BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Ngành học : Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn : Ths Trương Phước Thiên Hoàng
Ths Võ Trần Quốc Thắng
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tấn Tài - 20126347
Lê Tuyết Nhi - 20126325
Lê Xuân Lan - 20126419
Nguyễn Trần Danh – 20126214
Trần Quốc Cường – 20126199
Niên khóa : 2020 – 2024

TP . Thủ Đức, tháng 8 năm 2022

1
MỤC LỤC
BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. COLI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC ..................................................5
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 5
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 6
3.1 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – thực
hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6848:2007 (ISO 4832:2007) ........................ 6
3.2 Quy trình định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – thực hiện
theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) ........................ 7
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 8
BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E. coli BẰNG PHƯƠNG
PHÁP MPN ...............................................................................................9
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 9
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 9
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 13
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 16
BÀI 3: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA ..................................................17
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 22
BÀI 4-5: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG
NẤM MEN-NẤM MỐC ........................................................................22
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 25

2
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BGBL: Brilliant Green Bile Broth Lactose

BWP: Buffered Pepton Water
DRBC: Dichloan Rose bengal Chloramphenicol Agar
EC: E.coli medium
EMB: Eosin Methylene Blue Agar
HE: Hektoen Entric Agar
KIA: Kliger Iron Agar
MPN: Most Probable Number
MR-VP: Glucose Phosphate
PCA: Plate Agar
RV: Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton
SPM: Saline Peptone Water
TBX: Thạch tryton-mật-glucuronid
TSA: Tryptone Soya Agar
VRBL: Thạch lactoza mật độ trung tính tím tinh thể
XLD: Xylone Lysine Desoxycholate

3
DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1. Đĩa petri ở nồng độ ghi nhận xuất hiện các khuẩn lạc điển hình đỏ tía
Hình 2.1. Quy trình thực hiện kiểm tra mật độ vi sinh theo phương pháp MPN
Hình 2.2. Cấy mẫu vào canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC sau 48 giờ. Vi
sinh vật tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau
Hình 2.3. Cấy mẫu vào canh BGBL, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC sau 48 giờ.
Vi sinh vật tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau
Hình 2.4. Cấy mẫu vào canh EC, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 44,5oC sau 24 giờ. Vi
sinh vật tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau
Hình 2.5. Khuẩn lạc trên môi trường EMB
Hình 3.1. 10 g mẫu gan heo
Hình 3.2. Mẫu trong môi trường BPW
Hình 3.3. 0,1 ml dịch tăng sinh trong RVS
Hình 3.4. Khuẩn lạc trong môi trường XLD
Hình 3.5. Khuẩn lạc trong môi trường HE
Hình 4.1. 10g mẫu cá khô
Hình 4.2. Khuẩn lạc ở đĩa thứ 1
Hình 4.3. Khuẩn lạc ở đĩa thứ 2
Hình 4.4. Ở độ pha loãng 10-1.
Hình 4.5. Ở độ pha loãng 10-
Hình 4.6. Ở độ pha loãng 10-3.

4
BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. COLI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nước ta việc đi chợ hầu như diễn ra hằng ngày vừa là truyền thống vừa là
để phục vụ nhu cầu của người dân, vậy đặt ra vấn đề là các thực phẩm ở chợ có chắc
chắn phù hợp về an toàn thực phẩm. Hằng năm có hàng trăm vụ việc được đưa lên
báo đài về mất vệ sinh an toàn thực phẩm chứng tỏ rằng các thực phẩm ở chợ hầu
như đều nhiễm các vi sinh gây bệnh cho con người. Ở đây chúng tôi đề cập đến món ăn
phổ biến đến mọi người hiện tại đó là trà sữa, hầu như mọi người đều sử dụng nhưng chưa
chắc nó đã an toàn thực phẩm cho chúng ta sử dụng. Do đó cần phải đánh giá mức độ vệ
sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho mọi người, bài báo
cáo này sẽ “ Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc” để
đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm với mẫu được kiểm tra là trà sữa trân
châu ở chợ.
Mục tiêu đề tài

Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn

lạc để đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm của mẫu trà sữa trân
châu.
Nội dung thực hiện
Phân tích và đánh giá mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc dựa
trên một số chỉ tiêu vi sinh: Coliforms và E.coli
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Khái quát về đặc điểm của Coliforms và E.coli

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu
khí

5
 kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37℃ trong
24 - 48 giờ. Coliforms được xem là sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của
chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để
chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms
gồm 4 giống là: E.coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.
Escherichia coli hay viết tắt là E.coli là trực khuẩn gram âm, kí sinh
trong đường ruột, ngoài ra còn có mặt ở thực phẩm, nguồn nước,... Chúng được
xem là vi sinh vật chỉ thị trong sinh học hiện đại.
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định mật độ tế bào còn sống hiện diện
trong mẫu, tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10
liên tiếp nhau. Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa.
Dụng cụ và Quy trình Phân tích
Mẫu là trà sữa chân châu được mua ở khu 8 giang Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, Micropipette, que cấy trang vi sinh thủy tinh tất cả dụng
cụ phải được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121℃ trong vòng 15 phút
Các môi trường nuôi cấy khuẩn lạc: môi trường đối với Colifroms là thạch lactoza mật
đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) đối với môi trường này không được hấp môi trường
trước khi cấy, môi trường đối với E. coli là thạch tryton-mật-glucuronid (TBX).
3.1 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – thực
hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6848:2007 (ISO 4832:2007)
- Bước 1: chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng 1 ml mẫu trà sữa 90 ml nước cất hoặc
nước muối sinh lí hấp khử trùng với nồng độ là 10−1 sau đó pha loãng ở nồng độ 10−2,
10−3 ...

- Bước 2: hút 1ml dung dịch mẫu ở 3 nồng độ trên vào đĩa petri với mỗi nồng độ lặp
lại 2 lần. Sau đó đổ môi trường VRBL (44 – 47℃) khoảng 15ml. Trộn đều môi
trường với dịch mẫu, để hỗn hợp đông lại đem ủ ở 30℃ hoặc 37℃ trong vòng 24h.

6
 - Bước 3: chọn những đĩa có khuẩn lạc từ 10 – 150 và những khuẩn lạc điển hình
có màu đỏ tía có đường kính khoảng 0,5 mm trở lên (đôi khi có vùng mật tủa hơi
đỏ bao quanh) đó là các Coliform → Xác định được mật số Coliform. Sau đó xác
định mật độ vi sinh vật bằng công thức tính.
Phạm vi áp dụng: mẫu là thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, các mấu trong môi trường
khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm bằng kĩ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường
đặc ủ ở 30℃ hoặc 37℃ đối với sữa thì nhiệt độ là 30℃.
3.2 Quy trình định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – thực
hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)
- Bước 1: chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng 1 ml mẫu trà sữa 90 ml nước cất hoặc
nước muối sinh lí hấp khử trùng với nồng độ là 10−1 sau đó pha loãng ở nồng độ 10−2,
10−3 ...
- Bước 2: hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở 3 nồng độ trên vào đĩa petri với mỗi nồng độ
lặp lại 2 lần. Cấy trải đều đĩa và khô, lật ngược đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 44℃ từ 18
– 24 giờ (không ủ quá 24 giờ)
- Bước 3: chọn những đĩa petri có số lượng khuẩn lạc điển hình (có màu xanh) nhỏ
hơn 150 và tổng số khuẩn lạc không quá 300 (gồm điển hình và không điển hình)
Phạm vi áp dụng: tiêu chuẩn này được quy định phương pháp dương tính β-
glucuronidaza trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này sử dụng kỹ
thuật đếm khuẩn lạc ở 44 ℃ trên môi trường đặc có chứa thành phần tạo sắc để phát
hiện enzym β-glucuronidaza.
Công thức tính mật độ vi sinh vật
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng
25 – 250 đối với Coliforms trong khoảng 10 – 150 để tính kết quả. Mật độ tổng vi
khuẩn Coliforms và E. coli được tính như sau:
𝑁
𝐴=
𝑛1 × 𝑉 × 𝑓1 +. . +𝑛𝑖 + 𝑉 + 𝑓𝑖
Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu (CFU/g hoặc
CFU/ml)
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
𝑛𝑖 : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

