá trị của tất cả các đáp ứng thu được trong 20 lần chạy cũng như các đồ thị chẩn đoán hiển thị các giá trị thử nghiệm so
với các giá trị được dự đoán và các phần dư theo các giá trị dự đoán được hiển thị trong File S1. Các mô hình đa thức bậc bốn cho bốn biến
đáp ứng được chỉ định dựa trên kết quả trong Bảng 1, để thực hiện phân tích hồi quy đa biến. Tất cả các phương trình mô hình được báo cáo
trong Bảng 2, chỉ chứa các thuật ngữ thống kê ý nghĩa (p < 0,05). Mức độ phù hợp đã được thể hiện bằng R2 (hệ số xác định) và dấu hiệu
thống kê của nó đã được xác nhận bằng F-test. R2 cung cấp một sự chắc chắn về khả năng dự đoán các kết quả trong tương lai bằng mô hình
tốt như thế nào. Các mô hình tính toán được sử dụng để giải thích 97,94%, 96,93%, 95,88% và 91,51% kết quả đối với TPC, TPC-280,
DPPH và ORAC tương ứng. Một xác nhận thêm về tính hợp lệ của mô hình là p.
.
Hình 1. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol a (thời gian chiết 20
phút, nhiệt độ chiết 40°C), thời gian chiết b (60% ethanol,
nhiệt độ chiết 40°C), nhiệt độ chiết c (60% ethanol, thời gian
chiết 80 phút)

các giá trị sai số cho mỗi mô hình phương trình, tất cả đều
không đáng kể (p > 0,05), cho thấy rằng các mô hình có thể
phù hợp dữ liệu thực nghiệm. Do đó, bốn phương trình đa thức
có thể dự đoán tổng số polyphenol và giá trị chống oxy hóa của
chất chiết xuất từ nho, cho thấy rằng các biến độc lập nằm
trong phạm vi được sử dụng trong các thí nghiệm này.

Hệ số hồi quy và phân tích bề mặt phản hồi

Hệ số hồi quy của các mô hình cho TPC, TPC-280, DPPH và
ORAC thu được bằng nhiều hồi quy tuyến tính được thể hiện
trong Bảng 2. Các biến ở dạng mã hóa của chúng cho thấy khả
năng diễn giải trực tiếp của sự biến đổi trong các hiệu ứng
tuyến tính, bậc hai và tương tác của biến độc lập biến. Đối với
tất cả các phương trình, các số hạng tuyến tính (X1, X2 và X3)
là các yếu tố quan trọng, xác nhận rằng việc tăng nồng độ
etanol, thời gian chiết và nhiệt độ đã cải thiện khả năng thu hồi
chất chống oxy hóa. Tuy nhiên, hiệu ứng bậc hai âm của X1 và
X2 đã được quan sát thấy trong cả bốn mô hình, cho thấy rằng
các biến phản ứng đạt đỉnh ở một nồng độ và thời gian etanol
nhất định, sau đó bắt đầu giảm khi tăng thêm etanol và thời
gian. Điều này chỉ ra rằng nồng độ etanol cao và thời gian chiết
xuất dài không có lợi để cải thiện hơn nữa quá trình chiết xuất,
có thể là do quá trình thu hồi chiết xuất giảm tốc sau khi đạt
đến trạng thái cân bằng, như được tìm thấy trong các công
trình khác (Zhou và cộng sự 2013). Các tác động của X3 là
tiêu cực và bậc hai chỉ đối với TPC-280, cho thấy rằng biến
phản ứng này đạt cực đại và sau đó giảm xuống cho thấy sự
suy thoái của chất chống oxy hóa nhạy cảm với nhiệt ở nhiệt
độ vượt quá một giới hạn trên nhất định. Điều này có thể liên
quan đến thực tế là nhiệt độ cao không phù hợp với tất cả các
PC, thực sự có thể có sự phân hủy nhiệt của các hợp chất hấp
thụ ở 280 nm với nhiệt độ cao. Hiệu ứng chéo giữa nhiệt độ x
nồng độ etanol (X1 x X3) chỉ có ý nghĩa đối với tổng số
polyphenol được trích xuất (TP và TP-280). Tương tác tích cực
của tỷ lệ phần trăm etanol và nhiệt độ cho thấy rằng nồng độ và nhiệt độ etanol cao hơn có thể chiết
xuất được một tỷ lệ cao hơn các hợp chất polyphenol ưa béo và bền nhiệt hơn, ít nhất là đối với
phạm vi nhiệt độ etanol được khảo sát ở đây.
Để hình dung mối quan hệ giữa mức độ phản ứng và thực nghiệm của các biến độc lập, các
biểu đồ bề mặt ba chiều được xây dựng theo
Hình 2 Biểu đồ bề mặt đáp ứng bị ảnh hưởng bởi nồng độ etanol, nhiệt độ và thời gian chiết xuất ở
UAE. nồng độ và thời gian Etanol a (nhiệt độ 50°C); b nồng độ và nhiệt độ etanol (thời gian 80
phút); c thời gian và nhiệt độ (etanol 60%).
Bảng 3. Dự đoán và giá trị thực nghiệm của các biến trong điều kiện tối ưu
Phản ứng Điều kiện dự đoán tối ưu
khai thác và (sửa đổi)
EtOH (%) Thời gian (phút)
TPC (mg 59.5 (60) 113.6 (113)
GAE/g DW)
TPC-280 (mg 61.1 (61) 99.4 (99)
GAE/g DW)
DPPH (%) 57.1 (57) 98.5 (98)
ORAC (µmol 60.2 (60) 82.4 (82)
Trolox/g DW)
a
Thực nghiệm là ± SD (n=3)
phương trình mô hình đa thức bậc hai trong
Bảng 2. Các ô bề mặt tạo điều kiện thuận lợi
cho việc hình dung các yếu tố có ý nghĩa thống
kê thu được từ phân tích thống kê. Các biểu đồ
được tạo ra bằng cách vẽ biểu đồ phản hồi bằng
cách sử dụng trục z so với hai biến độc lập trong
khi vẫn giữ biến độc lập ở mức tâm.
Bốn biểu đồ bề mặt phản ứng trong Hình 2a
cho thấy ảnh hưởng của nồng độ etanol và thời
gian chiết ở 50oC (mức nhiệt độ chiết được mã
hóa bằng không). Trong tất cả các ô đều có sự
gia tăng các phản ứng cùng với sự gia tăng hàm
lượng etanol và thời gian chiết. Dù sao, khi đạt
đến giá trị đỉnh ở khoảng 60% và 70 phút, sự
giảm đối với tất cả các đầu ra chiết xuất sẽ xảy
ra. Lượng etanol tăng dần có thể cải thiện việc
chiết xuất (tức là quá trình hòa tan) các hợp chất
không phân cực, nhưng khi etanol vượt qua giá
trị tới hạn thì it polyphenol ưa nước hơn được
chiết xuất, dẫn đến tổng số polyphenol ít hơn.
Liên quan đến thời gian chiết xuất sau khi đạt
đến giá trị tối ưu khoảng 70 phút, việc tăng
thêm thời gian là phủ định về cả tổng số
polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa. Điều
này có thể là do sự phân hủy của một phần các
hợp chất polyphenol đã được
chiết xuất.
Các bề mặt trong Hình 2b đại diện cho việc
chiết xuất khi nồng độ etanol và thay đổi nhiệt
Giá trị lớn nhất
T (oC) Dự đoán Thực nghiệma
66.8 (66) 72.8 73.5 ± 0.8
66.1 (66) 58.81 57.7 ± 0.6
66.8 (66) 64.39 63.7 ± 0.9
66.8 (66) 686.93 671.1 ± 15.9
độ trong 80 phút chiết xuất (mức thời gian chiết
xuất được mã hóa bằng không). Các biến phản
hồi cho thấy cũng tương tự như Hình 2a, tức là
sau khi đạt đến mức tối đa, sẽ có sự giảm xuống
của các biến phản hồi, thực sự cho tỷ lệ phần
trăm cao hơn etanol và nhiệt độ tất cả các đầu ra