7
 V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
𝑓𝑖 : độ pha loãng thứ i
4. Kết quả và biện luận kết quả
Mật độ vi sinh vật Coliform

Đĩa 1 Đĩa 2
shape a
Hình 1.1. Đĩa petri ở nồng độ 10−1 ghi nhận xuất hiện các khuẩn
lạc điển hình đỏ tía

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả đêm khuẩn lạc ở đĩa 1 là 85 khuẩn lạc và đĩa 2 là 8 khuẩn lạc vậy chỉ chấp
nhận đĩa 1 áp dụng công thức tổng quát tính mật độ vi sinh vật ta có:

𝑁 85
𝐴= = = 8,5 × 102 (CFU/ml)
𝑛1 ×𝑉×𝑓1 +..+𝑛𝑖 +𝑉+𝑓𝑖 1×1×10−1

Biện luận kết quả thí nghiệm được thực hiện gồm 6 đĩa petri với 3 nồng độ khác nhau
nhưng chỉ ghi nhận thấy 2 đĩa ở nồng độ 10−1 xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng Coliform
chứng tỏ rằng thao tác cấy đổ sai, trộn mẫu không đều cũng như chưa có kinh nghiệm
trong việc cấy mẫu hoặc do các môi trường còn quá nóng, thời gian ủ chưa đảm bảo
cho vi sinh vật phát triển khuẩn lạc, hoặc có thể do mẫu trà sữa sạch ít có các vi sinh
vật xuất hiện. Giải pháp thực hiện lại thí nghiệm thực hiện kĩ việc đồng nhất mẫu và
pha môi trường ủ đúng nhiệt độ, cải thiện tay nghề của người thực hiện.
Mật độ
Mật độ E. coli không thể tính được vì các kết quả của đĩa petri không xuất hiện các

8
khuẩn lạc đặc trưng màu xanh ở cả 3 nồng độ thí nghiệm. Biện luận có thể là do quá
trình cấy không đồng nhất mẫu pha loãng, hấp môi trường còn quá nóng và do mẫu là
trà sữa khi cấy xong trang không đều ủ quá 24 giờ khiến E. coli không thể phát triển
khuẩn lạc cần xem lại các yếu tố đó để thực hiện lại thí nghiệm cũng như kiểm tra lại
quy trình sai ở đâu khắc phục ngay.

BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E. coli BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MPN
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ ngày 8 – 12/8/2022, tại toà nhà A1 Khoa Khoa
Học Sinh Học.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Phương pháp Most Probable Number (MPN), đây là phương pháp định lượng
dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng
khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100 ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0,1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các
độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml
tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1 ml, 0,1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100 ml
tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1 ml, 0,1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha
loãng khi 1 ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân
tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp
theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi
nồng độ so với trường hợp dùng 1 ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy,
trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.

9
Hình 2.1 Quy trình định lƣợng Coliforms và E. coli bằng phƣơng pháp MPN - Thực
hiên theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007)
❖ Các bước tiến hành thí nghiệm

Mẫu phân tích: trà sữa

Bước 1: Pha môi trường: (nếu là môi trường tổng hợp thì cân số lượng hóa chất
theo nhà sản xuất ghi trên bao bì, thông thường sẽ là khối lượng/1lit môi trường. Lưu ý:
tính khối lượng hóa chất cần dùng tương ứng với tổng thể tích môi trường cần pha)

10
 Tổng
Tên môi trường Thành phần Ghi chú
thể tích
Phân phối
cho mỗi tổ
SPW 500 ml
NaCl : 42,5 g 27ml SPW (9
(Saline Pepton nước
Pepton: 5 g ml/ống
Water) cất
nghiệm) trước
khi khử trùng.
Tryptose: 20 g 1000 ml Phân phối 90
Lactose: 5 g nước ml LSB cho
LSB
Sodium chloride: 5 g cất mỗi tổ
(Lauryl Sulphate
KH2PO4: 2,75 g (10ml/ống
Broth)
K2HPO4: 2,75 g pH 6,8 ± nghiệm) trước
Lauryl sulphate: 0,1 g 0,2 khi khử trùng.
BGBL 1000 ml
Peptone: 10 g ,
(Brilliant nước
Lactose: 10 g
Green Bile cất
Mật bò: 20 g
Broth
Brilliant green: 0,0133 g
Lactose) pH 7,4

Phân phối 90
Trypticase or tryptose: 20 g ml BGBL cho
1000ml
Muối mật No.3: 1,5 g mỗi tổ (10
EC nước
Lactose: 5 g ml/ ống
(E. coli cất
KH2PO4: 1,5 g nghiệm có
medium)
K2HPO4: 4 g chứa ống
pH 6,9
NaCl: 5 g Durham)
trước khi khử

11
 trùng

Pancreatic digest of gelatin: 10

1000 ml
EMB g
nước Phân phối
(Eosin Lactose: 10 g
cất. 100 ml EMB
Methylene K2HPO4: 2 g
cho mỗi tổ
Blue Eosin Y: 0,4 g
pH 7,1 (20 ml/petri)
Agar) Methylene blue: 65 mg
± 0,2
Agar: 15g
1000 ml
Mỗi tổ chỉ
nước
dùng 20 ml,
Tryptone cất
Tryptone hoặc trypticase:10g phân phối 10
water
ml/ống
pH 7.2
nghiệm.
± 0.2
Môi trường 1:
Mỗi tổ chỉ
Buffered peptone-water
dùng 30 ml,
powder: 7 g
1000 ml phân phối 10
Glucose: 5 g
nước ml/ống
MR-VP K2HPO4: 5 g
cất. nghiệm.
(Glucose Both Môi trường 2:
Kiểm tra lại
Phosphate) Casein Pancreatic Digest: 3,5 g
pH 6,9 môi trường
Peptic digest of animal tissue:
± 0,2 cung cấp nào
3,5g
để pha môi
Dextrose: 5 g
trường.
Potassium phosphate: 5 g

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân
phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15
phút.
Bước 3: pha loãng mẫu

12
 Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 37°C, 48 giờ.
Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli
Định lượng Coliform Định lượng E. coli

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Dùng micropipet hút 10µl dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa
canh BGBL và ủ ở 37°C ± 1°C, 48 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với
mỗi độ pha loãng
Dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang môi trường canh
EC, ủ ở 44,5°C, 24 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với
mỗi độ pha loãng

Tính kết quả (xem muc 1.4)
Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống
(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa
EMB. Ủ ở 37°C, 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1 mm
(tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)
(xem hình 2), cấy vào Trypton, MR-VP, SC
Citrate, ủ ở 44,5°C, 24 giờ

Bước 6: thử nghiệm IMViC

- Thử nghiệm Indol (I):
- Thử nghiệm Methyl Red (MR):
- Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP):
- Thử nghiệm Citrate (iC)
1.1. Xử lý số liệu
Tra bảng Mac Crady, bảng chỉ số MPN và giới hạn tin cậy (95%) khi sử dụng
ba phần mẫu thử 1g (ml), ba phần mẫu thử 0,01 g (ml).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
2. Kết quả
2.1.1 Cấy mẫu vào canh LSB

13
 Định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN, ghi nhận số ống nghiệm
có chuyển đục hoặc sinh hơi là ống nghiệm dương tính.