giảm. Kết quả này chủ yếu có thể liên quan đến
nhiệt độ, vì sự gia tăng của nó có thể dẫn đến sự
phân hủy các hợp chất tioxidant không ổn định
về nhiệt, thậm chí được chiết xuất bằng dung
môi, bị mất. Ở cấp độ này, chúng ta có thể quan
sát thấy sự cạnh tranh giữa hai hiện tượng: chiết
xuất và oxy hóa.
Như được báo cáo trong Hình 2c, khi phần
trăm etanol là cố định ở 60% (mức phần trăm
etanol được mã hóa bằng không), tất cả các biến
phản ứng tăng theo nhiệt độ và thời gian trích
xuất trong phạm vi được điều tra, cho thấy cách
nồng độ etanol được sử dụng trong dung môi là
điểm mấu chốt trong quy trình chiết xuất.
Thử nghiệm xác nhận các mô hình
Để đánh giá và xác nhận tính hợp lệ của mô
hình, xác nhận thử nghiệm đã được thực hiện
bằng cách sử dụng điều kiện do phần mềm tính
toán. Bảng 3 cho thấy giá trị dự đoán và thử
nghiệm của các câu trả lời tại điều kiện tối ưu và
thực nghiệm (sửa đổi).
Các giá trị thực nghiệm rất gần với giá trị dự
đoán. Điều này cho thấy rằng sự tối ưu hóa đạt
được trong hiện tại nghiên cứu đáng tin cậy, mô
hình RSM mô tả thỏa đáng chiết xuất với sự kết
hợp tốt.
Đối với bốn phản hồi (TPC, TPC-280,
DPPH, ORAC), các điều kiện tối ưu rất giống
nhau đối với nồng độ etanol (60%) và nhiệt độ
(66oC). Trên ngược lại, sự khác biệt về thời gian
giữa TPC và các phản ứng khác có thể được cho
là dễ chảy mỡ hơn chiết xuất polyphenol, với
hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn làm tăng số
lượng các hợp chất phản ứng với FC, nhưng
không ảnh hưởng mạnh đến các giá trị chống
oxy hóa. Ngoài ra, chúng tôi thực hiện sắc ký
HPLC-DAD phân tích các chất chiết được chuẩn
bị trong quá trình chiết xuất tối ưu điều kiện cho
TPC (60% EtOH, 113 phút, 66oC), TPC-280
(61% EtOH, 99 phút, 66oC), DPPH (57% EtOH,
98 phút, 66oC) và ORAC (60% EtOH, 82 phút,
66oC). Cấu hình polyphe nolic được báo cáo
trong Hình 3 và Bảng S1.
Phần kết luận
Ở đây, chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu
âm đã được sử dụng để tối ưu hóa việc khai thác
các hợp chất phenolic và chất chống oxy hóa từ
chiết xuất vỏ nho.
Tất cả bốn mô hình hồi quy đều có ý nghĩa,
và sai số là không đáng kể. Điều kiện tối ưu là
được tìm thấy là: đối với TPC ở 66,8 oC sử dụng
59,5% etanol và 113,6 phút; đối với TPC-280 ở
66,1oC sử dụng 61,1% etanol và 99,4 phút; cho
giá trị quét tận gốc DPPH tại 66,8oC sử dụng
57,1% etanol và 99,5 phút và cho ORAC giá trị
ở 66,8oC sử dụng 60,2% etanol và 82,4 phút.
Các kết quả này nhằm vào các ngành công
nghiệp thực phẩm, dinh dưỡng, dược phẩm và
hóa chất để tạo điều kiện thu hồi nho các hợp
chất hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi
làm sản phẩm thực phẩm chất bảo quản, chất bổ
sung và chất dinh dưỡng. Để có được một chiết
xuất giàu chất chống oxy hóa từ nho, rất cần
phải xem xét nhiều yếu tố như sự đa dạng, chỉ số
trưởng thành, nguồn gốc địa lý và loại đất, tiếp
xúc với ánh sáng mặt trời, các quy trình nông
học và loại hệ thống canh tác (Granato et al.
2016). Chúng tôi đã sử dụng giống M. Palieri
giàu polyphenolic tự nhiên và chưa bao giờ thử
nghiệm trước đây. Trong tương lai, chúng tôi sẽ
điều tra các giống nho khác để củng cố kết quả
của nghiên cứu này
Hình 3 Sắc ký đồ HPLC-DAD của dịch chiết nho đen (còn gọi là ‘‘Michele Palieri’’) được chuẩn bị
ở điều kiện chiết xuất tối ưu cho TPC (60% EtOH, 113 phút, 66 oC), TPC-280 (61% EtOH, 99 phút,
66oC), DPPH (57% EtOH, 98 phút, 66oC) và ORAC (60% EtOH, 82 phút, 66oC). Đối với mỗi dịch
chiết, sắc ký đồ được ghi lại ở 520 nm (a), 360 nm (b) và 320 nm (c). Các đỉnh tương ứng với: a 1-
delphinidin-3-O-glucoside; 2- cyanidin-3-O-glucoside; 3-petunidin-3-O-glucoside; 4-peonidin-3-O-
glucoside; 5- malvidin- 3-O-glucozit; 6- malvidin-3-O-acetylglucoside; 7-peonidin-3-O
coumaroylglucoside; 8-malvidin-3-O-coumaroylglucoside; b 1-rutin; 2- quercetin-3-O-
glucopiranoside; 3- kaempferol-3-O-glu coside; 4-quercetin; c 1-axit caffeic; 2-axit p-coumaric; 3-
resveratrol.

Lời cảm ơn Phát minh được cung cấp bởi Ministero Italiano dell’Universita`e della Ricerca (Grant
No. PON02_00186_2937475).

Tuân thủ chuẩn mực đạo đức

Xung đột lợi ích Không có khả năng xung đột lợi ích nào được báo cáo bởi tác giả.

Nguồn tham khảo

Ghi chú của nhà xuất bản Springer Nature vẫn giữ thái độ trung lập đối với các tuyên bố về quyền
tài phán trong các bản đồ đã xuất bản và các tổ chức liên kết.