Hình 2.2 Cấy mẫu vào canh LSB, mỗi nồng độ -

có 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC sau 48 giờ. Vi sinh vật

tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau

Bảng 2.1 Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính của môi trường LBS

Độ pha
loãng 10 - 1 10 - 2 10 - 3
Lần lặp lại
1 + + -
2 + + -
3 + + -

2.1.2 Định lượng Coliform và E. coli

Ghi nhận số ống nghiệm có chuyển đục hoặc sinh hơi là ống nghiệm dương tính.

14
 Bảng 2.2 Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính của môi trường BGBL
Độ pha
loãng 10-1 10-2
Lần lặp lại
1 + +
2 + +
3 + +

Tra bảng Mac Crary cho thấy số lượng ống nghiệm dương tính với 2 nồng độ pha

Hình 2.3 Cấy mẫu vào canh BGBL, mỗi nồng

độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC sau 48 giờ. Vi sinh
vật tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau

loãng liên tiếp là 10-1 và 10-2 . Nên mật độ Coliform là: 24 x 10 = 240 MPN/100ml
Bảng 2.3 Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính của môi trường EC
Độ pha
loãng 10-1 10-2
Lần lặp lại
1 + +
2 + +
3 + +

15
 Hình 2.4 Cấy mẫu vào canh EC, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở
44,5oC sau 24 giờ. Vi sinh vật tăng sinh ở 2 nồng độ khác nhau

2.2. Thảo luận

Theo Hình 2.2, ta thấy ở nồng độ pha loãng 10-1 và 10-2 cho kết quả dương tính
có cho dấu hiệu nhận biết là làm cho nước môi trường LSB trở nên đục lại. Vì vi sinh
vật lấy dinh dưỡng từ môi trường LSB để tăng sinh. Ở nồng độ 10-3 cả 3 lần lặp lại đều
cho kết quả âm tính có thể do ở nồng độ pha loãng này có mật độ vi sinh vật quá thấp
để vi sinh vật tăng sinh trong thời gian ngắn
Theo Hình 2.3, ta thấy ở nồng độ pha loãng 10-1 và 10-2 cho kết quả dương tính
có cho dấu hiệu nhận biết là làm cho nước môi trường BGBL trở nên đục lại. Điều đó
chứng tỏ trong ống nghiệm có sự xuất hiện của Coliforms.
Theo Hình 2.4, ta thấy ở nồng độ pha loãng 10-1 và 10-2 cho kết quả dương tính
có cho dấu hiệu nhận biết là làm cho nước môi trường EC trở nên đục lại. Điều đó nghi
ngờ trong ống nghiệm có thể có sự xuất hiện của E.coli.
Điều đó cho thấy vi sinh vật trong môi trường EC có thể không phải E. coli.
Hoặc trong quá trình thao tác cấy ria trên môi trường đĩa thạch EMB dụng cụ cấy bị
nhiễm vi sinh vật khác.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

16
4.1. Kết luận
Sau quá trình thực hiện nghiên cứu định lượng Coliforms và E. coli bằng phương
pháp MPN, kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy trong mẫu trà sữa có sự xuất hiện của
Coliforms và vi sinh vật khác.
4.2. Đề nghị
Những nghiên cứu tiếp theo về định lượng Coliforms và E. coli bằng phương
pháp MPN, cần cẩn thận trong thao tác thực hiện thí nghiệm như chuẩn bị mẫu, môi
trường, kỹ thuật cấy để có thể cho được kết quả mong muốn nhất, tránh sai số trong quá
trình tính toán.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy được độ an toàn thực phẩm của trà sữa trên thị
trường hiện nay, từ đó chú ý an toàn vệ sinh thực phẩm trong quá trình chế biến trà sữa.

BÀI 3: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động
không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách
nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S.
Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng
sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số
lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi
khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng
trưởng của Salmonella.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Quy trình thực hiện định tính Salmonella trong thực phẩm

17
Bước 1: Tăng sinh

Hình 3.1. 10 g mẫu gan heo Hình 3.2. Mẫu trong môi trường BPW
Tiến hành cân 10 g mẫu (gan heo) trong 90 ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 370C,
18 – 24 giờ.

Bước 2: Tăng sinh chọc lọc

Hình 3.3. 0,1 ml dịch tăng sinh trong RVS

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh
RVS, ủ 420C, 18 – 24 giờ.

18
Bước 3: Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy (cấy ria) phân lập khuẩn lạc đơn với giống
từ dịch tăng sinh chọn lọc lên các đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho
Salmonella là XLD và HE, ủ ở 370C, 18 – 24 giờ.

- Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:

+ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một
số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
+ Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh
lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn
có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.

Kết quả: Thu được từ đĩa petri trong môi trường XLD và HE

Hình 3.4. Khuẩn lạc trong môi trường XLD

19
Môi trường XLD: Ta thấy có sự xuất hiện của khuẩn lạc nhưng không phát hiện khuẩn
lạc đặc trưng cho Salmonella (khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm
đen).

Hình 3.5. Khuẩn lạc trong môi trường HE

Môi trường HE: Ta thấy có sự xuất hiện của khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ là
Salmonella (khuẩn lạc màu xanh, có tâm đen). Nên các khuẩn lạc này được sử dụng
cho các thử nghiệm sinh hoá.
Bước 4: Khẳng định
Chọn và cấy các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ là Salmonella trong môi trường HE vào
các thử nghiệm sinh hoá ra kết quả Indol (-), Urea (-), VP (-), KIA (+) thì khuẩn lạc đó
là Salmonella.

20
Kết quả thử nghiệm sinh hoá Indol, Urea, VP, KIA

Hình 3.6. Kết quả thử nghiệm sinh hoá

Thử nghiệm Indol: Nhỏ 10 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài
phút. Phản ứng (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường, phản ứng (-) xuất
hiện lớp màu vàng của thuốc thử.
Kết quả: (+) xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Thử nghiệm Urea: Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi
trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Kết quả: (-) môi trường không chuyển qua màu hồng mà vẫn giữ nguyên màu vàng
cam.
Thử nghiệm VP: Thuốc thử gồm dung dịch 5% α-naphthol và 40% KOH. Trước tiên
nhỏ 10 giọt dung dịch 5% α-naphthol, sau đó nhỏ 6 giọt dung dịch 40% KOH. Phản
ứng (-) với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên môi trường. Thử nghiệm
VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Kết quả: (-) hiện tượng không đổi màu trên môi trường.
Thử nghiệm KIA: Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng
các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.

21
+ Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose.
Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có
màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18 – 24 giờ.
+ Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện
các vệt màu đen trong môi trường này.
Kết quả: Thử nghiệm KIA (-) không sinh khí H2S và màu môi trường không thể xác
định được là Salmonella.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối với môi trường XLD:
Kết quả cho thấy không có sự xuất hiện của khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella (khuẩn
lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen) có thể là do không phù hợp với
môi trường XLD nên khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella không mọc hoặc quá trình
cấy người thao tác chưa có nhiều kinh nghiệm, khi thao tác bằng que cấy có thể lấy
quá ít mẫu hay thao tác cấy ria chưa chính xác.
3.2. Đối với môi trường HE:
Kết quả cho thấy có sự xuất hiện của khuẩn lạc đặc trưng, nghi ngờ là Salmonella
(khuẩn lạc màu xanh, có tâm đen), nên các khẩu lạc này được đem đi thử nghiệm sinh
hoá nếu ra kết quả Indol (-), Urea (-), VP (-), KIA (+) sinh khí H2S thì khuẩn lạc đó là
Salmonella nhưng theo như kết quả thử nghiệm đã thực hiện ở trên thì Indol (+), Urea
(-), VP (-), KIA (-) không sinh khí H2S nên không thể hiện được đó là Salmonella có
thể do lúc thao tác chưa cẩn thận, que cấy còn nóng hay lấy không đủ khuẩn lạc hoặc
thao tác cấy còn sai sót.

BÀI 4-5: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

VÀ TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn hiếu khí là nhóm vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện
có sự hiện diện của oxi, tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu thể hiện chỉ thị
mức độ vệ sinh của mẫu thực phẩm.

22
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những
tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn
ty giả (các tế bào kết nhau thanh chuỗi). Sự xuất hiện của nấm men, nấm mốc trong
thực phẩm có thể làm thực phẩm đổi màu, có mùi vị lạ hoặc thay đổi cơ cấu thực phẩm.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Quy trình làm việc:
2.2.1. Đồng nhất và pha loãng mẫu:

Cho 10g mẫu (cá khô) vào nước hấp sau đó lắc 10p. Sau khi lắc sẽ tiến hành
pha loãng mẫu ở các độ pha loãng 10-1 , 10-2, 10-3 ,…

Hình 4.1. 10g mẫu cá khô

2.2.2. Trang mẫu trên đĩa thạch:

Cho 0.1ml mẫu pha loãng vào các đĩa thạch (mỗi nồng độ 2 đĩa) với 2 môi
trường đĩa thạch:
-PCA ủ trong 30oC trong 24-48h.
-DRBC ủ trong 25oC trong 3-5 ngày.
2.2.3. Đọc và tính kết quả:

Theo tiêu chuẩn đếm khuẩn lạc của “Tài liệu thực hành kiểm nghiệm vi sinh
thực phẩm”, số khuẩn lạc được chấp nhận trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc.

23
 Trên PCA: Đĩa có thể đếm được trên độ pha loang 10-4 (các độ pha loãng nhỏ
hơn có số khuẩn lạc vượt quá ngưỡng chỉ tiêu nên sẽ không được đề cập tới).

Hình 4.2. Khuẩn lạc ở đĩa thứ 1 Hình 4.3. Khuẩn lạc ở đĩa thứ 2
Ở đĩa thứ 1 đếm được 207 khuẩn lạc, ở đĩa thứ 2 đếm được 115 khuẩn lạc. Áp
dụng công thức tính số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí và nấm nem-nấm mốc:
𝑁
𝐴=
𝑛1 × 𝑉 × 𝑓1 + ⋯ + 𝑛𝑖 × 𝑉 × 𝑓𝑖
Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men)
trong 1g hoặc 1ml mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng.
 Kết quả thực tế:

207 + 115
𝐴= = 1.61 × 107
2 × 0.1 × 10−4
Kết luận mẫu chứa 1.61×107 CFU/g

24
 Trên DRBC: Không thấy sự xuất hiện của khuẩn lạc nấm men, nấm mốc trên
đĩa nuôi cấy ở tất cả các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

Hình 4.4. Ở độ pha loãng 10-1. Hình 4.5. Ở độ pha loãng 10-2.

Hình 4.6. Ở độ pha loãng 10-3.

 Kết luận mẫu có thể không chứa nấm men, nấm mốc.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Môi trường PCA
Môi trường PCA nuôi cấy tổng vi sinh vật hiếu khí thấy được có sự chênh lệch lớn số
khuẩn lạc (115 và 207) giữa 2 đĩa nuôi cấy ở cùng nồng độ pha loãng 10-4, điều này
cho thấy có thể thao tác nuôi cấy chưa chuẩn (như đồng nhất mẫu không đều, que cấy
còn quá nóng,…). Kết quả 1.61x107 cũng cho thấy mẫu không đạt yêu cầu về vệ sinh
an toàn thực phẩm (theo QCVN 8-3:2012/BYT).

25
3.2. Môi trường DRBC
Môi trường DRBC nuôi cấy tổng nấm men, nấm mốc không phát hiện khuẩn
lạc ở tất cả các nồng độ, có thể do mẫu không chứa bào tử nấm men, nấm mốc
hoặc có thể do thao tác thực hiện nuôi cấy chưa chuẩn.

26